PRACE POGL DOWE Anna BURDZIÑSKA Leszek P CZEK Miogenne komórki macierzyste nowy materia³ do wstrzykniêæ oko³ocewkowych w leczeniu nietrzymania moczu Myogenic stem cells the new material for periurethral injections in the treatment of urinary incontinence Klinika Immunologii, Transplantologii i Chorób Wewnêtrznych Akademii Medycznej w Warszawie, Kierownik: Prof. dr hab. med. Leszek P¹czek Dodatkowe s³owa kluczowe: miêœniowe komórki macierzyste przeszczepy komórkowe wstrzykniêcia oko³ocewkowe nietrzymanie moczu Additional key words: muscle stem cells cellular transplantation periurethral injections urinary incontinence Wykaz skrótów: MDCs - komórki pochodz¹ce z miêœni, hmdcs - ludzkie komórki pochodz¹ce z miêœni, MDSCs - komórki macierzyste pochodz¹ce z miêœni, MSCs - macierzyste komórki mezenchymalne, SCs - komórki satelitowe, AchR - receptor dla acetylocholiny, LPP - ciœnienie wyciekania moczu, UPP - profil ciœnienia cewkowego Nietrzymanie moczu jest obecnie uwa ane nie tylko za problem medyczny, ale tak e ekonomiczno-spo³eczny. Wstrzykniêcia oko³ocewkowe s¹ jedn¹ z metod leczenia, jednak dotychczas stosowane materia³y nie gwarantowa³y zadowalaj¹cej skutecznoœci. Od kilku lat prowadzone s¹ badania nad stosowaniem komórek miogennych jako nowego materia³u do wstrzykniêæ. Dowiedziono, e niezró - nicowane komórki miêœniowe mo na wyizolowaæ w liczbie wystarczaj¹cej do przeszczepu z niewielkiego fragmentu miêœnia szkieletowego. Komórki te, po wstrzykniêciu do zwieracza cewki prze ywaj¹ i ró nicuj¹ siê we w³ókna miêœniowe. Istniej¹ przes³anki, e komórki miêœniowe po transplantacji mog¹ zostaæ unerwione. Badania czynnoœciowe wykaza³y, e przeszczep komórkowy poprawia kurczliwoœæ zwieracza i zwiêksza zamkniêcie cewki moczowej. W pierwszych próbach klinicznych, gdzie efekt zabiegu oceniano po roku, 79% pacjentek uznano za wyleczone. Oprócz komórek pochodz¹cych z miêœni rozwa a siê te wykorzystanie mezenchymalnych komórek szpiku, a tak e komórek wysianych na rusztowania biologiczne. Urinary incontinence is currently considered to be not only medical, but also socio-economical problem. Periurethral injections are one of the treatment method, although substances used so far have been not effective enough. For last several years surveys are conducted for using myogenic cells as a new material for periurethral injections. It has been proven that undifferentiated muscle cells can be isolated in the amount sufficient for transplantation from small piece of skeletal muscle tissue. Myogenic cells survive and differentiate into muscle fibers when transplanted in the urethral sphincter. Indirect evidences suggest that injected cells can become innervated. Functional studies revealed that cellular transfer improve sphincter contractility and increase leak point pressure. In first clinical study in human medicine, where the effect was evaluated one year after surgery, 79% of patients was judged as cured. Apart from cells derived from muscle, also bone marrow-derived mesenchymal stem cells and cells seeded on biological scaffolds are considered for using in treatment of urinary incontinence. Adres do korespondencji: Dr n. wet. Anna Burdziñska Klinika Immunologii, Transplantologii i Chorób Wewnêtrznych Akademii Medycznej 02-006 Warszawa, ul. Nowogrodzka 59 e-mail: aniaburdzia@interia.pl Tel.: 22 502 10 63, Fax: 22 502 21 27 Wprowadzenie Nietrzymanie moczu to dzisiaj jeden z najbardziej powszechnych problemów medycznych. Liczne badania epidemiologiczne wskazuj¹, e wystêpowanie nietrzymania moczu u kobiet w œrednim wieku (ok. 40-60 lat) oscyluje wokó³ 25-30% [11,16,17]. Wyniki te s¹ podobne w ró nych regionach œwiata cytowane badania by³y przeprowadzane w Szwecji, Turcji i Korei. Czêstoœæ zachorowañ wzrasta wraz z wiekiem, jednak nawet wœród m³odych kobiet (18-30 lat) epizody nietrzymania moczu zdarzaj¹ siê u 12% badanych [11]. G³ównymi czynnikami predysponuj¹cymi s¹ okres oko³o- i pomenopauzalny, przebyte ci¹ e, porody waginalne, hysterectomia lub inne zabiegi uroginekologiczne. W zwi¹zku ze starzeniem siê spo³eczeñstw, a tak e brakiem ³atwych procedur terapeutycznych, koszty opieki i leczenia pacjentów z nietrzymaniem moczu s¹ bardzo wysokie. Jest to odczuwalne szczególnie w krajach wysokorozwiniêtych, gdzie oprócz d³ugoœci ycia, wzrasta jednoczeœnie œwiadomoœæ ludzi o mo liwoœciach leczenia tej dolegliwoœci. Przyk³adowo, w Stanach Zjednoczonych