Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Porównanie budowy komórki roślinnej i zwierzęcej Najmniejszym elementem Ŝywego organizmu, którego organizacja umoŝliwia dokonywanie się pełnej przemiany materii, jest komórka. Wprawdzie między komórkami róŝnych organizmów, a nawet róŝnych tkanek jednego organizmu, występują znaczne róŝnice, jednak wszystkie komórki wykazują podstawowe wspólne cechy budowy i zawierają typowe twory podkomórkowe, pełniące określone funkcje biochemiczne. Jak wynika z obrazu widzianego w mikroskopie optycznym, komórka, bez względu na pochodzenie, stanowi otoczony błoną twór wypełniony cytoplazmą, w której zawieszone są organelle. PoniŜej zamieszczono uproszczony! opis waŝniejszych struktur komórkowych charakterystycznych dla komórek roślinnych i zwierzęcych. Opis ten ma jedynie pomóc Studentom w usystematyzowaniu wiedzy zdobytej na wykładach z biologii komórki, biochemii oraz kultur tkankowych i komórkowych roślin i zwierząt. 1. Budowa komórki roślinnej i zwierzęcej. a. Jądro komórkowe jest organellą zawierającą informację genetyczną odpowiedzialną za regulację metabolizmu, wzrostu i róŝnicowania się komórki. Materiał genetyczny zawarty w podstawowym, haploidalnym zespole chromosomów określa się jako genom jądrowy. Jądro komórkowe połoŝone jest zwykle w centralnej części komórki i w zaleŝności od jej typu posiada kształt kulisty, owalny lub soczewkowaty. Jądro występuje w zasadzie jako pojedyncza organella, choć istnieją komórki, które w pewnym okresie swego Ŝycia są pozbawione jądra (np.: dojrzałe erytrocyty) lub takie które zawierają więcej niŝ jedno np.: dwujądrowe komórki wątroby czy wielojądrzaste włókna mięśni szkieletowych. Jądro komórkowe składa się z macierzy jądrowej zwanej nukleoplazmą, chromatyny jądrowej oraz jąderka. W interfazie jądro komórkowe osłonięte jest dwiema błonami tworzącymi specyficzną otoczkę. Zewnętrzna błona otoczki jądrowej połączona jest z błoną retikulum endoplazmatycznego (ER), a na jej powierzchni od strony cytoplazmy mogą znajdować się rybosomy. Błony zewnętrzna i wewnętrzna łączą się ze sobą w miejscu oktagonalnych kompleksów porowych, złoŝonych z ponad stu róŝnych białek. Pory jądrowe umoŝliwiają szybką wymianę mrna, podjednostek rybosomów, czynników transkrypcyjnych czy jonów pomiędzy przedziałem jądrowym a światłem siateczki śródplazmatycznej lub cytozolem. Macierz jądrowa jest roztworem białek, cukrów, jonów i nukleotydów, w którym zawieszona jest chromatyna, jąderko oraz białkowy szkielet utrzymujący kształt jądra i usztywniający osłonkę jądrową. Chromatyna jądrowa zbudowana jest z helikalnie splecionej nici DNA związanej z białkami histonowymi i niehistonowymi. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom, złoŝony z ośmiu białek histonowych, wokół których owinięta jest cząsteczka DNA o
długości 166-200 par zasad. Pomiędzy nukleosomami znajdują się łącznikowe odcinki DNA o długości od 10 do 95 par zasad. Nić nukleosomowa splata się wokół siebie formując solenoid, czyli tzw. właściwe włókno chromatynowe, które następnie wytwarza pętle wyŝszego rzędu, tzw. domeny mogące ulegać dalszej kondensacji. Z uwagi na organizację strukturalną i funkcje wyróŝnia się dwa rodzaje chromatyny: luźną euchromatynę, złoŝoną z całkowicie rozwiniętych odcinków chromosomów i czynną transkrypcyjnie, oraz skondensowaną heterochromatynę, nie posiadającą odcinków kodujących. W cyklu komórkowym jądro podlega złoŝonym przemianom, które odbywają się w dwóch