TOMASZ GRZELAK. Praca doktorska wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. inż. Marka Kmieć

TOMASZ GRZELAK Wpływ mutacji w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła na ilość i jakość produkowanego mleka Praca doktorska wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. inż. Marka Kmieć Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt Wydział Biotechnologii i Hodowli Zwierząt Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie SZCZECIN 2011

Badania dofinansowane przez KBN Projekt badawczy nr N N311 346937 Badania dofinansowano z projektu Inwestycja w wiedzę motorem rozwoju innowacyjności w regionie współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego i Budżet Państwa Poddziałanie 8.2.2 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013

Panu Profesorowi Markowi Kmieć składam serdeczne podziękowania za cenne wskazówki merytoryczne oraz wszechstronną pomoc przy pisaniu niniejszej pracy

Mojej żonie Wiolecie, za cierpliwość i wyrozumiałość i za to, że nigdy nie zwątpiła...

SPIS TREŚCI 1. WSTĘP 6 2. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA 8 2.1. Historia badań nad hormonem wzrostu 8 2.2. Przysadka mózgowa - anatomia i lokalizacja 8 2.3. Hormon wzrostu człowieka 9 2.4. Działanie hormonu wzrostu 12 2.5. Hormon wzrostu bydła 13 2.6. Gen hormon wzrostu bydła 14 2.7. Receptory dla hormonu wzrostu 15 2.8. Polimorfizm genu hormonu wzrostu bydła 17 2.9. Polimorfizm regionu 5 flankującego genu hormonu wzrostu bydła 23 3. CEL PRACY 27 4. MATERIAŁ I METODY 28 4.1. Materiał badawczy 28 4.2. Izolacja DNA 30 4.3.Oznaczenie genotypów 30 4.4. Sekwencjonowanie DNA 33 4.5. Analiza statystyczna 34 5. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE 35 5.1. Analiza restrykcyjna (PCR-ACRS) genu hormonu wzrostu bydła 35 5.1.1. Polimorfizm regionu 5 flankującego genu GH bydła GH/BsuRI 35 5.1.2. Polimorfizm regionu 5 flankującego genu GH bydła GH/RsaI 38 5.1.3. Polimorfizm w intronie III genu GH bydła GH/MvaI 40 5.1.4. Polimorfizm regionu 5 flankującego genu GH bydła GH/PmlI 42 5.2. Sekwencjonowanie DNA 43 5.3. Analiza asocjacji polimorfizmów genu hormonu wzrostu bydła z cechami użytkowości mlecznej 46 6. STWIERDZENIA I WNIOSKI 57 7. BIBLIOGRAFIA 59 5

Wstęp 1. WSTĘP Lata sześćdziesiąte XX wieku zaznaczyły się w historii genetyki zwierząt użytkowych badaniami nad organizacją genomu bydła. Stało się to dzięki sukcesywnemu wprowadzaniu nowoczesnych technik badawczych do badań cytogenetycznych, takich jak uzyskiwanie preparatów chromosomowych z hodowanych in vitro limfocytów krwi, czy też barwienie prążków chromosomowych w celu analizy kariotypu organizmów. Kolejnym krokiem w organizacji genomu bydła były rozpoczęte w 1991 roku badania mające na celu opracowanie markerowych map genomowych (program Bov- Map). Do roku 2004 poznano 4300 markerów w genomie bydła, a już w 2009 ogłoszono zsekwencjonowanie całego genomu Bos taurus. Rozwój badań molekularnych pozwolił wykorzystać markery genetyczne, jako cenne narzędzie w procesie przyspieszenia postępu hodowlanego (Świtoński, 2004). Są one ważne w badaniach nad kontrolą pochodzenia, selekcją zwierząt MAS (marker assisted selection), oraz przy identyfikacji genów cech ilościowych QTLs (quantitative trait loci) i cech produkcyjnych ETLs (economic trait loci). Aktualna wiedza i nowoczesne techniki laboratoryjne pozwalają na prowadzenie oceny wartości genetycznej zwierząt gospodarskich na poziomie populacji, komórki, oraz DNA. Uzyskiwany postęp genetyczny w populacji zwierząt gospodarskich osiągany jest w głównej mierze poprzez dokładność oceny wartości hodowlanej, intensywność selekcji, oraz wielkość zmienności genetycznej (Kmieć, 1998). W ostatnich latach ze względu na wzrost oczekiwań konsumentów, a przez to hodowców bydła, faworyzowana jest intensyfikacja postępu hodowlanego. Metody biotechnologiczne umożliwiają racjonalne manipulowanie cechami użytkowymi zwierząt oraz prognozowanie potencjalnej wartości hodowlanej. W hodowli bydła mlecznego ocenia się cechy użytkowości mlecznej, takie jak wydajność mleka, wydajność tłuszczu i białka, oraz ich zawartość w mleku. W pracy hodowlanej istotna jest kontrola pochodzenia, którą prowadzi się z wykorzystaniem wiedzy dotyczącej grup krwi i polimorfizmu białek, a także polimorfizmu DNA (Charon i Świtoński, 2004). Wydajność wyżej wymienionych cech jest ważna także dla polskiego hodowcy, ponieważ, 6

Wstęp jak wykazują statystyki, pogłowie bydła mlecznego, a co za tym idzie ilość produkowanego mleka w Polsce, uległa znacznemu obniżeniu w ciągu ostatnich kilkunastu lat (produkcja mleka z 16 mln kg w 1989 r. obniżyła się do ok. 11,5 mln kg w 1990 r.) Szymańska, 2005. Ulepszanie cech ilościowych poprzez selekcję prowadzi do poprawy wartości genetycznej zwierząt, jednak korzystniejsze są metody hodowlane oparte na nie tylko ocenie fenotypu zwierzęcia, lecz pozwalające również na odnalezienie genów QTL, sprzężonych z daną cechą. Poszukuje się zatem markerów, którymi są geny lub fragmenty DNA pozwalające na identyfikację alleli w sprzężonych locus. Selekcja takich specyficznych alleli z wykorzystaniem markerów genetycznych to wspomniana wcześniej selekcja zwierząt MAS (Strabel, 2006). Ze względu na wysoką polimorficzność badania prowadzone nad regionem 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła skupiały się głównie na poszukiwaniu nowych mutacji wewnątrz tego rejonu, natomiast nie analizowano wpływu tych mutacji na cechy użytkowe bydła. Istnieje przypuszczenie, iż mutacje w regionie 5 flankującym oraz intronie 3 genu hormonu wzrostu bydła mogą mieć wpływ na cechy hodowlane i w związku z tym będą mogły być wykorzystane w celach selekcyjnych w kierunku pożądanej cechy. 7

