FIZJOLOGIA REGENERACJI Czesc II
I. Szpik kostny zawiera pluripotencjalne komórki macierzyste (PKM). KM Totipotentcjalne KM Pluripotencjalne KM Multipotencjalne KM Monopotencjalne naskórek wątroba mięśnie krew uklad nerwowy Zapłodniony oocyt (Zygota) KM Embrionalne KM Ektodermalne KM Mezodermalne KM Endodermalne inne KM Ukierunkowane tkankowo Ukierunkowanie tkankowe (Commitment)
II. Koncepcja krążących KM Komórki macierzyste krwiotwócze (KKM) krążą w krwi obwodowej w celu utrzymania równowagi puli KKM w różnych miejscach organizmu, ale......gromadzone są dowody, że również PKM krążą we krwi...
III. Nowe spojrzenie na komórki macierzyste w kontekście starzenia Defekt funkcjonalny komórek macierzystych gromadzenie mutacji, skracanie telomerów Nowe wyjaśnienie długowieczności i starzenia się ssaków poprzez obecność mobilnej puli PKM w szpiku kostnym, ubywającej wraz z wiekiem organizmu.
IV. Pluripotencjalne komórki macierzyste (PKM) w doroslych tkankach mechanizm kontrolujący ich niekontrolowaną proliferację Usunięcie imprintu somatycznego kontroluje proliferację pluripotencjalnych KM (PKM)
V. Komórki macierzyste mogą uczestniczyć w rozwoju nowotworów Przyczyną nowotworzenia są blędy mechanizmów kontrolujących regenerację tkanek oraz samoodnowę komórek macierzystych
KOMÓRKI IZOLOWANE Z TKANEK PO PORODZIE.
Koncepcja plastyczności KKM
Koncepcja plastyczności KKM?
Alternatywne wyjaśnienia zjawiska transróżnicowania lub plastyczności krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) Fuzja komórkowa Stymulacja parakrynna Przeniesienie białek przez mikrofragmenty błonowe Obecność heterogenicznej populacji komórek macierzystych w szpiku kostnym Bardzo rzadkie zjawisko, w którym przeszczepione KKM ulegają fuzji z komórkami uszkodzonej tkanki, tworząc heterokariony. Powstałe heterokariony wykazują ekspresję markerów KKM przeszczepu i uszkodzonych komórek tkanek gospodarza (pseudochimeryzm). KKM stanowią źródło różnych czynników wzrostowych i angiopoetycznych, mogących promować regenerację tkanek/organów. Niektóre doniesienia o plastyczności komórek macierzystych mogą być wyjaśnione za pomocą zjawiska czasowej zmiany fenotypu komórkowego, będącego wynikiem przeniesienia receptorów, cytoplazmatycznych białek oraz mrna między KKM a uszkodzoną komórką, za pomocą mikrofragmentów komorkowych. Oprócz KKM, szpik kostny zawiera także populacje innych komórek macierzystych. Regeneracja uszkodzonych tkanek może zostać wyjaśniona obecnością komórek progenitorowych dla śródbłonka naczyń, które stymulują neowaskularyzację, jak również obecnością innych komórek macierzystych, w tym komórek pluripotencjalnych (np. VSELs). Może to tłumaczyć brak efektu plastyczności przy zastosowaniu wysoko oczyszczonej populacji KKM.
Fuzja komorek..