w 2001 wydano na ten cel 16,3 miliarda dolarów [35]. Bior¹c pod uwagê czêstoœæ wystêpowania, a tak e koszty zwi¹zane z postêpowaniem terapeutycznym, nietrzymanie moczu uwa a siê obecnie nie tylko za problem medyczny, ale tak- e spo³eczno-ekonomiczny. Dlatego, mimo licznych metod leczenia, wci¹ poszukuje siê nowych rozwi¹zañ terapeutycznych. W dobie dynamicznego rozwoju transplantologii komórkowej podejmowane s¹ próby wykorzystania przeszczepów komórek równie w urologii. Patogeneza wysi³kowego nietrzymania moczu, które jest najczêstsz¹ postaci¹ tej dolegliwoœci, jest w wielu przypadkach zwi¹zana z niewydolnoœci¹ miêœni zwieraczy cewki moczowej. Jed- 362 Przegl¹d Lekarski 2008 / 65 / 7-8 A. Burdziñska i wsp.
n¹ z koncepcji terapeutycznych u tych pacjentów jest stosowanie wstrzykniêæ oko³ocewkowych. Postêpowanie takie ma na celu zwiêkszenie objêtoœci os³abionej struktury i tym samym wzrost ciœnienia wewn¹trzcewkowego. Do wstrzykniêæ oko³ocewkowych u ywano na przestrzeni lat ró nych materia³ów np. pasta teflonowa, t³uszcz autologiczny, mikroimplanty silikonowe. Jednak- e, ka da z substancji mia³a powa ne wady np. migracja poza obszar podania, wywo³ywanie reakcji zapalnych, tendencja do wch³aniania siê lub rozpadu. Obecnie najczêœciej u ywanym materia³em do iniekcji oko³ocewkowych jest kolagen. Wstrzykniêcia maj¹ wa ne zalety: s¹ procedur¹ o bardzo niskiej inwazyjnoœci i nie powoduj¹ powik³añ (o ile materia³ nie jest immunogenny). Ujemn¹ stron¹ leczenia t¹ metod¹ przy u yciu dotychczasowych materia³ów jest stosunkowo niska skutecznoœæ 48% pacjentów trzyma mocz po zabiegu, a poprawa nastêpuje u 76%. Dla porównania po operacjach pêtlowych mocz trzyma oko³o 80% leczonych, a poprawa jest obserwowana u 90%. Nowym pomys³em jest u ywanie komórek, jako alternatywnej substancji do wstrzykiwañ oko³ocewkowych. Pobranie miêœniowych komórek macierzystych z doros³ego organizmu nie nastrêcza wiêkszych problemów, a zatem mo liwe jest wykonanie przeszczepu autologicznego. W³asne komórki pacjenta nie powinny byæ immunogenne. Wa ny dla powodzenia terapii jest równie fakt, e zwieracz cewki moczowej jest stosunkowo niewielk¹ struktur¹, a zatem liczba komórek potrzebnych do usprawnienia tego miêœnia powinna byæ mo liwa do namno enia in vitro. Dodatkowo, w³aœciwoœci kurczliwe i mo liwoœæ pe³nej integracji z w³óknami zwieracza daj¹ potencjaln¹ przewagê komórkom nad innymi dotychczas u ywanymi substancjami. Istnieje kilka populacji komórek macierzystych pochodz¹cych z doros³ego organizmu, które mog¹ siê ró nicowaæ we w³ókna miêœniowe i w zwi¹zku z tym s¹ rozwa ane jako potencjalny materia³ do wstrzykniêæ oko³ocewkowych. S¹ to komórki satelitowe (SCs ang. satellite cells), komórki macierzyste pochodz¹ce z miêœni (MDSCs ang. muscle-derived stem cells), a tak e komórki mezenchymalne (MSCs ang. mesenchymal stem cells) pochodz¹ce ze szpiku. Prze ywalnoœæ i ró nicowanie siê komórek po przeszczepie 1. Komórki satelitowe i mieszana populacja komórek pochodz¹cych z miêœni Najlepiej poznan¹ populacj¹ niezró nicowanych komórek w miêœniach szkieletowych s¹ komórki satelitowe. Przynale noœæ do tej grupy okreœla po³o enie miêdzy b³on¹ podstawn¹ w³ókna miêœniowego a sarkolemm¹. S¹ to komórki stosunkowo liczne i maj¹ce wysoki potencja³ proliferacyjny [7]. Dowiedziono, e nawet od starszych dawców mo na wyizolowaæ liczbê komórek wystarczaj¹c¹ do przeprowadzenia przeszczepu [1]. Ponadto, komórki te s¹ zdeterminowane do tworzenia tkanki miêœniowej, a zatem ryzyko ewentualnego nowotworzenia po przeszczepie jest niewielkie. Powy sze cechy komórek satelitowych decyduj¹ o tym, e s¹ one postrzegane jako dobry materia³ do regeneracji miêœni poprzez autologiczne transplantacje komórkowe. S¹ zatem równie rozwa ane jako potencjalny materia³ do wstrzykniêæ oko³ocewkowych w przypadkach nietrzymania moczu. Zewnêtrzny zwieracz cewki moczowej ma inne pochodzenie embrionalne ni miêœnie szkieletowe, ale równie posiada i jest regenerowany przez wewnêtrzn¹ populacjê komórek satelitowych. Co wiêcej, komórki te, tak samo jak komórki satelitowe miêœni szkieletowych, wykazuj¹ ekspresjê genu Pax7, a po aktywacji MyoD i Myf5 [38]. Wydaje siê zatem, e autologiczny przeszczep komórek satelitowych mo e byæ dok³adn¹ imitacj¹ naturalnego procesu regeneracji upoœledzonego zwieracza. Poniewa izolacja czystej populacji komórek satelitowych jest k³opotliwa, do badañ nad przeszczepami czêsto