Przegląd piśmiennictwa 2. PRZEGLĄD PIŚMIENNICTWA 2.1 Historia badań nad hormonem wzrostu Zainteresowanie hormonem wzrostu (GH, ang. growth hormone) sięga końca XVIII wieku, choć z przyczyn oczywistych nie wiązano z nim jeszcze obserwowanych efektów fenotypowych. Zaburzenia metaboliczne wywołujące gigantyzm i akromegalię wzbudzały zdziwienie, przerażenie i śmiech wśród ludzi dawnych czasów, a przyczyn defektów upatrywano w chorobach kości, lub u kobiet w zaburzeniach miesiączkowania. Dopiero w roku 1887 zaczęto wiązać nieprawidłowy wzrost i towarzyszące mu choroby z przysadką mózgową, a w 1921 roku Evans i Long udowodnili to ostatecznie przeprowadzając badania na szczurach, którym dootrzewnowo podano wyciąg z przedniego płata przysadki mózgowej, co wywołało akromegalię. Dalsze wysiłki skierowane zostały ku izolacji tajemniczej substancji wywołującej tak zaskakujące efekty fizjologiczne. Po 35 latach eksperymentów Raben w roku 1957 jako pierwszy wyizolował hormon wzrostu człowieka, a od roku 1962 oznaczanie tego hormonu metodą radioimmunologiczną stanowiło podstawę diagnostyki w kierunku akromegalii. Kolejne lata badań przyniosły odkrycie substancji towarzyszących i regulujących sekrecję hormonu wzrostu: somatomedyny C, somatostatyny i hormonu uwalniającego hormon wzrostu (GHRH) - Kałużny i Bolanowski (2008). 2.2 Przysadka mózgowa - anatomia i lokalizacja Przysadka mózgowa znajduje się w jamie kostnej (siodełko tureckie) leżącej w kości klinowej u podstawy czaszki. Niemal cały gruczoł otoczony jest przez oponę twardą. Przysadka jest anatomicznie blisko związana z podwzgórzem. Złożona jest z dwóch części: przedniej- gruczołowej i tylnej- nerwowej, pomiędzy którymi znajduje się bardzo mała środkowa część przysadki. Tylny płat przysadki mózgowej zaopatrzony jest w komórki neurosekrecyjne, tworzące wielokomórkowy układ neurosekrecyjny. Jest on także miejscem magazynowania i wydzielania neurohormonów podwzgórza (oksytocyny i wazopresyny), które jako pre-pro-hormony upakowane w perykarionie trafiają do pęcherzyków neurosekrecyjnych (ziarnistości neurosekrecyjnych) i aksonami przesuwane są do tylnego płata 8

Przegląd piśmiennictwa przysadki. W czasie tego transportu w pęcherzykach zachodzi potranslacyjna modyfikacja pre-pro-hormonów, w wyniku czego w pęcherzykach neurosekrecyjnych przysadki znajdują się oddzielne cząsteczki neurohormonów wazopresyny argininowej i neurofizyny II w neuronach wazopresynoergicznych oraz oksytocyny i neurofizyny I w neuronach oksytocynoergicznych. Komórki nabłonkowe części pośredniej przysadki wydzielają u ludzi hormony melanotropowe: alpha-msh, beta-msh, gamma-msha (MSH-ang. melanocyte stimulating hormone, hormon stymulujący melanocyty), hormon kortykotropowy (ACTH) zwany również CLIP (kortykotropowopodobny peptyd części pośredniej przysadki) oraz alpha- lub beta- endorfinę. Hormon melanotropowy wywołuje u ludzi zmianę w rozmieszczeniu melaniny w skórze oraz uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. Uwalnianie hormonów z części pośredniej przysadki następuje w wyniku działania neuronów dopaminergicznych podwzgórza, a dokładniej w wyniku zaprzestania inhibicji wydzielania tych hormonów. W części gruczołowej przysadki występują komórki wydzielające hormony: hormon wzrostu (GH) - komórki somatotropowe, prolaktynę (PRL) - komórki prolaktynowe, hormon kortykotropowy (ACTH) - komórki kortykotropowe, hormon tyreotropowy (TSH) - komórki tyreotropowe, hormony gonadotropowe (hormon folikulotropowy - FSH i hormon luteinizujący - LH) - komórki gonadotropowe oraz komórki macierzyste dla komórek wydzielających hormony - Traczyk (2002), Bullock i wsp. (2000). Komórki somatotropowe i prolaktynowe należą do komórek chromofilnych kwasochłonnych, natomiast reszta z w/w komórek wydzielniczych to komórki chromofilne zasadochłonne. Obok komórek chromofilnych (z ziarnistościami wydzielniczymi) w przednim płacie przysadki występują także komórki chromofobne (bez ziarnistości wydzielniczych). 2.3 Hormon wzrostu człowieka Rodzina genów ludzkiego hormonu wzrostu ( hgh- ang. human growth hormone, hormon somatotropowy- STH, somatotropina) składa się z pięciu odległych genów, wszystkich ulokowanych na długim ramieniu chromosomu 17 (17q22) (Herrington, 2001). Należą do niej poza hormonem wzrostu, prolaktyna oraz laktogeny łożyskowe. Geny kodujące te hormony prawdopodobnie ewoluowały przez ostatnie 9

Przegląd piśmiennictwa 350 milionów lat poprzez duplikację genów przodków stąd też wysokie podobieństwo strukturalne między genem hormonu wzrostu, prolaktyny i laktogenami łożyskowymi (Miller i Eberhardt, 1983). Przysadkowy GH (GH-N) jest kodowany przez dwa produkty mrna ulegające alternatywnemu splicingowi, co daje cyrkulujące w dużych ilościach 22 kda cząsteczki oraz rzadsze (tylko 10% krążącego GH) 20 kda GH pozbawione aminokwasów 32-46. W komórkach łożyskowego syncytiotrofoblastu ekspresji ulega inny wariant hormonu wzrostu- hgh-v oraz trzy inne geny ludzkiej somatotropiny kosmówkowej (HCS- human chorionic somatotropin). Gen hormonu wzrostu człowieka jest częścią klasteru genów złożonego z pięciu blisko spokrewnionych ze sobą genów. Klaster ten obejmuje 66.5 kpz, a jego region 5 -flankujący zawiera w sobie region kontrolujący transkrypcję, w skład którego wchodzą następujące cis elementy (5 ->3 ): sekwencja wzmacniacza (enhancer region), GRE (Glucocorticoid responsive element), dwie kopie czynnika GHF-1 (GH transcription factor) lub pit-1, a także CRE (camp responsive element) i kaseta TATA (Bodner i wsp. 1988). Gen hormonu wzorstu człowieka obejmuje 3 kpz, składa się z 5 eksonów i 4 intronów, kodując 217-aminokwasowe białko prekursorowe, które po proteolizie amino-końcowego peptydu sygnałowego daje dojrzały jednołańcuchowy polipeptyd o długości 191 aminokwasów - hormon wzrostu (Miller i Eberhardt, 1983). GH człowieka stanowi łańcuch polipeptydowy zbudowany ze 191 aminokwasów o masie cząsteczkowej 22 kda. Syntetyzowany jest w komórkach kwasochłonnych przedniego płata przysadki i magazynowany w nich w znacznej ilości. GH stanowi około 4-10% mokrej masy przysadki, co u ludzi odpowiada 5-15 mg. Wydzielany jest w sposób pulsacyjny, w okresach 20-30 minutowych (Bullock i wsp. 2000), a w obiegu występuje w postaci jednej z dwóch form: wolnej-aktywnej lub związany z białkiem wiążącym hormon wzrostu (GHBP) (Rosenbloom i Connor, 2007). Nie odbija się to jednak na utracie immunoreaktywności, dlatego też obie formy składają się na wynik pomiaru GH w organizmie. W warunkach fizjologicznych nocny szczyt wydzielania hormonu wzrostu przypada na 1-2 h po rozpoczęciu fazy snu głębokiego, co koreluje z 3. lub 4. stadium snu wolnofalowego (Bullock i wsp. 2000). 10