okresach: okresie podziału, kiedy chromatyna ulega kondensacji w chromosomy podziałowe, i w okresie interfazy, kiedy jądro się nie dzieli. Podział chromatyny i jej rozdzielenie do jąder potomnych następuje na drodze mitozy lub mejozy. Wewnątrz jądra komórkowego znajduje się jąderko będące nieobłonionym, gęstym, kulistym ciałem zawierającym RNA oraz białka. W jąderku zachodzi synteza prekursorowego rybosomowego RNA, a następnie formowanie podjednostek tworzących rybosomy. Wielkość jąderek zaleŝy od stopnia zaangaŝowania komórek w syntezę białek stąd teŝ jądra komórek intensywnie syntetyzujących białka cechują się obecnością duŝych jąderek, których objętość moŝe dochodzić do 25% objętości jądra. b. Plastydy typowe organelle komórek roślinnych, częściowo niezaleŝne od informacji genetycznej jądra komórkowego. Organelle te pojawiły się w komórce w wyniku endosymbiozy sinic, przy czym w toku ewolucji oprócz cech typowych dla endosymbionta, uzyskały równieŝ cechy swoiste dla plastydów. W dojrzałej roślinie wyróŝnia się plastydy fotosyntetyzujące - chloroplasty oraz plastydy niefotosyntetyzujące m.in. chromoplasty, leukoplasty i amyloplasty. Wszystkie typy plastydów zawierają dwie błony tworzące otoczkę, która ogranicza wnętrze plastydu, zwane stromą. W stromie kaŝdego plastydu zwykle znajdują się m.in. tylakoidy (spłaszczone cysterny zawierające np. u chloroplastów barwniki fotosyntetyczne), rybosomy, obszary nukleoidopodobne z plastydowym DNA oraz ziarna skrobii. Chloroplasty to dyskowate twory, w których wyróŝnia się dwa rodzaje tylakoidów tylakoidy gran z chlorofilem oraz tylakoidy stromy. Oprócz fotosyntezy, chloroplasty odpowiadają za metabolizm skrobi, syntezę kwasów tłuszczowych, lipidów, asymilację amoniaku czy pewne etapy szlaku syntezy glicerololipidów. Chromoplasty zawierają znaczne ilości barwników karotenoidowych takich jak Ŝółty ksantofil czy pomarańczowy karoten. Plastydy te występują w komórkach roślin w postaci okrągłych ciałek lub nieregularnych płytek i kryształów. Są one aktywne metabolicznie, zdolne do podziału, biosyntezy kwasów tłuszczowych i karotenoidów, zwłaszcza β-karotenu. Chromoplasty nadają barwę kwiatom, owocom oraz korzeniom roślin. Leukoplasty, to niewielkie, bezbarwne plastydy, występujące w pobliŝu jądra wyspecjalizowanych funkcjonalnie komórek, np. włosków epidermy. Ich podstawową funkcją jest synteza monoterpenów czy teŝ kwasów tłuszczowych, niezbędnych do tworzenia wspomnianych włosków. Amyloplasty to sferyczne plastydy, zawierające w stromie jedno, bądź kilka duŝych ziaren skrobi. Główną funkcją amyloplastów jest synteza i akumulacja skrobi zapasowej. c. Mitochondria organelle zbudowane z dwóch systemów błon ograniczających jego wnętrze, określane jako macierz mitochondrialna (matrix mitochondrialis). Błona zewnętrzna mitochondrium nie leŝy bezpośrednio na błonie wewnętrznej, ale jest od niej oddzielona wąską przestrzenią międzybłonową. Błona wewnętrzna wytwarza róŝnej długości fałdy, grzebienie mitochondrialne, które wystając do macierzy mitochondrialnej mogą się układać podłuŝnie,