u ywa siê mieszanej populacji komórek pochodz¹cych z miêœni (MDCs ang. muscle-derived cells). Tworz¹ j¹ w przewa aj¹cej liczbie komórki miogenne komórki satelitowe i ich potomstwo nazywane mioblastami, a tak e inne populacje mniej zró nicowanych komórek macierzystych pochodz¹cych z miêœni. Jednak e, MDCs to pula zanieczyszczona w wiêkszym lub mniejszym stopniu komórkami tkanki ³¹cznej fibroblastami. Badania nad przeszczepami MDCs do zwieracza cewki moczowej na modelach zwierzêcych prowadzone s¹ w kilku oœrodkach na œwiecie, a pierwsze doniesienia na ten temat pojawi³y siê w 2000 r. [5]. Pierwsze próby polega³y na wstrzykiwaniu znakowanych mioblastów linii klonalnej do œciany pêcherza moczowego i cewki moczowej i stwierdzenia ich obecnoœci po e d Rycina 1 Uproszczony schemat autologicznej transplantacji komórek pochodz¹cych z miêœnia szkieletowego do zwieracza cewki moczowej. a) pobranie skrawka miêœnia, b) izolacja komórek, c) hodowla komórek w po ywce wzrostowej, d) identyfikacja komórek, analiza funkcjonalna, e) wstrzykniêcie zawiesiny komórek. A basic scheme of autologous transplantation of muscle-derived cells (MDCs) into urethral sphincter. a) muscle biopsy, b) MDCs isolation, c) propagation of cells by culturing in a growing medium, d) identification of cells, functional analysis, e) injection of cell suspension. a c kilku dniach [5]. Nastêpnie, rozpoczêto prace oceniaj¹ce prze ywalnoœæ przeszczepów komórek hodowli pierwotnych do zwieraczy cewki moczowej na modelach zwierzêcych w d³u szym okresie czasu. Badano transplantacje allogeniczne tzn. miêdzy ró nymi osobnikami tego samego gatunku [41], syngeniczne tzn. miêdzy osobnikami o takim samym lub bardzo zbli onym genotypie [28] i autologiczne [29,37,42]. Peyromaure i wsp. [28] wykazali obecnoœæ przeszczepionych komórek 90 dni po wstrzykniêciu, a Strasser i wsp. [29] i Yokoyama i wsp. [41] 70 dni po transplantacji. Dodatkowo, porównano prze ywalnoœæ komórek z trwa³oœci¹ kolagenu wstrzykniêtego w œcianê cewki moczowej [43]. Wykazano, e po miesi¹cu w œcianie cewki moczowej pozosta³o ponad 80% komórek i jedynie œladowe iloœci kolagenu. Jednak e, równie liczba znakowanych MDCs obecnych w miejscu wstrzykniêcia zmniejsza³a siê z czasem, co mo e œwiadczyæ o eliminacji przeszczepionych komórek. Oprócz prze ywalnoœci, oceniano te zdolnoœæ ró nicowania siê podanych MDCs w dojrza³e struktury tkanki miêœniowej. Peyromaure i wsp. [28] wstrzykuj¹c komórki znakowane fluorochromem GFP, po 30 i 90 dniach obserwowali w zwieraczu zewnêtrznym liczne w³ókna wykazuj¹ce fluorescencjê, co œwiadczy o wbudowywaniu przeszczepionych komórek w istniej¹ce w³ókna miêœniowe. Yiou i wsp. [37] wykazali obecnoœæ nowych w³ókien powsta³ych ze znakowanych komórek. Wyniki te dowodz¹, e przeszczepy MDCs mog¹ wspomóc regeneracjê poprzecznie pr¹ kowanego zwieracza cewki moczowej. Jednoczeœnie, w opisanych badaniach nie stwierdzono znakowanych komórek w obrêbie wewnêtrznego zwieracza, zbudowanego z w³ókien miêœni g³adkich. b Przegl¹d Lekarski 2008 / 65 / 7-8 363
a b c Rycina 2 Pierwotne kultury komórek miogennych izolowanych z miêœni szkieletowych. a) niezró nicowane (jednoj¹drzaste) komórki populacji MDCs, b, c) zró nicowane komórki populacji MDCs tworz¹ce wieloj¹drzaste miotuby. Primary muscle-derived cells. a) undifferentiated (mononuclear) MDCs, b), c) differentiated MDCs forming multinucleated myotubes. a b e mieszana populacja MDCs podana w takich samych warunkach potrafi utworzyæ wieloj¹drowe struktury. Ocena procesu zapalnego powsta³ego w wyniku transplantacji Rycina 3 Fragmenty przekrojów poprzecznych przez cewkê moczow¹ (model szczurzy). a) 14 dni po autologicznym przeszczepie komórek MDCs znakowanych ß-galaktozydaz¹ (barwienie X-Galem - kolor granatowy), b) kontrola negatywna. Cross sections through urethra (rat model), a) 14 days after autologous transplantation of MDCs transfected with ß- galactosidase (X-Gal staining - dark blue color), b) negative control. 