Przegląd piśmiennictwa Uwalnianie hormonu wzrostu regulują dwa hormony hipofizjotropowe, reagujące przeciwstawnie na wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia: hormon uwalniający hormon wzrostu (SRH- somatotropin releasing hormone, GHRH- growth hormone releasing hormone) oraz somatostatyna- hormon hamujący uwalnianie hormonu wzrostu (SIH- somatotropin inhibiting hormone) (Lussier i wsp. 1991). W procesie tym biorą także udział różne czynniki farmakologiczne, fizjologiczne i psychiczne. GHRH, pośrednicząc w wiązaniu GTP (guanozynotrifosoranów) do podjednostki alfa białka G, aktywuje owo białko, co skutkuje wzrostem stężenia camp, zmianami w wewnątrzkomórkowej równowadze pomiędzy jonami wapnia i sodu, oraz sekrecję hormonu wzrostu (Goth i wsp. 1992). GHRH u ludzi wykazuje różne efekty jeśli chodzi o kontrolę uwalniania GH w zależności od płci. Chociaż ilość uwalnianego GH w ciągu 24 godzin zarówno u kobiet jak i u mężczyzn jest podobna to różnice dotyczą okresu dnia, w którym to uwalnianie jest najwyższe. U mężczyzn większość GH ulega sekrecji we wczesnych godzinach nocnych, zaś w godzinach dziennych sekrecja jest na niskim podstawowym poziomie. U kobiet sytuacja przedstawia się odwrotnie. W uwalnianiu GH pośredniczą drogi nerwowe monoaminergiczne i serotoninergiczne. Bromokryptyna (agonista dopaminy), enkefaliny, endorfiny (beta-endorfina) oraz opiaty stymulują wydzielanie GH. Hipoglikemia zależna od insuliny jest prawdopodobnym bodźcem stymulującym wydzielanie GH, podobnie jak glukagon i wazopresyna w dawkach farmakologicznych. Obok hipoglikemii bodźcem fizjologicznym jest wzrost stężenia aminokwasów w osoczu krwi (argininy, leucyny, lizyny, tryptofanu i 5-hydroksytryptofanu), a także obniżenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych. Estrogeny pobudzają zarówno syntezę jaki i wydzielanie GH. Sekrecja GH może być stymulowana przez wysiłek fizyczny, uraz, stres oraz gorączkę, zabiegi chirurgiczne, anestezjologiczne, podanie pirogenu i wielokrotne nakłucie żyły. Głodzenie prowadzi do zwiększenia wydzielania GH po dwóch lub trzech dniach (Bullock i wsp. 2000). Do endokrynopatii wywoływanych nadmiarem GH należy opóźnienie wzrostu (gdy stężenie GH wzrasta, a stężenie IGF się obniża), gigantyzm (w przypadku nadprodukcji hormonu wzrostu w okresie dojrzewania), akromegalia (w przypadku nadmiernego wydzielania GH w wieku dojrzałym). Do zaburzeń wywołanych niedoborem GH należy: karłowatość z towarzyszącą niedojrzałością płciową (przy obniżeniu wy- 11

Przegląd piśmiennictwa dzielania GH przed osiągnięciem dojrzałości płciowej), panhipopituitaryzm (w zespole braku hormonów przedniego płata przysadki). 2.4 Działanie hormonu wzrostu Do skutków fizjologicznych i metabolicznych działania GH na organizm należy pobudzanie wzrostu kości, chrząstki i tkanki łącznej za pośrednictwem somatomedyn, zwanych inaczej insulinopodobnymi czynnikami wzrostu (IGF- insulin-like growth factor). Zasadniczym czynnikiem wzrostowym wydzielanym pod wpływem hgh jest IGF-1 i w mniejszym stopniu IGF-2. Somatomedyna pobudza lipogenezę w tkance tłuszczowej, zwiększa utlenianie glukozy oraz przyspiesza transport glukozy i aminokwasów do komórek mięśniowych. Hormon wzrostu stymuluje za pośrednictwem IGF rozrost chondrocytów i tworzenie się osteoblastów, przez co warunkuje wzrost kośćca na długość i grubość. Procesy te są powiązane biochemicznie z syntezą białka w procesie ogólnego wzrostu ciała oraz są odpowiedzialne za hiperplazję i hipertrofię towarzyszącą zwiększeniu masy tkankowej. Hormon wzrostu bierze udział w przemianie białek organizmu, wywierając m.in. wpływ anaboliczny na mięśnie szkieletowe oraz na mięsień sercowy, gdzie pobudza syntezę białek, RNA, oraz DNA. GH obniża stężenie krążących we krwi aminokwasów i mocznika, czego dowodem jest dodatni bilans azotowy organizmu, oraz obniżenie stężenia mocznika w moczu. Wzmaga transport aminokwasów do wnętrza komórek i wbudowywanie się ich w cząsteczki białek. Hormon wzrostu ma działanie lipolityczne, wywiera kataboliczny wpływ na tkankę tłuszczową. Stymuluje mobilizację kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, przez co obniża w niej zawartość trójglicerydów oraz zwiększa stężenie kwasów tłuszczowych i glicerolu w osoczu. W wątrobie zwiększa utlenianie kwasów tłuszczowych do ciał ketonowych, acetooctanu i beta-hydroksymaślanu w wątrobie. Hormon wzrostu jest hormonem diabetogennym; wywiera działanie antyinsulinowe, mogąc powodować hiperglikemię. Zwiększa stężenie glukozy we krwi na skutek zahamowania syntezy glikogenu w mięśniach szkieletowych i zmniejszonego zużycia glukozy. W wątrobie z kolei dochodzi do wzmożonej glikoneogenezy i do zwiększenia zawartości glikogenu wątrobowego. Hormon ten ma wpływ na gospodarkę mineralną za- 12

Przegląd piśmiennictwa trzymując większość kationów, zwłaszcza zaś jony wapniowe w postaci soli kwasu fosforowego, oraz jony sodu w nerkach (Bullock i wsp. 2000; Traczyk, 2002). 2.5 Hormon wzrostu bydła Bydlęcy hormon wzrostu (bgh) jest jednołańcuchowym polipeptydem zbudowanym ze 190 lub 191 aminokwasów, tworzonym przez cztery alfa-helisy i regiony niehelikalne (Etherton i Bauman, 1998). Wykazuje wysokie, aż 90 %, podobieństwo do hormonu wzrostu świni i 65% podobieństwo z ludzkim GH. bgh ma masę cząsteczkową 22-kDa, a w jego budowie molekularnej można wyróżnić w pozycjach 9-34, 72-92, 106-128, 155-184 cztery alfa-helisy ułożone anty-równolegle oraz dwa mostki dwusiarczkowe uformowane pomiędzy resztami cysteiny w pozycjach 53/64 oraz 181/189 łańcucha aminokwasów (Santomé, 1973). Mostki dwusiarczkowe nie są istotne dla aktywności biologicznej hormonu, zaś N-koniec cząsteczki jest zaangażowany w aktywność galaktopoetyczną. Tryptofan w pozycji 86 jest krytycznym czynnikiem w procesie pakowania cząsteczki w pasma alfa-helis, a hydrofobowa natura rdzenia molekuły, w skład którego wchodzi około 20 aminokwasów, odpowiada za utrzymanie jej stabilności. Glicyna w trzeciej helisie (u ludzi w pozycji 120, u bydła - 119) została uznana jako szczególnie ważna dla biologicznej aktywności GH. Jeśli zostanie zastąpiona innym aminokwasem to GH z roli wzmacniacza zmieni się w supresora wzrostu i antagonistę GH (Chen i wsp. 1991). Każda reszta aminokwasowa w cząsteczce białka w konkretnej pozycji oraz mostki solne i wiązania wodorowe odpowiadają za wiązanie GH z receptorem. Cząsteczka GH ma na swojej powierzchni dwa miejsca wiążące się z receptorem: SiteI i SiteII, które są ze sobą przestrzennie sparowane (Sami, 2007). Bydlęca somatotropina występuje w czterech formach polimorficznych: zawierającej fenyloalaninę lub alaninę na N-końcu, w zależności od formy przekształcenia pre-hormonu w momencie jego wydzielania - wariant ten występuje w proporcji 1:1 (Wallis i Davis, 1976), z leucyną lub waliną w pozycji 127 łańcucha polipeptydowego - wariant występujący w proporcji 2:1 (Seavey, 1971). 13