prostopadle do osi organelli lub promieniście. Mitochondria stanowią centra energetyczne komórki, przekształcając energię zmagazynowaną w materiałach zapasowych, takich jak sacharydy, w adenozynotrifosforan (ATP). Stąd liczba mitochondriów w komórce eukariotycznej jest zazwyczaj proporcjonalna do zapotrzebowania energetycznego oraz intensywności metabolizmu tlenowego komórki. Matriks mitochondrialna zawiera kompletne systemy enzymów cyklu kwasów trikarboksylowych (cyklu Krebsa), enzymy przetwarzające pirogronian (końcowy produkt glikolizy) w acetylokoenzym A. W matriks znajdują się równieŝ enzymy przekształcające kwasy tłuszczowe i aminokwasy do acetylokoenzymu A. W odróŝnieniu od innych organelli komórkowych, mitochondria posiadają własny unikatowy DNA, który róŝni się od DNA jądrowego i zawiera geny specyficzne dla mitochondriów. Za translację mitochondrialnego mrna na białko odpowiadają rybosomy mitochondrialne, przy czym kod mitochondrialny wyznaczający swoiste aminokwasy jest nieco zmieniony w stosunku do kodu jądrowego zmianie ulega np. kodon stop. Typowe mitochondria dzielą się co najmniej raz w czasie cyklu komórkowego, po wcześniejszej replikacji DNA zachodzącej w czasie interfazy, przy czym sam podział rozpoczyna się od szczeliny podziałowej wytworzonej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. d. Siateczka śródplazmatyczna (retikulum plazmatyczne, ER) jest zbiorem kanalików i cystern zamkniętych błoną, które rozciągają się na duŝym obszarze cytoplazmy wszystkich komórek eukariotycznych. W siateczce śródplazmatycznej zachodzą liczne procesy biosyntezy, a błona ER uczestniczy w tworzeniu komórkowych błon plazmatycznych, aparatów Golgiego, błon lizosomalnych, pęcherzyków wydzielniczych czy endosomów. Siateczka śródplazmatyczna występuje w dwóch formach odznaczających się odmiennym działaniem, tzw. gładkiej siateczki śródplazmatycznej (smooth endoplasmic reticulum, SER) oraz szorstkiej siateczki śródplazmatycznej (rough endoplasmic reticulum, RER). SER jest miejscem biosyntezy wielu rodzajów lipidów: triglicerydów, glikolipidów, fosfolipidów, cholesterolu oraz jest głównym przedziałem wewnątrzkomórkowego gromadzenia się wapnia. W SER powstaje takŝe rodzina enzymów detoksykacyjnych cytochromu P450, przy czym w zaleŝności od sygnałów środowiska, enzymy w SER są szybko syntetyzowane i degradowane. Szorstka siateczka śródplazmatyczna występuje w formie długich cystern, pokrytych od zewnątrz licznymi rybosomami. Błona budująca cysterny RER oddziela ich treść od cytoplazmy i łączy się z zewnętrzną błoną osłonki jądrowej. Światło kanałów RER jest miejscem, w którym zachodzi synteza i modyfikacja białek eksportowych, czemu sprzyjają przebiegające tam procesy potranslacyjnej obróbki białek, jak: glikozylacja, formowanie połączeń dwusiarczkowych, fałdowanie łańcucha polipeptydowego i oligomeryzacja w podjednostki białkowe. Jeśli powyŝsze etapy nie zachodzą dokładnie, białko nie wychodzi ze światła ER. e. Aparat Golgiego składa się z wielu płaskich błoniastych cystern ułoŝonych w stos, jedna nad drugą, i rozdętych pęcherzykowato przy końcach. Cysterny połączone są z szeregiem róŝnej wielkości pęcherzyków gładkich lub pokrytych białkiem. Aparat Golgiego jest strukturalnie i funkcjonalnie spolaryzowany cysterny leŝące w bliskim sąsiedztwie szorstkiego retikulum endoplazmatycznego określane są jako powierzchnia cis, tuŝ za nią znajdują się cysterny powierzchni środkowej, a miejsce z którego pęcherzyki transportowe pączkują nazywane jest powierzchnią trans. Aparat Golgiego pełni w komórce wiele podstawowych funkcji związanych z procesem potranslacyjnej modyfikacji białek i lipidów przeznaczonych do eksportu, a szczególnie procesem modyfikacji domen cukrowych uprzednio przyłączonych w