2. Multipotencjalne komórki macierzyste miêœni Inn¹ koncepcj¹ jest przeszczepianie mniej zró nicowanych komórek macierzystych pochodz¹cych z miêœni, a nie mieszanej populacji MDCs. Obecnoœæ wspomnianych komórek wykryto w miêœniach pod koniec ubieg³ego wieku [2]. Jest to niewielka pula nazywana komórkami macierzystymi pochodz¹cymi z miêœni (MDSCs ang. muscle-derived stem cells). S¹ one uwa ane za komórki multipotencjalne, a zatem mniej zró nicowane ni klasyczne komórki satelitowe. Wykazano, e mog¹ ró nicowaæ siê zarówno w mioblasty, jak i osteoblasty, chondrocyty i adipocyty [34]. Lee i wsp. [22] zidentyfikowali je jako komórki sca-1+/cmet+/cd45-/c-kit-, choæ wci¹ trwaj¹ badania nad charakterystyk¹ i pochodzeniem tej populacji [15]. U ycie MDSCs zamiast MDCs do wstrzykniêæ oko³cewkowych bazuje na doniesieniach, które sugeruj¹, e populacja ta wykazuje wiêksz¹ prze ywalnoœæ po transplantacji ni MDCs [2]. Lee i wsp. [21] twierdz¹, e MDCs po wstrzykniêciu gwa³townie ró nicuj¹ siê w wieloj¹drowe struktury, natomiast MDSCs proliferuj¹ przed dokonaniem fuzji, co zwiêksza liczebnoœæ prze ywaj¹cych komórek. W badaniach nad przeszczepieniem allogenicznych MDSCs do œciany cewki moczowej stwierdzono obecnoœæ znakowanych komórek nawet 6 miesiêcy po transplantacji (biorcami by³y myszy z ciê kim niedoborem immunologicznym). Jednak równie w tym przypadku liczba znakowanych komórek mala³a z czasem (70 dni po przeszczepie, iloœæ markera w badanych strukturach stanowi³a 60% iloœci wykrytej 5 dni po wstrzykniêciu). W przeciwieñstwie do MDCs, MDSCs ró nicowa³y siê zarówno w miêœnie poprzecznie pr¹ kowane jak i miêœnie g³adkie [14]. Z drugiej jednak strony, Yiou i wsp. [40] wykazali, e populacja boczna (SP ang. side population) komórek macierzystych miêœni, która prawdopodobnie odpowiada populacji MDSCs, wstrzykniêta do nieodwracalnie uszkodzonego zwieracza jest niezdolna do ró nicowania siê we w³ókna miêœniowe. Ci sami badacze twierdz¹, Wiadomo, e znaczna czêœæ komórek miogennych umiera po transplantacji w wyniku reakcji zapalnej w miejscu wstrzykniêcia [10,32]. Przeszczepy allogeniczne przeprowadzone na kompetentnym immunologicznie dawcy w sposób oczywisty bêd¹ indukowa³y reakcjê zapaln¹. Jednak równie w przypadku transplantacji autologicznych mo liwe jest powstanie odczynu zapalnego w wyniku lokalnego urazu spowodowanego wstrzykniêciem lub, w przypadkach prac eksperymentalnych, obecnoœci¹ genu markerowego w przeszczepianych komórkach. Dlatego, w prognozowaniu powodzenia transplantacji, wa ny jest stopieñ natê enia stanu zapalnego wokó³ miejsca przeszczepu. W przypadku przeszczepu syngenicznego stwierdzono liczne komórki nacieku zapalnego w œcianie cewki moczowej 7 dni po transplantacji, natomiast 3 dni póÿniej komórki te nie by³y ju obecne [28]. Po przeprowadzeniu przeszczepu autologicznego, nie stwierdzono w okolicy wstrzykniêcia limfocytów CD4+, CD8+ [42]. Obserwacja ta by³a zgodna z oczekiwaniami, poniewa przeszczep autologiczny nie powinien indukowaæ swoistej reakcji zapalnej. Niestety jednak, nie zbadano jednoczeœnie obecnoœci makrofagów i neutrofili. Ciekawych obserwacji dokona³a grupa z Pittsburgha. Porównali naciek limfocytów CD4+, CD8+ 14 dni po wstrzykniêciu allogenicznych MDCs i MDSCs w œcianê cewki moczowej. Podanie mieszanej populacji komórek wywo³a³o siln¹ aktywacjê limfocytów w przeciwieñstwie do czystej populacji MDSCs, wokó³ której stwierdzono jedynie nieliczne komórki CD4+, natomiast limfocytów CD8+ nie obserwowano wcale [4,21]. Wyniki te sugeruj¹, e komórki macierzyste pochodz¹ce z miêœni s¹ mniej immunogenne ni bardziej zró nicowana populacja MDCs. Mo e to sprzyjaæ wiêkszej prze ywalnoœci MDSCs, jednak tylko w przypadkach przeszczepów allogenicznych. 364 Przegl¹d Lekarski 2008 / 65 / 7-8 A. Burdziñska i wsp.
Problem unerwienia przeszczepionych komórek Kolejnym, bardzo istotnym zagadnieniem warunkuj¹cym skutecznoœæ transplantacji jest pytanie czy wstrzykniête komórki mog¹ zostaæ unerwione. Dotychczas, niewiele wiadomo na ten temat, jednak badania przeprowadzone przez Yiou i wsp. [38] sugeruj¹, e jest to mo liwe. Wykazali oni ekspresjê receptora dla acetylocholiny (AchR) w czêœci znakowanych komórek po przeszczepie. Dowodz¹ tak e, e 30 dni po wstrzykniêciu, niektóre receptory dla acetylocholiny w znakowanych miotubach znajdowa³y siê w bezpoœrednim s¹siedztwie zakoñczeñ nerwowych, co wskazuje na istnienie jednostek motorycznych w sensie anatomicznym. Nie wiadomo jednak, czy by³y to jednostki funkcjonalne. Podobnych obserwacji dokonali Huard i wsp. [14]. W badaniu immunohistochemicznym 15 dni po transplantacji MDSCs widoczna by³a obecnoœæ AchR w nowopowsta³ych miotubach. Ponadto, w czêœci z nich, ekspresja by³a skoncentrowana przy b³onie cytoplazmatycznej, co sugeruje tworzenie p³ytki motorycznej. Poprawa funkcjonalna po przeszczepie Najwa niejsz¹ kwesti¹ z klinicznego punktu widzenia pozostaje potencjalna skutecznoœæ przeszczepu. Czy wstrzykniête MDCs mog¹ usprawniæ zwieracz cewki moczowej i tym samym przyczyniæ siê do wiêkszej kontroli nad mikcj¹ u pacjentów z nietrzymaniem moczu? Wstêpne badania prowadzono na modelach zwierzêcych, gdzie wywo³ywano eksperymentalnie nietrzymanie moczu i oceniano poprawê po transplantacji komórek. Indukowanie nietrzymania moczu polega³o na wysokim odnerwieniu poprzez przeciêcie nerwu kulszowego powy ej odga³êzienia nerwu sromowego [4] lub bezpoœrednim uszkodzeniu zwieracza cewki przez wymra anie [14], elektrokoagulacje [39] lub ostrzykiwanie noteksyn¹ [37]. Skutecznoœæ przeszczepu komórkowego by³a oceniana poprzez mierzenie profilu ciœnienia cewkowego (UPP ang. urethral pressure profile), ciœnienia wyciekania moczu (LPP, ang. leak point pressure) [6,21,25] lub pozaustrojowe badanie kurczliwoœci fragmentów miêœnia zwieracza cewki moczowej lub wypieracza pêcherza [4,14]. Wzrost kurczliwoœci wyizolowanych miêœni stwierdzono ju po 7 i 14 dniach po wstrzykniêciu komórek [4,14], natomiast zwiêkszenie LPP by³o obserwowane po 30 dniach [14, 40]. Chermansky i wsp. [6] wykazali, e LPP ros³o stopniowo po przeprowadzeniu transplantacji u odnerwionych szczurów. Szeœæ tygodni po przeszczepie LPP by³o równe wartoœciom kontrolnym (grupa bez odnerwienia i transplantacji) i dwukrotnie wy sze ni w grupie odnerwionej bez transplantacji. Mitterberger i wsp. [26] badali wp³yw transplantacji na profil ciœnienia cewkowego w zale noœci od liczby wstrzykniêtych komórek [od 1,5 x 10 6 do 7,8 x 10 7 komórek]. Badanie przeprowadzano na œwiniach z nieuszkodzonym zwieraczem. Stwierdzono, e wzrost ciœnienia w cewce jest skorelowany dodatnio z liczb¹ podanych komórek. Najwy sze wartoœci ciœnienia uzyskane po przeprowadzeniu transplantacji by³y ponad trzykrotnie wy sze od wartoœci kontrolnych. Jednak e, wyniki te by³y uzyskane na pojedynczych zwierzêtach, dlatego z pewnoœci¹ wymagaj¹ potwierdzenia. Ciekawy eksperyment porównawczy przeprowadzili Kwon i wsp. [20]. Badali ró - nice w efektach transplantacji MDCs, fibroblastów i mieszaniny obu populacji komórek. Oceniali zarówno kurczliwoœæ miêœni, jak i ciœnienie wyciekania moczu po przeszczepie do odnerwionych zwieraczy. Cztery tygodnie po odnerwieniu i wstrzykniêciu komórek LPP wzros³o istotnie w porównaniu do grupy odnerwionej bez przeszczepu i wzrost ten by³ zale ny od liczby przeszczepionych komórek. Nie stwierdzono jednak ró nic miêdzy grup¹, w której podano MDCs, a t¹ gdzie wstrzykniêto fibroblasty. Z kolei w badaniu kurczliwoœci miêœni, zgodnie z przewidywaniami, poprawê zaobserwowano jedynie w grupie MDCs. Ponadto, w grupie gdzie podano najwiêksz¹ liczbê fibroblastów stwierdzono przypadek zatrzymania moczu. Podobna sytuacja nie wyst¹pi³a w analogicznej grupie z MDCs. Testowano równie, czy ludzkie komórki miogenne mog¹ w podobny sposób usprawniæ zwieracz. Wstrzykniêto hmdcs (ang. human muscle-derived cells) szczurom, które poddano wczeœniej odnerwieniu i po 4 tygodniach mierzono LPP. Stwierdzono istotny wzrost ciœnienia wyciekania moczu u szczurów po transplantacji w stosunku do odnerwionej grupy kontrolnej. Wyniki badañ na modelach zwierzêcych dowiod³y, e miogenne komórki wstrzykniête do miêœnia zwieracza cewki mog¹ w pewnym stopniu usprawniaæ jego dzia³anie. Ciê ko jednak prognozowaæ na tej podstawie skutecznoœæ takich zabiegów u ludzi, poniewa adna z technik doœwiadczalnego wywo³ywania nietrzymania moczu nie odpowiada patogenezie wysi³kowego nietrzymania moczu u kobiet, ani nietrzymania moczu po prostatektomii u mê czyzn. Próby kliniczne W zwi¹zku z obiecuj¹cymi wynikami badañ na zwierzêtach, austriacka grupa pod kierownictwem Strassera zdecydowa³a siê na przeprowadzenie prób klinicznych u ludzi. Komórki miogenne izolowano z bioptatu miêœnia szkieletowego (ok. 0,5 cm 3 ). Dodatkowo, uzyskiwano tak e autologiczne fibroblasty z tkanki ³¹cznej. Komórki hodowano w po ywce z dodatkiem autologicznej surowicy. Wstrzykniêæ dokonywano od strony œwiat³a cewki moczowej pod kontrol¹ USG. MDCs podawano do zwieracza zewnêtrznego, natomiast zawieszone w kolagenie fibroblasty wstrzykiwano pod b³onê œluzow¹ cewki. Ocena skutecznoœci przeszczepu obejmowa³a kwestionariusz, test podpaskowy, pomiar kurczliwoœci zwieracza za pomoc¹ aparatu przezcewkowego, badanie urodynamiczne i badanie ultrasonograficzne cewki i