Przegląd piśmiennictwa 2.6 Gen hormon wzrostu bydła Gen hormonu wzrostu (bgh) został zlokalizowany na 19 chromosomie bydła (19q22) - Hediger i wsp. (1990) i składa się on z 1793 nukleotydów tworzących 5 eksonów oraz 4 introny (Fries i wsp. 1993). Rycina 1. Struktura genu hormonu wzrostu bydła Gen GH jest częścią wielkiej rodziny genów, do której należy także prolaktyna i laktogeny łożyskowe. W skład regionu 5 flankującego, który jest zbudowany przez ok. 648 nukleotydów, wchodzą elementy ruchome należące do klasy I, czyli krótkie rozproszone powtórzenia (SINEs/BovA2) oraz miejsca wiązania białek, takie jak: miejsce inicjacji transkrypcji oraz miejsce wiązania czynników transkrypcyjnych, które są związane z kontrolą ekspresji genu. Każda zmiana w sekwencji nukleotydów DNA w tym regionie może, poprzez zmianę powinowactwa wiązania czynników transkrypcyjnych, wpływać na proces transkrypcji genu i w konsekwencji na koncentrację bgh we krwi (Yao i wsp. 1996). Regulacja ekspresji genu GH przebiega na trzech poziomach: podstawowym, tkankowo-specyficznym i hormonalnym. Do czynników transkrypcyjnych ekspresji podstawowej należą: Sp1, NF-1/AP-2, USF, Zn-15. Czynnikiem tkankowo-specyficznym (przysadkowo-specyficznym) jest Pit-1, zwany także GHF-1, lub PUF-1. Poza regulacją ekspresji genu GH czynnik Pit-1 jest odpowiedzialny za ekspresję genu prolaktyny, tyreotropiny oraz genu receptora GHRH (hormonu uwalniającego hormon wzrostu). Promotor genu GH zawiera parę konserwatywnych miejsc wiążących Pit-1, które to miejsca obejmują region pierwszych 200 pz sekwencji 5 -flankującej (Castrillo, 1991). W hormonalnej regulacji ekspresji ważną rolę odgrywa motyw CRE (camp response element) oraz zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie camp. Po przyłą- 14

Przegląd piśmiennictwa czeniu GHRH do receptora (GHRH-R) następuje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia camp, a następnie aktywacja białkowej kinazy A, co powoduje podwyższenie poziomu jonów wapnia w komórce, a w konsekwencji uwolnienie GH. Wzrost stężenia camp przyczynia się także do wzmożenia proliferacji komórek somatotropowych przedniej części przysadki (Mayo, 1992; Rawlings i wsp. 1991; Harvey, 1995). Stwierdzono także, iż trójjodotyronina (T3) zwiększa ekspresję transkrypcji genu GH szczurów i podnosi poziom syntezy tego hormonu. Dlatego też istotnym elementem promotora genu GH jest motyw TRE (thyroid hormone response element). Motyw ten u szczurów został także odnaleziony w trzecim intronie (Sap, 1990) zaś u ludzi w części proksymalnej regionu 3 UTR (Zhang, 1992). Istotną rolę we wzmaganiu ekspresji genu GH odgrywają glikokortykoidy, stąd też istotny jest motyw GRE (glucocorticoid response element) obecny w genie GH. Insulina z kolei jest inhibitorem dla promotora genu GH, a sekwencja IRE (insulin response element) zajmuje 500 pz jego długości. Motywy TRE, GRE oraz IRE wiążą czynniki transkrypcyjne warunkujące odpowiedź na działanie hormonów tarczycy, glikokortykoidów a także insuliny. 2.7 Receptory dla hormonu wzrostu Receptory hormonu wzrostu zostały z początku zidentyfikowane w komórkach wątroby, jednak późniejsze badania wykazały ich istnienie w wielu innych organach, tkankach i komórkach, m.in. w kościach, nerkach, komórkach tłuszczowych, mięśniach, oku, mózgu i sercu (Kelly i wsp. (1991); Mertani i Morel (1995); Ohlsson i wsp. (1993), Nyberg i Burman (1996); Hill i wsp. (1992)). Zostały także zidentyfikowane w komórkach układu immunologicznego, włączając kultury ludzkich komórek B (Hull i wsp. 1996), limfocytów IM-9 (Rapaport i wsp. 1995), komórek śledziony i grasicy (Ban i wsp. 1991). Receptory hormonu wzrostu należą do nadrodziny transmembranowych białek, receptorów cytokin klasy I (zwanych także receptorami hematopoetyn), do których należą receptory prolaktyny, erytropoetyny, trombopoetyny, interleukin, i in (Zych i wsp. 2006). Charakterystyczne cechy członków tej grupy receptorów to: - obecność transbłonowych domen (zewnątrzkomórkowej, odpowiedzialnej za wiązanie hormonów wzrostu, i wewnątrzkomórkowej, określającej właściwości katali- 15

Przegląd piśmiennictwa tyczne receptora); ograniczona homologia aminokwasów (14-44%) w regionie obejmujących około 210 aminokwasów w domenie zewnątrzkomórkowej (odpowiadająca dwóm domenom fibronektyny III o podobnym rozmiarze); - konserwatywne pary reszt cysteinowych w zewnątrzkomórkowej domenie i konserwatywna reszta tryptofanowa w N-końcowej domenie fibronektyn; - obecność w C-końcu drugiej domeny fibronektyn sekwencji WSXWS (Wtryptofan, S-seryna, X- dowolny aminokwas) - u ssaków domena ta nie występuje, zastąpiona jest domeną YXXFS (Y-tyrozyna, X- glicyna, seryna, lizyna, kwas glutaminowy, F- fenyloalanina, S-seryna); nieobecność sekwencji konsensusowej kinazy tyrozynowej; - istnienie dwóch krótkich, bogatych w prolinę, wewnątrzkomórkowych domen (domena Box1 składa się z 8 reszt aminokwasowych i jest usytuowany w obszarze 20 reszt domeny transbłonowej. Wykazuje sekwencję ΨXXXalPXP lub ΨXalPXP, gdzie Ψ-aminokwas hydrofobowy, X-dowolny aminokwas, al-aminokwas alifatyczny, P-prolina. U bydła Box1 ma postać ILPPVPVP. Domena ta jest ważna ze względu na przyłączanie kinazy JAK2 do receptora, przez co wpływa na wszystkie funkcje komórki odpowiadające sygnałom hormonu wzrostu. Z kolei za aktywację JAK2 przez hormon wzrostu odpowiada domena Box2, która składa się z około 15 reszt aminokwasowych i ulokowana jest w odległości około 30 reszt od Box1. Składa się z naprzemiennie ułożonych reszt aminokwasów kwaśnych i hydrofobowych. (Zhu i wsp. 2001). GH wiąże się z wysoką specyficznością do dwóch cząsteczek GHR tworząc stabilny kompleks heterotrimerowy. Ponieważ GHR charakteryzuje się nieobecnością wewnętrznej aktywności katalitycznej w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny, przewodzenie sygnału przez ten receptor odbywa się głównie za pośrednictwem kinazy JAK2, cytoplazmatycznej kinazy tyrozynowej, która wiąże się z regionem Box1 cytoplazmatycznego regionu GHR. Gwałtowna i krótkotrwała aktywacja JAK2 skutkuje fosforylacją jej samej, tyrozyn domeny wewnątrzkomórkowej receptora, oraz wielu wewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych i adaptorowych. Badania wyjaśniły także, iż nie sam Box1 jest regionem GHR oddziałującym z JAK2, ale dodatkowo w pełnej fosforylacji tyrozyn domeny wewnątrzkomórkowej receptora bierze 16