retikulum endoplazmatycznym. Aparat Golgiego, ponadto, bierze udział w syntezie składników ścian komórek roślinnych, w sortowaniu i pakowaniu produktów eksportowych, formowaniu błony komórkowej oraz procesie jej odzysku. Nowo syntetyzowana błona i białka wydzielnicze, podobnie jak lipidy błonowe, które są glikolozowane, opuszczając retikulum endoplazmatyczne wchodzą do aparatu Golgiego przez powierzchnię cis, przesuwają się przez stos Golgiego i opuszczają aparat przez kanaliki i pęcherzyki tworzące sieć trans. W tym czasie przechodzą szereg modyfikacji, których przerwanie lub zmiana moŝe mieć swoje implikacje kliniczne. f. lizosomy to główne organelle trawienne komórki, otoczone pojedynczą błoną komórkową, które zawierają specyficzne hydrolazy degradujące białka, lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe. Jedną z charakterystycznych cech lizosomów jest niski odczyn ich wnętrza (ph 5,0), utrzymywany przez zaleŝną od ATP pompę protonową, generującą duŝe stęŝenie protonów we wnętrzu lizosomu. StęŜenie protonów we wnętrzu lizosomów jest ok. 100 razy większe niŝ w otaczającej je cytoplazmie, co zapewnia niezbędne środowisko dla poprawnego funkcjonowania lizosomalnych hydrolaz. Co istotne, gdy dochodzi do mechanicznego uszkodzenia lizosomów, ich zawartość miesza się z cytozolem (ph 7,2 7,3), co powoduje iŝ aktywność lityczna hydrolaz natychmiast zanika, nie zagraŝając składnikom cytoplazmy. Wśród enzymów lizosomalnych znajdują się m.in.: rybonukleaza (trawi RNA), deoksyrybonukleaza (trawi DNA), glikozydaza (rozkłada węglowodany, glikozydy, polisacharydy), fosfataza kwaśna (estry fosforanowe), katepsyny (białka), lipazy (tłuszcze). Import materiałów do lizosomów, które tam ulegają trawieniu, odbywa się na drodze: endocytozy - formowaniu pęcherzyków endocytarnych wokół małych cząstek i płynów; autofagii pochłonięciu i strawieniu całych dysfunkcjonalnych organelli; fagocytozy pochłanianiu większych cząstek, jak bakterie. g. wakuole system wakuolarny, zróŝnicowany co do wielkości, występuje w komórkach roślinnych i zwierzęcych. W wyspecjalizowanej komórce roślinnej znajduje się najczęściej jedna duŝa wakuola; w komórce zwierzęcej - cały system drobnych wakuol o niewielkich rozmiarach. Wnętrze wakuoli, otoczone pojedynczą błoną, wypełnia woda wraz z substancjami nieorganicznymi, organicznymi (metabolity pośrednie i wtórne) oraz substancjami zapasowymi (białka, polisacharydy i tłuszcze). Skład soku komórkowego zaleŝy od pochodzenia komórek oraz stanu ich metabolizmu. WaŜną grupę związków soku wakuolarnego stanowią wspomniane metabolity wtórne, których praktyczne znaczenie wynika z ich właściwości leczniczych oraz z szerokiego wykorzystania przemysłowego. Do najwaŝniejszych grup związków naleŝą: glikozydy antocyjanowe, glikozydy flawonowe, alkaloidy (nikotyna, kokaina, strychnina) oraz garbniki (pochodne wielofenoli). h. cytoplazma uznawana jest za swego rodzaju dwuskładnikowy koloid białkowowodny, duŝych i małych cząsteczek, w którym zawieszone są organelle komórkowe i który zajmuje największą objętościowo część komórki. Cytoplazma podstawowa jest fazą wodną komórki z rozpuszczonymi w niej składnikami takimi jak: kwasy tłuszczowe, białka, aminokwasy, węglowodany, nukleotydy, związki mineralne. Cytoplazma w pobliŝu błony komórkowej jest bardziej sztywna, natomiast jej część wewnętrzna jest zwykle płynna. W macierzy cytoplazmatycznej wyróŝnia się 3 rodzaje białek włóknistych o zróŝnicowanej budowie, składzie chemicznym oraz funkcjach, które tworzą cytoszkielet komórki; są to: mikrotubule, filamenty i mikrofilamenty.