zwieracza. Pierwsze doniesienie, dotycz¹ce piêciu kobiet, opublikowano w 2004 r. [30]. W bie ¹cym roku pojawi³y siê prace opisuj¹ce efekty przeszczepów po roku (123 osoby) [24] i po dwóch latach (20 osób) [25]. Zabiegowi poddawano kobiety z wysi³kowym nietrzymaniem moczu w wieku 36-84 lat. Rok po transplantacji 79% pacjentek mia³o pe³n¹ kontrolê nad mikcj¹, u 16% stwierdzono wyraÿn¹ poprawê i u 9% lekk¹ poprawê. Spoœród 20 kobiet badanych 2 lata po zabiegu, 16 okreœlono jako wyleczone. Dodatkowo, Strasser i wsp. przeprowadzili badanie randomizowane porównuj¹ce efekty wstrzykniêæ komórek (MDCs i fibroblasty) i standardowo stosowanego kolagenu [31]. Próbie poddano 63 pacjentki u 42 wykonano autologiczny przeszczep komórkowy, u 21 tradycyjne wstrzykniêcie oko³ocewkowe kolagenu. Oceny skutecznoœci dokonywano po 12 miesi¹cach. Spoœród 42 kobiet z grupy z przeszczepem, 38 w pe³ni kontrolowa³o mikcjê, natomiast w grupie z kolagenem taki sam efekt uzyskano tylko u 2 z 21 pacjentek. U kobiet leczonych komórkami stwierdzono wiêksz¹ gruboœæ i kurczliwoœæ zwieracza, a tak e lepsze parametry urodynamiczne w porównaniu do pacjentek leczonych kolagenem. U adnej z pacjentek nie stwierdzono efektów ubocznych terapii. Powy sze wyniki s¹ bardzo obiecuj¹ce, jednak nie mo na zapominaæ, e dotychczas uzyskano je tylko w jednym oœrodku leczniczym. Konieczne jest zatem potwierdzenie tych doniesieñ przez innych badaczy i na wiêkszej liczbie pacjentów. Komórki mezenchymalne ród³em miogennych komórek macierzystych mo e byæ równie szpik kostny. Zawiera on populacjê macierzystych komórek mezenchymalnych (MSCs ang. mesenchymal stem cells), które s¹ uznawane za multipotencjalne [18]. Oznacza to, e komórki takie mog¹ siê ró nicowaæ siê we wszystkie tkanki pochodz¹ce z jednego (w tym przypadku mezodermalnego) listka zarodkowego. Rzeczywiœcie, dowiedziono, e z MSCs mo na uzyskaæ komórki kostne, chrzêstne, t³uszczowe [12], a tak e komórki miêœni szkieletowych [9], miêœnia sercowego [36] i miêœni g³adkich [13]. atwoœæ pobrania szpiku kostnego i mo liwoœæ ró - nicowania siê komórek mezenchymalnych w komórki miêœniowe czyni z nich potencjalnego kandydata na materia³ do przeszczepu w przypadkach nietrzymania moczu. Jednak e, wci¹ istnieje wiele kontrowersji wokó³ miogennego potencja³u MSCs. Czêœæ badaczy dowodzi, e ca³a populacja komórek mezenchymalnych, przy odpowiednim traktowaniu, mo e ró nicowaæ siê w komórki miêœniowe [9], natomiast inne publikacje wskazuj¹, e jedynie niewielki odsetek komórek zlokalizowanych w szpiku ma potencja³ miogenny [3,8]. Wyniki doœwiadczeñ Nassiri i wsp. [27] sugeruj¹, e transplantacje niezró nicowanych komórek mezenchymalnych mo e byæ równie skuteczne jak tych, poddanych indukcji ró nicowania in vitro, jednak z drugiej strony, im bardziej niezró nicowane s¹ przeszczepiane komórki, tym wiêksze jest ryzyko ewentualnych zmian prowadz¹cych do transformacji nowotworowej [19]. Rusztowania biologiczne Przegl¹d Lekarski 2008 / 65 / 7-8 365
W medycynie regeneracyjnej, obok transplantacji komórkowych, równie dynamicznie rozwija siê inna nowa dziedzina wszczepianie biomateria³ów. Po³¹czeniem tych dwóch ga³êzi badañ jest tworzenie biologicznych rusztowañ, jako pod³o y do hodowli komórek. Mo liwe, e takie struktury bêd¹ alternatyw¹ równie w leczeniu nietrzymania moczu. Pierwsze badanie w tym kierunku przeprowadzi³a grupa z Pittsburgha [23]. Badacze ci wysiewali MDSCs na rusztowanie wykonane z podœluzówki jelita cienkiego. Po oœmiu tygodniach wykazano obecnoœæ znakowanych komórek, które uleg³y ró nicowaniu w wieloj¹drowe struktury i kurczy³y siê spontanicznie. Podsumowanie Wyniki dotychczasowych badañ wskazuj¹, e przeszczepy komórek miogennych do zwieracza cewki moczowej mog¹ byæ now¹ alternatyw¹ w leczeniu nietrzymania moczu. Badania na zwierzêtach dowodz¹, e komórki takie mog¹ byæ stosunkowo ³atwo izolowane, a wstrzykniête do zwieracza prze ywaj¹ i ró nicuj¹ siê we w³ókna miêœniowe. Wstêpne próby kliniczne potwierdzaj¹, e transplantacje takie mog¹ prowadziæ do lepszej kontroli nad mikcj¹ u pacjentów z nietrzymaniem moczu. Ponadto, nie wykazano adnych niepo ¹danych efektów po przeprowadzeniu zabiegu. Jednak e, stosowanie miogennych komórek macierzystych w leczeniu nietrzymania moczu wci¹ boryka siê z wieloma problemami. Nie ustalono dotychczas jednoznacznie jaka populacja komórek jest najlepszym materia³em do wstrzykniêæ oko³ocewkowych. MDSCs