Przegląd piśmiennictwa udział cytoplazmatyczna część receptora (Argetsinger i Carter-Su (1996); Van der- Kuur i wsp. (1994)). Do głównych czynników sygnalizacyjnych GHR należą białka STAT (signal transducers and activators of transcription): STAT1, STAT3, STAT5A, STAT5B, które wiążą się z ufosforylowaną częścią GHR poprzez domeny SH2. Ufosforylowane białka STAT tworzą homo- i heterodimery, które migrują do jądra komórkowego i wiążą się ze specyficznymi miejscami promotorów genów bezpośrednio aktywowanych przez GH, do których należą c-fos i Spi 2.1. Rycina 2. Szlaki sygnałowe hormonu wzrostu (Brooks i Waters, 2010) Szlakiem przez który hormon wzrostu aktywuje czynniki transkrypcyjne genów docelowych jest także szlak kinazy MAP (ang. mitogen-activated protein kinase), kinazy białkowej aktywowanej mitogenami. 2.8 Polimorfizm genu hormonu wzrostu bydła Wiele przeprowadzonych dotychczas badań nad genem hormonu wzrostu bydła wskazuje iż jest to gen charakteryzujący się wysoką polimorficznością, zarówno w obrębie eksonów, intronów jak i w obszarach flankujących (promotorowym oraz 3 UTR). Najlepiej poznanym, a co za tym idzie najczęściej badanym polimorfizmem genu hormonu wzrostu bydła jest substytucja w pozycji 2141 (ekson V), polegająca na 17

Przegląd piśmiennictwa transwersji C G. Konsekwencją owej mutacji jest zamiana aminokwasów w produkcie białkowym, a konkretnie zastąpienie leucyny(ctg) przez walinę(gtg) w pozycji 127(Lucy i wsp. 1993). Lucy i wsp. (1993) w swoich badaniach stwierdzili, że frekwencje alleli polimorfizmu genu GH/AluI u różnych badanch ras bydła mlecznego różniły się od siebie. Ponadto stwierdzono, iż rasa holsztyńsko-fryzyjska wykazuje większą produkcję mleka kiedy u krów występuje genotyp homozygotyczny dla leucyny, natomiast w przypadku rasy Jersey większą produkcję mleka wykazują osobniki u których występuje wariant homozygotyczny dla waliny. Z kolei Dybus i wsp. (2002) wykazali, iż w I laktacji krowy holsztyńskofryzyjskie o genotypie LL charakteryzowały się większą wydajnością mleczną oraz większą zawartością tłuszczu i białka w mleku, w porównaniu do krów o genotypie LV. Jeżeli chodzi o mleczność podobne wyniki uzyskali także Lucy i wsp. (1993), Lee i wsp. (1993) oraz Pawar i wsp. (2007), natomiast badania Sabour i wsp. (1997) sugerują, że to allel V jest odpowiedzialny za zmienność cech związanych z wydajnością mleczną oraz zawartością w nim tłuszczu i białka. Potwierdzeniem badań wykazujących, iż tak właśnie jest może być doświadczenie jakie przeprowadził Eppard i wsp. (1992), polegające na wstrzyknięciu zrekombinowanej formy bydlęcego hormonu wzrostu z waliną 127 -bgh oraz leucyną 127- bgh, gdzie krowy którym podano hormon wzrostu z waliną wykazywały się większą wydajnością mleczną. Badania jakie zostały przeprowadzone na krowach rasy Brown Swiss (Chrenek i wsp. 1999) wykazały, iż w mleku krów o genotypie LL jest wyższa zawartość tłuszczu oraz białka w porównaniu do osobników o genotypie VV. Vukasinovic i wsp. (1999) w swoich badaniach wskazują na możliwość wykorzystania polimorfizmu w genie hormonu wzrostu bydła w selekcji ukierunkowanej na osiągnięcie większej procentowej zawartości białka w mleku krów. Wykazano również wpływ w/w mutacji na cechy użytkowości mięsnej. Schlee i wsp. (1994) zaprezentowali wyniki wskazujące na to, iż buhaje o genotypie LV charakteryzowały się najwyższą wartością hodowlaną dla przyrostu tuszy. Z kolei w innej swojej pracy Schlee i wsp. (1994) wskazują na związek między różnymi wariantami genotypów, a stężeniem IGF-1 oraz bgh w surowicy krwi. Wykazali oni iż buhaje o genotypie LV charakteryzowały się mniejszą zawartością bgh w surowicy krwi niż 18

Przegląd piśmiennictwa te o genotypie LV, natomiast poziom IGF-1 wyższy był u buhajów heterozygotycznych. Wykazano także, że buhaje o genotypie VV miały statystycznie istotne niższe dzienne przyrosty masy ciała, a także charakteryzowały się mniejszą masą ciała niż buhaje o pozostałych genotypach. Zwierzchowski i wsp. (1998) wykazali, że osobniki o genotypie LV spożywały najwięcej paszy i jednocześnie były najcięższe, co mogłoby być przesłanką do selekcji buhajów w kierunku szybkiego wzrostu, jednak w innej publikacji ci sami autorzy wskazują na to, iż lepiej składniki pokarmowe zawarte w paszy wykorzystywały osobniki o genotypach LL i VV (Zwierzchowski i wsp. 1997). Z kolei z przeprowadzonych badań opublikowanych przez Zwierzchowskiego i wsp. w roku 2001 wynika, że buhaje ras mięsnych o genotypie VV wykazywały wyższą o około 30 kg masę ciała, aniżeli buhaje o pozostałych genotypach. Buhaje o homozygotycznym genotypie VV charakteryzowały się także wyższym dziennym przyrostem masy ciała (rzędu 200 do 300g), niż osobniki z pozostałymi dwoma wariantami genotypów. Wyniki jakie uzyskał Reis i wsp. (2001) badając 8 różnych ras bydła wskazują, że u niektórych z nich (Alentejana, Marinhoa i Preta) występują znaczące różnice pomiędzy genotypami LL i LV, a żywą masą ciała. Wyniki jakie uzyskali sugerują, że genotyp LV jest pozytywnie powiązany z wyższą masą ciała buhajów w dalszych etapach wzrostu. U bydła podolskiego włoskiego, wykazano natomiast, iż indywidualne osobniki o genotypie BB wykazują mniejsze cechy wzrostowe, aniżeli osobniki o pozostałych genotypach (Dario i wsp. 2005). Autorzy jednak wnioskują, iż z racji niskiej częstości występowania allelu B konieczne jest zwiększenie populacji zwierząt będących nosicielami tegoż allelu. Badania Lechniak i wsp. (1999) wykazały natomiast, że buhaje o genotypie LL charakteryzowały się najmniejszą objętością ejakulatów, jednak istotnego wpływu polimorfizmu Leu/Val na inne parametry nasienia nie wykazano. Lucy i wsp. (1993) stwierdzili, że u ras bydła mlecznego o większych rozmiarach ciała obserwuje się większą częstość występowania allela L (m.in. bydło holsztyńsko-fryzyjskie), niż u ras mniejszych (np. rasa jersey). Wykazano także, iż allel L może być potencjalnym wskaźnikiem wysokiej mleczności u bydła, natomiast allel V i jego wyższa frekwencja może być traktowany jako potencjalny wskaźnik wysokiej produkcyjności mięsnej (Zwierzchowski i wsp. 1995). Oprządek 19