i. ściana komórkowa oprócz plastydów, stanowi najbardziej charakterystyczny wyróŝnik komórek roślinnych. Jest to wysoce zorganizowany materiał kompozytowy, złoŝony z wielu typów makrocząsteczek. Ściana komórkowa jest syntetyzowana przez protoplast i odkładana w postaci zróŝnicowanych pod względem chemicznym warstw po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Ściana komórkowa wraz z błoną komórkową i cytoszkieletem, stanowi część strukturalnego i funkcjonalnego kontinuum przenikającego kaŝdą komórkę rośliny. Ściana komórkowa kontroluje kształt i powiększanie się komórek, wpływa na transport międzykomórkowy, jest szlakiem transportu i źródłem cząsteczek sygnałowych jak hormony peptydowe, tlenek azotu czy reaktywne formy tlenu, bierze udział w reakcjach roślin na warunki środowiska oraz pojawiające się inne organizmy. W skład ściany komórkowej wchodzą: matriks (substancje podłoŝa pektyny, hemicelulozy, glikoproteiny), zrąb (substancje szkieletowe celuloza, ksylany, chityna), substancje inkrustujące (ligniny, krzemionka, węglan wapnia), substancje adkrustujące (lipidy kutyna, suberyna, woski; polisacharydy śluzy, gumy). Wzajemne kontaktowanie się Ŝywych protoplastów sąsiadujących ze sobą komórek umoŝliwiają pory w ścianach komórkowych, przez które przenikają pasma cytoplazmy tzw. plazmodesmy. 2. Obserwacja komórek roślinnych i zwierzęcych przy uŝyciu mikroskopu świetlnego. 2.1. Budowa mikroskopu świetlnego zasady mikroskopowania. W kaŝdym mikroskopie świetlnym moŝna wyróŝnić układ mechaniczny oraz optyczny. Częściami mechanicznymi mikroskopu są: statyw, tubus z urządzeniem rewolwerowym do wkręcania obiektywów o róŝnym powiększeniu oraz stolik przedmiotowy. W statywie mikroskopu mieści się śruba makro- i mikrometryczna, które słuŝą do przesuwania tubusa bądź stolika przedmiotowego przy nastawianiu ostrości obrazu w mikroskopie. Układ optyczny mikroskopu składa się z układu powiększającego (obiektyw, okular) i układu oświetlającego (Ŝarówka bądź lusterko oraz kondensor). Obiektyw najistotniejsza część mikroskopu, jest zbiorem soczewek sklejonych ze sobą. Obiektyw tworzy obraz rzeczywisty, odwrócony i powiększony. Obiektywy o powiększeniu 100- krotnym i większym określane są jako obiektywy immersyjne. Oglądając preparaty z uŝyciem takich obiektywów przestrzeń między soczewką czołową obiektywu a szkiełkiem nakrywkowym naleŝy wypełnić cieczą immersyjną o duŝym współczynniku załamania światła (większym od 1). Zastosowanie immersji usuwa zjawisko załamywania się promieni świetlnych przy przechodzeniu ze środowiska optycznie gęstszego (szkło) do środowiska rzadszego (powietrze), co powoduje zaciemnienie pola widzenia. Okular mikroskopu, złoŝony jest z dwóch płasko-wypukłych soczewek, z których górna powiększa obraz utworzony przez obiektyw, dolna natomiast zwiększa pole widzenia. Okular tworzy obraz powiększony, urojony i prosty. Łącznie, układ okular obiektyw daje obraz odwrócony, jaki powstał w wyniku działania obiektywu. W uproszczeniu, powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i obiektywu. O przydatności mikroskopu do badań w duŝej mierze decyduje jego rozdzielczość. Zdolność rozdzielcza mikroskopu to najmniejsza odległość między dwoma punktami preparatu, które dostrzegane są jeszcze oddzielnie. Odległość ta musi mieć wymiar równy co najmniej długości fali światła uŝytego do oświetlenia preparatu. W przypadku światła widzialnego granica ta wynosi 0,5 µm.
