Kurs Neurogenetyki BADANIA GENETYCZNE W DYSTROFIACH MIOTONICZNYCH Anna Sułek Pracownia Molekularnych Podstaw Chorób Neurodegeneracyjnych Zakład Genetyki, IPiN
OBRAZ KLINICZNY DYSTROFII MIOTONICZNEJ WIELE TWARZY NON-DYSTROPHIC MYOTONIA MYOTONIC DYSTROPHY DYSTROPHIES Choroba wieloukładowa, klinicznie heterogenna, miopatia miotoniczna DM1 4 podtypy: łagodny, klasyczny, młodzieńczy i wrodzony Typ 1: zaćma, łysienie, w późnym wieku może rozwinąć się miotonia Typ 2: 2-3 dekada życia, osłabienie siły mięśni dystalnych, zaburzenia przewodzenia, miotonia, objawy ze strony układu pokarmowego, apatia Typ3: przypomina typ 2, zaburzenia poznawcze, zaburzenia zachowania Typ4: słabe ruchy płodu, wielowodzie, dziecko wiotkie, zaburzenia oddychania
ANTYCYPACJA zjawisko obserwowane w dziedziczeniu niektórych chorób genetycznie uwarunkowanych, charakteryzujące się wcześniejszym występowaniem objawów choroby i cięższym (ostrzejszym) jej przebiegiem w kolejnych pokoleniach. Antycypacja w dziedziczeniu dystrofii miotonicznej
PATOGENEZA MOLEKULARNA Poziom DNA niestabilność powtórzeń mikrosatelitarnych Poziom RNA toxic gain of function Poziom białka czy bierze udział w patomechanizmie?
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 mutacja dynamiczna w genie DMPK (19q13) ekspansja powtórzeń CTG w regionie nie ulegającym translacji genu DMPK 5-37 CTG norma 38-49 CTG premutacja > 50 CTG pełna mutacja Produktem genu jest serynowo-treoninowa kinaza białkowa związana z przewodnictwem i przekazywaniem sygnału wewnątrz komórki. Aktywna w komórkach mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych
Sąsiedztwo genu DMPK i lokalizacja powtórzeń SIX5 czynnik transkrypcyjny zawierający homeodomenę, pełniący funkcję w organogenezie DMWD dystrophia miotonica-containing WD repeat motif
Patogeneza na poziomie DNA CTG CTG CTG CTG CTG CTG mutacja dynamiczna de novo CTG CTG CTG CTG CTG CTG CAG mutacja dynamiczna zwielokrotnienie powtórzeń CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG przypadek sporadyczny - 1% choroba dziedziczna mutacja dynamiczna CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG Antycypacja forma młodzieńcza 10%
Patogeneza na poziomie DNA Niestabilność powtórzeń CTG/CCTG Tworzenie struktur: pętle, potrójne helisy, kwadrupleksy i in. Niestabilność somatyczna (większa w DM2) DM1 (płód) największe ekspansje w sercu a najmniejsze w wątrobie (40-400) DM1 (dorosły) największe ekspansje w sercu i korze mózgowej, najmniejsze w móżdżku (5770 CTG) Białka zaangażowane w procesy naprawcze DNA
frequency % Prawidłowy zakres liczby CTG a częstość występowania DM1 Frequency of DMPK alleles (DM1) 40 35 30 25 20 15 10 5 0 5 8 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31 allele (CTGn)
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 Proponowany mechanizm patologiczny w DM1 (gain of function) CUG mrna białka CUG BP wzrost alternatywnego splicingu różnych białek IR (insulinooporność) CIC-1 (miotonia) im więcej powtórzeń, tym bardziej zaburzony splicing poziom białka CUG BP jest podwyższony w mięśniach pacjentów z DM1 CIC - białko kanału chlorkowego, specyficznego dla komórek mięśniowych
Patogeneza DM Elementy trans (spliceopathy) W obecności mutrna białko CUG-BP wiąże się z kompleksem rybonukleinowym, co opóźnia jego szybki katabolizm i prowadzi do akumulacji i nadaktywności w jądrze Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP Mbnl1 CUG BP Mbnl1 CUG BP Prawidłowy stan DM1