Przegląd piśmiennictwa i wsp. (1999) wykazali w swoich badaniach, iż polimorfizm Leu/Val ma wpływ na cechy użytkowości rzeźnej młodego bydła czarno-białego, a mianowicie tusze buhajków o genotypach LL i LV charakteryzowały się wyższą zawartością mięsa, w porównaniu do osobników o genotypie homozygotycznym VV. Zaobserwowano także, że buhajki rozpłodowe o genotypie VV miały istotnie niższe dzienne przyrosty i charakteryzowały się niższą masą ciała aniżeli buhajki o genotypach LL i LV (Chrenek i wsp. 1998). Grochowska i wsp. (1998) badali wpływ polimorfizmu Leu/Val na sekrecję hormonu wzrostu indukowaną przez THR, jednak badacze nie zaobserwowali istotnego związku pomiędzy sekrecją hormonu wzrostu a jego genotypami. W badaniach jakie przeprowadził Yao i wsp. (1996) wykazano także istnienie innego polimorfizmu w eksonie 5 genu hormonu wzrostu, a mianowicie transwersje A C (adenina na cytozynę) w pozycji 2241. Mutacja tą można określić jako mutację cichą ponieważ nie prowadzi ona do zmiany aminokwasu w białku (w obu przypadkach trójka zasad koduje argininę). Na poziomie molekularnym polimorfizm ten można wykryć z zastosowaniem endonukleazy DdeI. Innym także dobrze poznanym polimorfizmem w genie hormonu wzrostu bydła jest polimorfizm zlokalizowany w 3 intronie w pozycji 1547(Zhang i wsp. 1993), polegający na tranzycji C T (Yao i wsp. 1996). Polimorfizm ten zlokalizowany został za pomocą metody hybrydyzacji Southerna z cdna bydła jako sondą (Cowman i wsp. 1989; Hilbert i wsp. 1989). Høj i wsp. (1993) uzyskali natomiast wyniki, które wskazują na to, iż allel MspI(-) genu GH bydła powstał w wyniku insercji tyminy w miejscu +837 oraz substytucji cytozyny w guanine (C T) w pozycji +838. Badania jakie w roku 1993 przeprowadził Høj i wsp. (1993) wykazują jednoznacznie, że istnieją wyraźne różnice pomiędzy częstością występowania alleli u krów, które były poddane selekcji w kierunku wysokiej i niskiej zawartości tłuszczu w mleku. Autorzy zwracają jednak uwagę na to, iż związek allelu MspI(-) z wysoką zawartością tłuszczu w mleku, może być wynikiem dryfu genetycznego, jednak inni badacze także wykazali, pewne asocjacje pomiędzy allelem MspI(-), a cechami użytkowości mlecznej bydła. Falaki i wsp. (1996a) wykazali, że w/w allel genu hormonu wzrostu bydła powiązany jest m.in. z wyższą wydajnością mleczną włoskich krów holsztyńsko-fryzyjskich, 20

Przegląd piśmiennictwa a także wyższą procentową zawartością tłuszczu i białka w mleku. Różnice te jednak nie były statystycznie istotne. Pawar i wsp. (2007) wykazali natomiast, iż genotyp ten wykazuje istotnie statystycznie wpływ na większa wydajność mleczną krów w pierwszej laktacji. Część tych wyników znalazły potwierdzenie w badaniach Lagziel a i wsp. (1996), którzy także wskazali na związek wyższej frekwencji allelu MspI(-) z wyższą procentową zawartością białka w mleku. Badania Lagziel i wsp. (1999) wskazują natomiast na krowy o genotypie heterozygotycznym, jako te, które charakteryzowały się wyższą procentową zawartością białka w mleku. Zaobserwowano także pozytywną korelację pomiędzy allelem MspI(-) genu hormonu wzrostu bydła, a wysoką wydajnością tłuszczu mleka (Lee i wsp. 1993). Wyższa frekwencja tego alleu wstępowała u krów selekcjonowanych w kierunku wysokiej wydajności tłuszczu. Nie brakuje także badań wskazujących na zgoła odmienne wyniki. Yao i wsp. (1996) zaobserwowali, że allel MspI(+) genu hormonu wzrostu bydła wykazywał korzystny wpływ na wydajność mleka, tłuszczu oraz białka mleka (odpowiednio: +300 kg, +8 kg oraz +7 kg). Potwierdzeniem badań Yao i wsp. (1996) mogą być wyniki badań uzyskane przez Sabour i wsp. (1997), którzy zaobserwowali, że genotyp heterozygotyczny występuje z największą frekwencją u buhajów o stosunkowo najniższej wartości hodowlanej odnoszącej się do wydajności mlecznej, co jednocześnie może wskazywać na to, iż wariant MspI (-) odpowiedzialny jest raczej za obniżenie wydajności mlecznej u krów. Zhou i wsp. (2005) badając polimorfizm GH/MspI u pekińskiej rasy holsztyńsko-fryzyjskiej wykazali, że krowy o genotypie AA wykazywały statystycznie większą wydajność mleczną w I laktacji na poziomie P < 0,01, a w II i III na poziomie P < 0,05, podczas gdy osobniki o genotypie heterozygotycznym AB wykazywały większą zawartość tłuszczu w mleku. Osobniki zidentyfikowane jako AA wykazywały także wyższą wydajność białka mleka niż osobniki o genotypie AB oraz produkowały mleko o wyżej procentowej zawartości białka w mleku (tylko w II laktacji). Rezultaty uzyskane przez Zhou i wsp. (2005) pod względem wydajności mlecznej, tłuszczu, białka korespondują z uzyskanymi wynikami badań przeprowadzonych przez Yao i wsp. (1996) oraz Sabour i wsp. (1997), natomiast jeżeli weźmiemy pod uwagę procentową zawartość tłuszczu to są one zbliżone do wyników uzyskanych przez Lee i wsp. (1993), Høj i wsp. (1993) oraz Falaki i wsp. (1996a). 21

Przegląd piśmiennictwa Różne frekwencje alleli GH/MspI w genie hormonu wzrostu bydła u różnych ras mogą wskazywać na różne pochodzenie geograficzne. Najwyższą frekwencją allelu MspI(-) charakteryzuje się bydło pochodzące od Bos indicus, co może wskazywać na to iż allel MspI(-) rozprzestrzenił się z kontynentu a właściwie subkontynentu indyjskiego, dyfundując na bydło Basenu Morza Śródziemnego, Wschodniej Euopy oraz w mniejszym stopniu na bydła Europy Zachodniej oraz Północnej, a także Zachodniej Afryki (Lagziel i wsp. 2000). W regionie 3 flankującym także poszukiwano miejsc polimorficznych, które mogą mieć potencjalny wpływ na cechy produkcyjności bydła. Miejsc tych poszukiwano metodą PCR-RFLP z wykorzystaniem takich enzymów jak: PstI, BglI, TaqI, EcoRI, BamHI, PvuII (Hilbert i wsp. (1989), Cowan i wsp. (1989), Hallermann i wsp. (1987)). Wszystkie przypadki tego polimorfizmu miały związek z delecją około 1000 pz w regionie 3 genu bgh. Falaki i wsp. (1996b) stwierdzili, że polimorfizm GH/TaqI w bydlęcym hormonie wzrostu może być powiązany z cechami produkcyjności mlecznej takimi jak wydajność mleka, zawartość tłuszczu i białka w mleku krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej. Badacze Ci zasugerowali, że osobniki z allelm E charakteryzują się prawdopodobnie obniżoną wartością hodowlaną jaką jest mleczność co jednocześnie sugeruje eliminację tych osobników w selekcji w tym kierunku, faworyzując jednocześnie osobniki z allelami GH A i GH B. Badanie tego polimorfizmu u krów rasy Simmental nie wykazało natomiast podobnych zależności (Falaki i wsp. 1997). Ten sam polimorfizm (bgh/taqi) badali także Rocha i wsp. (1992). Wyniki ich badań wskazują na wyraźną zależność pomiędzy w/w polimorfizmem, a masą ciała cieląt przy urodzeniu. Badacze zidentyfikowali 4 allele, a z pośród nich największy wpływ na masę ciała cieląt miał allel GH A. Cielęta krów o genotypie AA rodziły się o około 4 kg cięższe niż cielęta krów o genotypach BB, CC oraz DD. W rejonie 3 flankującym wykazano także istnienie polimorfizmu RFLP rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny HaeIII, prawdopodobnie w pozycji 2637(Unanian i wsp. 1994). Polimorfizm ten analizowany był także przez Pawar i wsp. (2007), jednak autorzy nie wykazali statystycznie istotnych różnic pomiędzy tym polimorfizmem a cechami użytkowości mlecznej u bydła. 22