2.2. Preparaty mikroskopowe. Preparaty mikroskopowe moŝna podzielić na bezpośrednie (przyŝyciowe), sporządzone w celu obserwacji kształtu, ruchu jak i ilości Ŝywych komórek oraz na preparaty utrwalone, wykorzystywane do dalszego barwienia w celu uwidocznienia poszczególnych organelli komórkowych. Najlepsze wyniki obserwacji komórek daje analiza materiału Ŝywego. Takie obserwacje są podstawą większości ćwiczeń opisanych w niniejszym rozdziale skryptu. W przypadku hodowli kultur jednokomórkowych przenoszone są one na szkiełko podstawowe za pomocą pipety pasterowskiej, ezy bądź igły preparacyjnej. Roślinne hodowle tkankowe naleŝy przygotować do obserwacji przez pocięcie tkanki na cienkie skrawki przy uŝyciu Ŝyletki lub skalpela. Skrawki przenosi się za pomocą pęset bądź igieł preparacyjnych na szkiełko podstawowe i dodaje kroplę wody. W celu uzyskania jednej warstwy komórek wykonuje się preparaty gniecione. Preparaty takie najczęściej wykonuje się z wierzchołków korzeni i pędów, których mały fragment (około 1 mm) umieszcza się na szkiełku podstawowym w kropli wody lub 50% glicerolu (preparat wówczas wolniej wysycha) i nakrywa szkiełkiem nakrywkowym. Następnie, uŝywając tępego końca igły preparacyjnej, uderza się delikatnie w szkiełko nakrywkowe, aŝ do otrzymania moŝliwie największego obszaru z jedną warstwą komórek. Uwaga: Materiały takie jak: marchew, ziemniak, cebula, banan, gruszka, pomidor przynoszą na zajęcia Studenci. MoŜna dodatkowo przynieść inne niŝ wymienione obiekty do badań, z których uda się przygotować ciekawe preparaty mikroskopowe. Pomysły mile widziane. Ćwiczenie 1 Obserwacja komórek przy róŝnym powiększeniach Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60, mysiej białaczki L1210, komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29. Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, pipety automatyczne. Zawiesinę komórek ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60, mysiej białaczki L1210 lub komórek ludzkiego raka jelita grubego HT29 nanieść przy uŝyciu pipety automatycznej na oczyszczone alkoholem etylowym szkiełko podstawowe i nakryć szkiełkiem nakrywkowym (aby uniknąć pęcherzyków powietrza utrudniających obserwację, naleŝy przykładać szkiełko nakrywkowe pod kątem 45 i powoli opuszczać je na kroplę zawiesiny komórek). Obserwować komórki przy powiększeniu obiektywu 40x, a następnie przy powiększeniu 100x (naleŝy pamiętać o wypełnieniu przestrzeni między obiektywem a szkiełkiem mikroskopowym olejkiem immersyjnym). Porównać komórki z wybranych linii komórek nowotworowych pod względem kształtu oraz wielkości. Wykonać rysunek.
Ćwiczenie 2 Barwienie przyŝyciowe komórek nowotworowych Celem takiego barwienia jest odróŝnienie komórek Ŝywych od martwych. Proces barwienia tkanek czy komórek ma charakter fizykochemiczny i polega na adsorpcji barwnika na ścianie komórkowej lub jego dyfuzji do wnętrza komórki. W barwieniu stosuje się najczęściej barwniki zasadowe (sole, w których jonem barwnym jest kation np.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny), wykorzystując ich powinowactwo do składników komórek (mających odczyn kwaśny). Cechą charakterystyczną barwników przyŝyciowych jest ich niska toksyczność w stosunku do barwionych komórek. Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60. Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, probówki Eppendorfa, pipety automatyczne, worteks. Odczynniki 0,04% wodny roztwór błękitu metylenowego. Pobrać do probówki Eppendorfa 0,5 ml zawiesiny komórek ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60. Dodać 20 µl roztworu błękitu metylenowego. Całość wymieszać na worteksie i po 10 minutach nanieść kroplę zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe. Przy powiększeniu 40x zaobserwować stosunek komórek Ŝywych do martwych. Wykonać rysunek. Wyjaśnić, dlaczego komórki martwe barwią się, natomiast komórki Ŝywe pozostają bezbarwne. Ćwiczenie 3 Barwienie preparatów utrwalonych komórek nowotworowych Konieczność stosowania materiału utrwalonego w cytologii jest podyktowana duŝą toksycznością specyficznych barwników i