prawdopodobnie lepiej prze ywaj¹ po transplantacji, jednak jest to pula bardzo nieliczna, co utrudnia przeprowadzenie przeszczepu autologicznego. Ponadto, s¹ to komórki o niejasnym pochodzeniu i niepe³nej charakterystyce, a ich multipotencja sprzyja ryzyku nowotworzenia po transplantacji. Z kolei MDCs lub komórki satelitowe szybko siê ró nicuj¹, co nie pozwala na zwiêkszenie liczebnoœci po wstrzykniêciu. Co do komórek mezenchymalnych pochodz¹cych ze szpiku kostnego nie przeprowadzono dotychczas wystarczaj¹cej iloœci badañ, aby mo na by³o oceniæ ich przydatnoœæ do wstrzykniêæ oko³ocewkowych. Kolejn¹ przeszkod¹ w badaniu skutecznoœci przeszczepów komórkowych do cewki moczowej jest brak modelu zwierzêcego odzwierciedlaj¹cego rzeczywiste przyczyny nietrzymania moczu u ludzi. Dodatkowo, wci¹ konieczne s¹ dalsze badania nad unerwieniem wstrzykniêtych komórek, a tak- e nad ich ochron¹ przed eliminacj¹ w miejscu podania. W Polsce, prace badawcze maj¹ce na celu wprowadzenie metody autologicznych przeszczepów komórek miogennych w leczeniu pacjentów z nietrzymaniem moczu podjêto w Klinice Immunologii, Transplantologii i Chorób Wewnêtrznych WUM we wspó³pracy z Klinik¹ Urologii WUM i Wydzia³em Nauk Medycznych UWM. Piœmiennictwo 1. Baj A., Bettaccini A.A., Casalone R. et al.: Culture of skeletal myoblasts from human donors aged over 40 years: dynamics of cell growth and expression of differentiation markers. J. Transl. Med. 2005, 3, 21. 2. Beauchamp J.R., Morgan J.E., Pagel C.N. et al.: Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J. Cell Biol. 1999, 144, 1113. 3. Bhagavati S., Xu W.: Isolation and enrichment of skeletal muscle progenitor cells from mouse bone marrow. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 318, 119. 4. Cannon T.W., Lee J.Y., Somogyi G. et al.: Improved sphincter contractility after allogenic muscle-derived progenitor cell injection into the denervated rat urethra. Urology 2003, 62, 958. 5. Chancellor M.B., Yokoyama T., Tirney S. et al.: Preliminary results of myoblast injection into the urethra and bladder wall: a possible method for the treatment of stress urinary incontinence and impaired detrusor contractility. Neurourol. Urodyn. 2000, 19, 279. 6. Chermansky C.J., Tarin T., Kwon D.D. et al.: Intraurethral muscle-derived cell injections increase leak point pressure in a rat model of intrinsic sphincter deficiency. Urology 2004, 63, 780. 7. Collins C.A., Olsen I., Zammit P.S. et al.: Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell 2005, 122, 289. 8. Corti S., Strazzer S., Del Bo R. et al.: A subpopulation of murine bone marrow cells fully differentiates along the myogenic pathway and participates in muscle repair in the mdx dystrophic mouse. Exp. Cell Res. 2002, 277, 74. 9. Dezawa M., Ishikawa H., Itokazu Y. et al.: Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. Science 2005, 309, 314. 10. Fan Y., Maley M., Beilharz M. et al.: Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. Muscle Nerve 1996, 19, 853. 11. Hagglund D., Olsson H., Leppert J.: Urinary incontinence: an unexpected large problem among young females. Results from a population-based study. Fam. Pract. 1999, 16, 506. 12. Halleux C., Sottile V., Gasser J.A. et al.: Multi-lineage potential of human mesenchymal stem cells following clonal expansion. J. Musculoskelet. Neuronal. Interact. 2001, 2, 71. 13. Hegner B., Weber M., Dragun D. et al.: Differential regulation of smooth muscle markers in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J. Hypertens. 2005, 23, 1191. 14. Huard J., Yokoyama T., Pruchnic R. et al.: Musclederived cell-mediated ex vivo gene therapy for urological dysfunction. Gene Ther. 2002, 9, 1617. 15. Jankowski R.J., Deasy B.M., Huard J.: Muscle-derived stem cells. Gene Ther. 2002, 9, 642. 16. Kim J.S., Lee E.H., Park H.C.: Urinary incontinence: prevalence and knowledge among community-dwelling Korean women aged 55 and over. Taehan Kanho Hakhoe Chi. 2004, 34, 609. 17. Kocak I., Okyay P., Dundar M. et al.: Female urinary incontinence in the west of Turkey: prevalence, risk factors and impact on quality of life. Eur. Urol. 2005, 48, 634. 18. Koide Y., Morikawa S., Mabuchi Y. et al.: Two distinct stem cell lineages in murine bone marrow. Stem Cells. 2007, 25, 1213. 19. Kucia M., Ratajczak M.Z.: Stem cells as a two edged sword - from regeneration to tumor formation. J. Physiol. Pharmacol. 2006, 57 (Suppl. 