Patogeneza DM poziom RNA Elementy cis Transkrypty z ekspansją powtórzeń zostają w jądrze komórkowym Tworzą struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowe Brak białka DMPK haploinsufficiency Zaburzenia transkrypcji genów flankujących SIX5 i DMAHP Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP
Alternatywne składanie genów w DM1
Patogeneza DM poziom białka Geny, których alternatywny splicing może powodować objawy kliniczne DM Geny: ClC1 IR Troponina T (TNNT2,3) Białko tau (MAPT), APP, NMDAR1 Miotubularyna, MTMR1 myotubularin related 1 gene SERCA1, 2, RγR, Dystrofina (ex 71, 78)?? Objawy: Miotonia Cukrzyca Zaburzenia kardiologiczne CNS Miopatia Zróżnicowanie mięśni Zaćma Inne
(CTG) n (CCTG) n toksyczne RNA Cytoplazma zaburzona regulacja alternatywnego splicingu genów: TNNT2, TNNT3, CLCN1, IR, MAPT, MTMR1 NMDAR1, APP, SERCA1, SERCA2, RγR, -dystrobrevin Jądro komórkowe zaburzona regulacja transkrypcji genów: NKX2-5, Sp1, CLCN1, Connexin 40, 43
Patogeneza DM poziom białka DMPK kinaza białkowa serynowo/treoninowa związana z dynamiką aktyny i homeostazą jonową Ulega alternatywnemu splicingowi Lokalizacja: DMPK A, B, C, D białka błonowe ER i mitochondrium DMPK E białko w cytozolu ZNF9 palce cynkowe wiążące się do DNA Prawidłowy poziom białka u pacjentów?
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 Diagnostyka molekularna w DM1 badania diagnostyczne badania przedobjawowe badania prenatalne
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 Diagnostyka molekularna wg Best Practice Guidelines for Molecular Analysis of Myotonic Dystrophy EMQN 1. PCR dwa allele o prawidłowej liczbie CTG - jednoznaczne wykluczenie DM1 jeden allel - wynik nieinformatywny hybrydyzacja, XL PCR 2. Southern blot (hybrydyzacja) dokładne ustalenie liczby powtórzeń nie jest możliwe powtórzenia CTG są niestabilne podczas mitoz
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 PCR z użyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie
Diagnostyka dystrofii miotonicznej typu 1 z wykorzystaniem TP-PCR NP NP NP NP
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2 (Richer syndrome, PROMM) choroba wieloukładowa, autosomalny dominujący sposób dziedziczenia częstość występowania: głównie Europa antycypacja? brak wyraźnej korelacji pomiędzy zakresem mutacji a ciężkością objawów
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2 mutacja dynamiczna w intronie 1 genu ZNF9 (3q13.3-q24) ekspansja powtórzeń CCTG w niekodującym regionie 71-11.000 CCTG - mutacja (TG)n(TCTG)n(CCTG)n motyw + sekwencje przerywające patologia na poziomie RNA
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2 Diagnostyka molekularna rodzaje badań metody molekularne interpretacja wyników
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 i 2 DM1 DM2 epidemiologia wiek zachorowania antycypacja forma wrodzona sposób dziedziczenia lokalizacja genu gen typ mutacji rodzaj powtórzeń liczba powtórzeń rozpowszechniona 0 do wieku dorosłego + + autosomalny dominujący 19q13.3 DMPK dynamiczna CTG 100-4.000 Europa 8-60 l. nieznaczna brak autosomalny dominujący 3q21 ZNF9 dynamiczna CCTG średnio 5.000
Perspektywy terapeutyczne STRATEGIE: redukcja aktywności białka Msh1 zapobieganie ekspansji powtórzeń zwiększenie stężenia białka Mbnl1 spowodowanie poprawności alternatywnego splicingu poszczególnych transkryptów usuwanie toksycznych transkryptów zawierających powtórzenia - sirna