odczynników oraz niebezpieczeństwem zniekształceń, powstałych w trakcie niekontrolowanego zamierania komórek. Utrwalenie materiału ma na celu bardzo szybkie zabicie komórek z zachowaniem struktur komórkowych w stanie jak najmniej zmienionym w porównaniu z komórką Ŝywą. Dobry utrwalacz składa się ze środka utrwalającego i nośnika zapewniającego stałe ph w trakcie utrwalania oraz odpowiedni skład jonowy aby nie dopuścić do wytrącania i ekstrakcji materiału. Do prostych utrwalaczy zaliczane są: alkohol etylowy, aceton, kwas octowy czy aldehyd glutarowy. Utrwalacze złoŝone to np. płyn Carnoy a cechujący się szybką penetracją komórki, korzystnym wpływem na ich morfologię oraz barwliwość chromosomów. Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełkach nakrywkowych. Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, komory do barwienia, szalki Petriego, pęseta, pipety automatyczne. Odczynniki Utrwalacz Carnoy a: alkohol metylowy i lodowaty kwas octowy zmieszane w stosunku objętościowym 3:1 1% kwas octowy
Woda destylowana Barwnik Giemsa (rozcieńczony wodą destylowaną 1:20) 50%, 70%, 80%, 90% alkohol etylowy Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełku nakrywkowym, utrwalić w płynie Carnoy a połoŝyć preparat na szalce Petriego, zalać utrwalaczem i pozostawić na 15 minut. Następnie, w celu uwodnienia, trzymając pęsetą szkiełko nakrywkowe, przeprowadzić preparat w ciągu 30 sekund przez szereg alkoholowy: 80%, 70%, 50% alkohol etylowy, wodę destylowaną do 1% kwasu octowego. Preparat barwić w wodnym roztworze barwnika Giemsa przez 5 minut, płukać wodą destylowaną przez 1-2 minuty, zanurzyć w 90% alkoholu etylowym. Po wysuszeniu, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować w mikroskopie świetlnym. Wykonać rysunek i opisać uzyskane wyniki, wskazując miejsce występowania w komórce DNA. Ćwiczenie 4 Obserwacja kształtów komórek Liść aloesu, owoc gruszki Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety automatyczne 1. Przy pomocy skalpela przygotować skrawek z przekroju poprzecznego liścia aloesu, umieścić go w kropli wody i obserwować pod mikroskopem typowe komórki miękiszowe. Im cieńszy skrawek, tym więcej promieni świetlnych przepuszcza, wskutek czego obraz badanego przedmiotu jest wyraźniejszy i dokładniejszy. Przez odpowiednie ruchy szkiełkiem nakrywkowym naleŝy usunąć z powierzchni skrawka banieczki powietrza, powodujące zaciemnienie obrazu. Wykonać rysunek komórek miękiszowych. 2. Ze środka owocu gruszy pobrać skalpelem niewielką ilość miąŝszu i dokładnie zmiaŝdŝyć go na szkiełku podstawowym. Nanieść kroplę wody destylowanej i nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Odszukać w preparacie skupiska komórek kamiennych, wykonać rysunek i opisać ich funkcję. Ćwiczenie 5 Obserwacje wybranych organelli komórkowych Cebula, liść aloesu, liść trzykrotki, marchew, pomidor Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety automatyczne 1. Obserwacje jądra komórkowego. Cebulę pokroić skalpelem na ćwiartki, wyjąć jedną łuskę spichrzową i naciąć jej wklęsłą powierzchnię formując kwadrat o boku ok. 2 mm. Za pomocą pesety zdjąć wycięty kwadrat
skórki, przenieść go na szkiełko podstawowe do kropli wody i nakryć szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować wakuole, jądro i jąderko. Wykonać rysunek. 2. Obserwacje plastydów. 2.a. Przygotować skrawek przekroju poprzecznego liścia aloesu, umieścić go w kropli wody i obserwować komórki miękiszowe z chloroplastami. Wykonać rysunek. 2.b. Z dolnej strony liścia trzykrotki zerwać pęsetą skórkę lub przygotować skrawek z nasady jej liścia. Wykonać preparat wodny. Obserwować komórki z bezbarwnymi leukoplastami zlokalizowanymi w pobliŝu jądra komórkowego. Wykonać rysunek. 2.c. Zeskrobane skalpelem, cienkie skrawki marchwi umieścić w kropli wody na szkiełku podstawowym. Wykonać równieŝ rozmaz z komórek miękiszowych pomidora (preparat wodny). W obydwu przypadkach obserwować komórki z pomarańczowymi chromoplastami. Wykonać rysunek, porównać kształt rozmiar i ułoŝenie poszczególnych plastydów. Ćwiczenie 6 Obserwacje skrobi zapasowej Bulwa ziemniaka, banan, ziarna fasoli i ryŝu Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne 1. Bulwę ziemniaka przeciąć skalpelem, a następnie przy jego pomocy nanieść niewielką ilość powstałego soku na kroplę wody umieszczoną na szkiełku podstawowym. Obserwować pojedyncze ziarna skrobi z charakterystycznym uwarstwieniem. Wykonać rysunek. 