7), 5. 20. Kwon D., Kim Y., Pruchnic R. et al.: Periurethral cellular injection: comparison of muscle-derived progenitor cells and fibroblasts with regard to efficacy and tissue contractility in an animal model of stress urinary incontinence. Urology 2006, 68, 449. 21. Lee J.Y., Cannon T.W., Pruchnik R. et al.: The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 2003, 14, 31. 22. Lee J.Y., Qu-Petersen Z., Cao B. et al.: Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. J. Cell Biol. 2000, 150, 1085. 23. Lu S.H., Cannon T.W., Chermanski C. et al.: Muscle-derived stem cells seeded into acellular scaffolds develop calcium-dependent contractile activity that is modulated by nicotinic receptors. Urology 2003, 61, 1285. 24. Mitterberger M., Marksteiner R., Margreiter E. et al.: Autologous myoblasts and fibroblasts for female stress incontinence: a 1-year follow-up in 123 patients. BJU Int. 2007, 100, 1081. 25. Mitterberger M., Pinggera G.M., Marksteiner R. et al.: Adult Stem Cell Therapy of Female Stress Urinary Incontinence. Eur. Urol. 2008, 53, 169. 26. Mitterberger M., Pinggera G.M., Marksteiner R. et al.: Functional and Histological Changes after Myoblast Injections in the Porcine Rhabdosphincter. Eur. Urol. 2007, 52, 1763. 27. Nassiri S.M., Khaki Z., Soleimani M., Ahmadi S.H. et al.: The similar effect of transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells with or without prior differentiation induction in experimental myocardial infarction. J. Biomed. Sci. 2007, 14, 745. 28. Peyromaure M., Sebe P., Praud C. et al.: Fate of implanted syngenic muscle precursor cells in striated urethral sphincter of female rats: perspectives for treatment of urinary incontinence. Urology 2004, 64, 1037. 29. Strasser H., Marksteiner R., Margreiter E. et al.: Transurethral ultrasound guided injection of clonally cultured autologous myoblasts and fibroblasts: experimental results. Proceedings of the 2003 International Bladder Symposium. Ridgefield, CT; National Bladder Foundation 2003, 6. 30. Strasser H., Marksteiner R., Margreiter E. et al.: Stem cell therapy in treatment of urinary incontinence: first clinical results. J. Urol. 2004, 171 (Suppl.), 130. 31. Strasser H., Marksteiner R., Margreiter E. et al.: Autologous myoblasts and fibroblasts versus collagen for treatment of stress urinary incontinence in women: a randomised controlled trial. Lancet 2007, 369, 2179. 32. Suzuki K., Murtuza B., Beauchamp J.R. et al.: Dynamics and mediators of acute graft attrition after myoblast transplantation to the heart. FASEB J. 2004, 18, 1153. 33. Xu W., Zhang X., Qian H. et al.: Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2004, 229, 623. 34. Williams J.T., Southerland S.S., Souza J. et al.: Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes. Am. Surg. 1999, 65, 22. 35. Wilson L., Brown J.S., Shin G.P. et al.: Annual direct cost of urinary incontinence. Obstet. Gynecol. 2001, 98, 398. 36. Xu W., Zhang X., Qian H. et al.: Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2004, 229, 623. 37. Yiou R., Dreyfus P., Chopin D.K. et al.: Muscle precursor cell autografting in a murine model of urethral sphincter injury. BJU Int. 2002, 89, 298. 38. Yiou R., Lefaucheur J.P., Atala A.: The regeneration process of the striated urethral sphincter involves activation of intrinsic satellite cells. Anat. Embryol. (Berl). 2003, 206, 429. 39. Yiou R., Yoo J.J., Atala A.: Restoration of functional motor units in a rat model of sphincter injury by muscle precursor cell autografts. Transplantation 2003, 76, 1053. 40. Yiou R., Yoo J.J., Atala A.: Failure of differentiation into mature myotubes by muscle precursor cells with the side-population phenotype after injection into irreversibly damaged striated urethral sphincter. Transplantation 2005, 80, 131. 41. Yokoyama T., Huard J., Pruchnic R. et al.: Muscle-derived cell transplantation and differentiation into lower urinary tract smooth muscle. Urology 2001, 57, 826. 42. Yokoyama T., Pruchnic R., Lee J.Y. et al.: Autologous primary muscle-derived cells transfer into the lower urinary tract. Tissue Eng. 2001, 7, 395. 43. Yokoyama T., Yoshimura N., Dhir R. et al.: Persistence and survival of autologous muscle derived cells versus bovine collagen as potential treatment of stress urinary incontinence. J. Urol. 2001, 165, 271. 366 Przegl¹d Lekarski 2008 / 65 / 7-8 A. Burdziñska i wsp.