Przegląd piśmiennictwa Ciekawe badania mające na celu zidentyfikowanie przyczyny miniaturowego wzrostu u niektórych osobników bydła rasy Brahman przeprowadzili McCormack i wsp. (2009). Badacze porównali sekwencje cdna bydła o normalnych rozmiarach z bydłem miniaturowym i odkryli, że mutacja występująca w pozycji 641 a polegająca na tranzycji cytozyny w tyminę (C T) powoduje także zmianę aminokwasu treoniny w metioninę w pozycji 200 (T200M). Na podstawie analizy restrykcyjnej (PCR- RFLP) z zastosowaniem enzymu restrykcyjnego BsmBI wykazano, iż 12 na 12 miniaturowych osobników rasy Brachman to homozygoty pod względem mutacji, natomiast z 9 osobników normalnych rozmiarów 7 to homozygoty pod względem mutacji pierwotnej, a 2 osobniki to heterozygoty. Wyniki badań jednoznacznie wskazują, że za miniaturowe rozmiary bydła rasy Brachman odpowiedzialna jest mutacja w pozycji 641. Treonina w pozycji 200 jest zatem wymagana do osiągniecią przez tę rasę normalnego wzrostu. 2.9 Polimorfizm regionu 5 flankującego genu hormonu wzrostu bydła Region 5 flankujący genu hormonu wzrostu bydła jest miejscem wysoce polimorficznym i zawiera kilka typowych sekwencji regulatorowych takich jak np. sygnał startu transkrypcji, TATA-box, czy GC box (powtórzone sekwencje GC) - Klauzińska i wsp. (2000). W roku 1996 Hecht i Geldermann wykryli w tym regionie 4 miejsca polimorficzne w pozycjach: -58, -336, - 346, - 396. Niektóre z tych miejsc polimorficznych pokrywają się z potencjalnymi miejscami wiązania czynników transkrypcyjnych takich jak m.in.: PEA3, TRE i C/EBP, autorzy nie badali jednak wypływu w/w polimorfizmów na cechy produkcyjne bydła. W regionie regulatorowym genu hormonu wzrostu bydła opisano także mutację polegająca na delecji lub insercji trójki nukleotydowej (INDELS) 35 AAG 33 znajdującej się w odległości 9 nukleotydów od kasety TATA (Rodrigues i wsp. 1998). Dotychczas polimorfizm ten obserwowano tylko u mięsnych ras bydła. Z kolei Lagziel i Soller (1999) zidentyfikowali w pozycji 502 oraz 591 substytucje polegające na zmianie kolejno: cytozyny na tyminę (C T) oraz guaniny na cytozynę (G T). 23

Przegląd piśmiennictwa Polimorfizm polegający na insercji/delecji sekwencji TGC w pozycji -506/-524 wykazali Yao i wsp. (1996). Mutacja ta nie miała jednak wpływu na wydajność mleczną, ani na skład mleka krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej. Powyższy polimorfizm u krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej odmiany czerwono-białej i czarno-białej badała także Klauzińska i wsp. (2002). Znaleziono oba allele (insercyjny oraz delecyjny) u obu ras, jednak ich frekwencja różniła się istotnie. Mimo iż analiza komputerowa wykazała występowanie w pobliżu w/w mutacji miejsc wiązania dla kilku czynników transkrypcyjnych to jednak w obrębie sekwencji, która podlegała mutacji potencjalne miejsca wiązania tychże czynników nie występowały. Trzy nowe polimorfizmy w regionie 5 flankującym w zidentyfikował Ge i wsp. (2003). Miały one charakter substytucji poszczególnych nukleotydów, i tak: pozycja 253 (C T), pozycja 303 (C T) oraz pozycja 313 (C T) - na podstawie sekwencji zdeponowanej przez Gordona i wsp. (1983). Analiza statystyczna nie wykazała żadnych istotnych powiązań między wymienionymi mutacjami, a stężeniem IGF-1 we krwi badanego bydła mięsnego rasy Angus oraz z cechami wzrostu. SNP w pozycji 253 zlokalizowany jest blisko potencjalnego miejsca wiązania dla czynnika transkrypcyjnego PEA3 (Roth i wps. 1990), natomiast SNP w pozycji 303 jest pierwszym nukleotydem z 6 nukleotydowego miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego TRE (Theil i wsp. 1993). Trzy w/w polimorfizmy znajdują się wewnątrz powtarzającego się elementu SINE/BovA2, co może tłumaczyć dużą zmienność w tym regionie, a jednocześnie może wskazywać na fakt iż rejon ten nie musi być funkcjonalnym elementem promotora genu hormonu wzrostu, dlatego też zmienność w tych powtarzających się elementach może nie mieć bezpośredniego wpływu na ekspresję genu bgh. Na podstawie wcześniej już opisanych w literaturze 6 polimorfizmów (w tym 3 znajdujących się w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła w pozycjach 303, 502, 591, po jednym w intronie 1 w pozycji 800, intronie 3 w pozycji 1692 oraz eksonie 5 w pozycji 2291) Meade i wsp. (2005) za pomocą techniki PCR-ACRS, zidentyfikowali poszczególne genotypy za pomocą enzymów restrykcyjnych (HaeIII, RsaI, PmlI, Hpy188I oraz BstNI) demonstrując jednocześnie, iż technika ACRS-SNP może być bardzo dobrym narzędziem do tworzenia haplotypów dla hormonu wzrostu w populacji bydła Bos taurus. 24

Przegląd piśmiennictwa W pozycji 120 w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła rasy koreańskiego Hanwoo, zaobserwowano tranzycję C T rozpoznawaną za pomocą enzymu restrykcyjnego DraI (Kim i wsp. 2004). Wykazano, iż polimorfizm ten znacząco wpływa na EBV(Estimate Breeding Value szacunkowa wartość hodowlana) w przypadku masy ciaqła krów w 3 miesiącu życia. Osobniki o genotypie BB były cięższe w porównaniu z osobnikami o pozostałych genotypach. Jednocześnie nie wykazano żadnych statystycznie istotnych różnic w genotypach na inne cechy tuszy takie jak np. grubość słoniny, obszar najdłuszego mięśnia oraz marmurkowatość. Ferraz i wsp. (2006) przeanalizowali region 5 flankujący, pierwszy ekson oraz część pierwszego intronu genu hormonu wzrostu bydła i zidentyfikowali sześć nowych polimorfizmów (1 INDEL i 5 SNP), które mogą być potraktowane jako markery molekularne w dalszych badaniach genetycznych. Analizowany fragment porównano z sekwencjami zdeponowanymi w GenBanku przez Gordona i wsp. (1983)(M57764) oraz Ge i wsp. (2003)(AF18837). Badacze zaobserwowali 3 SNP w pozycjach -482, -449 oraz -447 (wg M57764) z których dwa (-482, -449) zostały wcześniej opisane przez Hecht i Geldermann (1996) natomiast insrecja nukleotydu C w pozycji -447 nie była wcześniej opublikowana. Trzy kolejne polimorfizmy zaobserwowane w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła dotyczyły tranzycji C T (pozycja -473), tranzycji G A (pozycja -442) oraz transwersji G A (pozycja -288) i nie były one wcześniej zdeponowane w GenBanku, dlatego należy uznać je jako nowe polimorfizmy w regionie 5 flankującym genu bgh. Zidentyfikowano także dwie tranzycje C T w pozycjach (-396, -346), a także delecję AAG między nukleotydami - 33 a -29. Pięć mutacji (5 SNP oraz 1 delecja) zidentyfikowano w regionie 5 flankującym genu bgh bydła Bos indicus (Sami i wsp. 2011). Kolejne 3 SNP autorzy zidentyfikowali pomiędzy eksonem 1 oraz eksonem 2 (G T w pozycji 325, C T w pozycji 378, G C w pozycji 393). 25