2. Bulwę ziemniaka przeciąć skalpelem, a następnie przy jego pomocy nanieść niewielką ilość powstałego soku na kroplę wody umieszczoną na szkiełku podstawowym. Obserwować pojedyncze ziarna skrobi z charakterystycznym uwarstwieniem. Wykonać rysunek. 3. Na szkiełku podstawowym umieścić kroplę wody, a następnie przy pomocy skalpela nanieść niewielką ilość miąŝszu banana. Obserwować duŝe komórki miękiszowe ze skupiskami ziaren skrobi zapasowej. Wykonać rysunek. Niewielką ilość bielma z przeciętego ziarna fasoli i ryŝu zeskrobać przy uŝyciu skalpela bezpośrednio na kroplę wody na szkiełku podstawowym. Obserwować charakterystyczne kształty ziaren skrobi. Wykonać rysunki, porównać rodzaje skrobi oraz wyjaśnić w jakich organellach komórkowych znajdują się ziarna skrobi zapasowej. Ćwiczenie 7 Własności cytoplazmy plazmoliza y Cebula Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne Odczynniki 10% roztwór NaCl
Przygotować skórkę z wklęsłej strony łuski cebuli jak w ćwiczeniu 5. Preparat umieścić w kropli hipertonicznego, 10% roztworu NaCl. Obserwować, narysować i wyjaśnić zjawisko plazmolizy. Ćwiczenie 8 Obserwacje kryształów szczawianu wapnia y Okrywowa sucha łuska cebuli, łodyga rabarbaru Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne 1. Cienki skrawek suchej łuski cebuli umieścić w kropli wody, przykryć szkiełkiem nakrywkowym. W wydłuŝonych komórkach znaleźć pojedyncze kryształy szczawianu wapnia tzw. jedyńce, występujące w postaci graniastosłupów o róŝnej długości. Wykonać rysunek oraz wyjaśnić w jakich organellach i dlaczego powstają jedyńce. 2. Skrawek poprzeczny łodygi rabarbaru umieścić w kropli wody, przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Obserwować w komórkach miękiszu pojedyncze kryształy szczawianu wapnia w postaci ośmiościanów lub kuliste agregaty tzw. druzy. Wykonać rysunek. Ćwiczenie 9 Barwniki komórkowe Barwniki roślinne są glukozydami występującymi w wakuolach. Barwniki flawonowe są Ŝółte i nadają barwę płatkom rośliny. Barwniki antocyjanowe, w zaleŝności od ph nadają róŝne zabarwienie wakuolom od czerwonego, poprzez fioletowe do niebieskiego y Liście czerwonej kapusty Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne Odczynniki 80% kwas octowy 10% amoniak Woda destylowana Przy uŝyciu skalpela wyciąć trzy kilkumilimetrowe skrawki skórki liścia czerwonej kapusty czerwonej i umieścić je na szkiełkach podstawowych. Następnie do jednego dodać kroplę 80% kwasu octowego, do drugiego kroplę 10% amoniaku, do trzeciego kroplę wody destylowanej. Przeprowadzić obserwację jak zawarte w kapuście antocyjany, w zaleŝności od odczynu środowiska, przybierają róŝne zabarwienie. Wykonać rysunek i zanotować obserwacje.
Sprawozdanie: 1. WskaŜ na podstawowe róŝnice w budowie komórki roślinnej i zwierzęcej. 2. Opisz wykonanie poszczególnych preparatów mikroskopowych, wykonaj starannie! ich rysunki opisując wyniki swoich obserwacji mikroskopowych oraz podaj odpowiedzi na zadane w ćwiczeniach pytania. Literatura 1. Strukturalne podstawy biologii komórki. Kilarski W., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003. 2. Podstawy molekularne biologii komórki. Aspekty lekarskie. Fulder G. M., Shields D., Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Łódź 2000. 3. Biologia komórki roślinnej. Wojtaszek P., Woźny A., Ratajczak L. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006. 4. Podstawy biologii komórki. Alberts B., Bray D., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999. 5. Biologia i inŝynieria komórki. Laboratorium. Szopa J. St., Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej, Łódź 1994. 6. Mikroskopia świetlna w badaniach komórki roślinnej. Kurczyńska E. U., Borowska- Wykręt D. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007.