Przegląd piśmiennictwa Tabela1. Mutacje zidentyfikowane w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła Bos indicus (Sami i wsp. 2011) Lp. Pozycja SNP Tranzycja/Transwersja 1 80 G A Tranzycja 2 95 T C Tranzycja 3 126 T A Transwersja 4 139 C A Tranzycja 5 146 C G Transwersja 9 Delecja 205-207 Delecja AGA Delecja 26

Cel pracy 3. CEL PRACY Wiele przeprowadzonych badań i doświadczeń udowodniło, iż hormon wzrostu ssaków jest głównym regulatorem odpowiedzialnym za wzrost i metabolizm organizmu, a co za tym idzie także za tempo wzrostu organizmu, budowę ciała, zdrowie, produkcję mleka a także za starzenie się poprzez wpływ na ekspresję wielu innych genów (Sumantran i wsp. 1992; Ho i Hoffman, 1993; Lincoln i wsp. 1995). Region 5 flankujący genu hormonu wzrostu bydła to obszar wysoce polimorficzny w obrębie, którego znajduje się wiele miejsc strategicznych dla ekspresji genu takich jak choćby potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych dlatego celem niniejszej pracy jest: - detekcja mutacji w regionie 5 flankującym i trzecim intronie genu hormonu wzrostu bydła, - wykrycie nowych mutacji w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła, - ustalenie struktury genetycznej stada bydła rasy polskiej holsztyńsko-fryzyjskiej odmiany czarno-białej, - ustalenie wpływu polimorfizmu GH/PmlI, GH/MvaI, GH/BsuRI i GH/RsaI na zmienność cech charakteryzujących użytkowość mleczną badanego stada krów. 27

Materiał i metody 4. MATERIAŁ I METODY 4.1 Materiał badawczy Materiał badawczy stanowiło stado 1043 krów rasy polskiej holsztyńskofryzyjskiej odmiany czarno - białej pochodzące z jednego stada zarodowego znajdującego się na terenie województwa lubuskiego. Dane o użytkowości mlecznej badanych zwierząt pochodziły z dokumentacji prowadzonej w ramach oceny wartości użytkowej i hodowlanej krów tego stada gromadzonych i opracowywanych przez Zakład Elektronicznej Techniki Obliczeniowej Spółka z Ograniczoną Odpowiedzialnością w Olsztynie. W tabelach 2 i 3 przedstawiono charakterystykę użytkowości analizowanego stada za ostatnie pięć lat użytkowania przedstawiając średnie roczne wartości analizowanych cech mleczności oraz wartości średnie analizowanych cech mleczności w czterech pierwszych laktacjach. Tabela 2. Charakterystyka analizowanego stada krów wartości średnie roczne analizowanych cech mleczności stada w latach 2006-2010 Rok oceny Liczba krów Wydajność mleka [kg] Wydajność [kg] Zawartość [%] Wydajność [kg] Zawartość [%] Tłuszcz Białko Wiek pierwszego wycielenia [dni] Okres międzywycieleniowy [dni] 2006 1020 9988 396 3,96 341 3,41 786 396 2007 1076 9787 379 3,87 338 3,45 767 404 2008 1062 10218 390 3,81 348 3,40 768 412 2009 1043 10733 416 3,86 363 3,37 794 414 2010 1051 10139 391 3,85 341 3,37 799 412 28

Materiał i metody Tabela 3. Charakterystyka analizowanego stada krów w kolejnych laktacjach wartości średnie analizowanych cech za lata użytkowania 2006-2010 Rok oceny Liczba krów Wydajność mleka [kg] Laktacja Wydajność [kg] Tłuszcz Zawartość [%] Wydajność [kg] Białko Zawartość [%] 2006 180 9134 352,6 3,86 312,2 3,42 2007 285 9180 350,4 3,82 319,3 3,48 I 2008 200 9399 341,3 3,63 319,2 3,40 2009 227 10130 3702 3,65 341,6 3,37 2010 255 9669 365,8 3,78 325,4 3,37 2006 132 10261 411,1 4,01 349,4 3,41 2007 176 9976 378,7 3,80 345,3 3,46 II 2008 226 10752 407,9 3,79 368,5 3,43 2009 184 11239 426,2 3,79 378,0 3,36 2010 209 10758 402,7 3,74 358,1 3,33 2006 233 10508 422,1 4,02 358,1 3,41 2007 125 10451 409,2 3,92 358,4 3,43 III 2008 127 10647 411,6 3,87 363,8 3,42 2009 192 11225 443,6 3,95 381,0 3,39 2010 145 10667 409,4 3,84 361,1 3,39 2006 285 9975 394,3 3,95 340,0 3,41 2007 361 9943 390,7 3,93 342,2 3,44 IV 2008 331 10183 397,6 3,90 344,1 3,38 2009 254 10669 427,1 4,00 358,6 3,36 2010 286 9840 394,3 4,01 333,3 3,39 29

Materiał i metody 4.2 Izolacja DNA Od każdego osobnika stada pobierano krew obwodową z żyły jarzmowej w ilości około 3 ml. Każda probówka, do której pobrano krew, zawierała czynnik antykoagulacyjny K 3 EDTA. Izolację DNA przeprowadzono za pomocą specjalistycznego zestawu do izolacji DNA MasterPure TM firmy Epicentre, według protokołu dołączonego do wyżej wymienionego zestawu. Tak wyizolowane i oczyszczone DNA zawieszano w buforze TE, w skład którego wchodziło: 10 mm Tris HCl; 1 mm EDTA; ph 8,0. DNA przechowywano w lodówce w temperaturze 4 C. 4.3 Oznaczenie genotypów Oznaczanie genotypów każdego osobnika przeprowadzono za pomocą metody ACRS PCR-RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction Amplification Created Restriction Sites Restriction Fragment Length Polymorphism). Pierwsze trzy miejsca polimorficzne (GH/BsuRI, GH/RsaI oraz GH/PmlI) zlokalizowane są w regionie 5 flankującym genu hormonu wzrostu bydła, natomiast czwarte miejsce polimorficzne zlokalizowane jest w 3 intronie tego genu (GH/MvaI) - Meade i wsp. (2005): 1) bgh/bsuri Polimorfizm zlokalizowany w pozycji 303 regionu 5 flankujacego genu hormonu wzrostu bydła, który rozpoznawany jest za pomocą enzymu restrykcyjnego BsuRI ( 5 GG CC 3 ) i polegaj on na tranzycji cytozyny w tyminę (C T). Fragment genu hormonu wzrostu wielkości 102 par zasad (pz) uzyskiwano poprzez ograniczenie sekwencji nukleotydowej następującymi sekwencjami starterowymi: F: 5 - AGTGAAAGTGAAGTCACTCAGTTGTGGC - 3 R: 5 - AGGTAGCAGAAGCGAGGAGAA - 3 Temperatura przyłączania starterów (Tm) wynosiła 58 C. 30