Mikrofragmenty Komórkowe Stymulacja komorek przez MFK ligandy, aktywne lipidy. Przeniesienie receptorow, organelli komorkowych Reprogramowanie epigenetyczne poprzez przeniesienie bialek, mrna, mirna Przenoszenie wirusow i prionow
Komórki macierzyste: Fenotyp: Komórki macierzyste mezenchymalne (MSC - Mesenchymal Stem Cells)* Kryteria wg International Society for Cellular Therapy: CD105 +, CD73 +, CD90 +, CD45 -, CD34 -, CD14 -, CD11b -, CD79a -, CD19 -, HLA-DR - Multipotencjalne dojrzałe komórki progenitorowe (MAPC - Multipotent Adult Progenitor Cells)* SSEA-1 +, CD13 +, Flk-1 low, Thy-1 low, CD34 -, CD44 -, CD45 -, CD117(c-kit) -, MHC I -, MHC II - Komórki MIAMI (MIAMI Marrow Isolated Adult Multilineage Inducible Cells)* CD29 +, CD63 +, CD81 +, CD122 +, CD164 +, c- met +, BMPR1B +, NTRK3 +, CD34 -, CD36 -, CD45 -, CD117 (c-kit) -, HLA-DR - Bardzo małe komórki macierzyste podobne do komórek embrionalnych (VSELs - Very Small Embryonic Like Stem cells) CXCR4 +, AC133 +, CD34 +, SSEA-1 + (mysz), SSEA-4 + (człowiek), AP +, c-met +, LIF-R +, CD45 -, Lin -, MHC I -, HLA-DR -, CD90 -, CD29 -, CD105 -
Mezenchymalne Komorki Macierzyste?
Multipotent Adult Progenitor Cells
Alternatywne wytłumaczenie zjawiska plastyczności KM CXCR4 SDF-1 gradient SDF-1 gradient SDF-1 gradient SDF-1 gradient SDF-1 gradient Blood 2002, 100, 515 Stem Cells 2003, 21: 363-371 Leukemia 2004, 18: 29-40 Circulation 2004, 110:3213-3 Circulation Res. 2004, 95:1191-9 Biol. Cell 2005, 97:113-146.
TECHNIKI IZOLACJI/IDENTYFIKACJI KOMÓREK MACIERZYSTYCH..
Niektóre komórki CXCR4 + CD45 - są bardzo małe Komórki jednojądrzaste szpiku kostnego Chemotaksja do SDF-1 Samo medium Medium z SDF-1 Kucia et al. Biol Cell 2005, 97, 113-146.
FACS sorter Sorter Komórek Aria Sorter Komórek (MoFlo)
PKM są CXCR4 + CD45 - Komórki jednojądrzaste szpiku kostnego 1.Chemotaksja do SDF-1 Samo medium Medium z SDF-1 FACS SORTER 2. Sortowanie w oparciu o fluorescencję komórek (FACS) CD45 - CD45 + CXCR4 + CD45 - CXCR4 + CD45 +
Polowanie na pluripotencjalne komórki macierzyste (PKM) szpiku kostnego - NOWE KRYTERIA IZOLACJI TAKIEJ POPULACJI KOMÓRKOWEJ: obecność markerów: CXCR4, CD133 oraz Sca-1 (mysz) brak antygenu CD45 bardzo mała wielkość ~ 3-5 m Epiblast
Sorter Komórek (MoFlo) Electronowy mikroskop skaningowy Electronowy mikroskop transmisyjny ImageStream System Mikrokop konfokalny FACS
Ustalenie bramki do sortowania komórek Sca-1 + lin - CD45-15μm 10μm 6μm 4μm 2μm 2-10µm R1 1μm Zuba et al, J Cell Moll Med. 2008, 12, 292-303.
Counts SSC Lineage PE Strategia sortowania komórek Sca-1 + lin - CD45-50.5% 0.16% FSC Sca-1 PE-Cy5 0.009% 0.15% Sca-1 + lin - CD45 - CD45 APC-Cy7 Sca-1 + lin - CD45 +
Komórki CD45 - lin - Sca-1 + oraz CD45 + lin - Sca-1 + - w analizie ImageStream Sca-1 + lin - CD45 - Sca-1 + lin - CD45 +
Ocena czynnościowa komórek Sca-1 + lin - CD45 + oraz Sca-1 + lin - CD45 - Sca-1 + lin - CD45 + Ocena potencjalu hematopoetycznego radioprotekcja in vitro - CFU-GM In vivo - CFU-S Sca-1 + lin - CD45 - Biol Cell 2005, 97, 113-146.
Analiza RQ-PCR ekspresji genów komórek macierzystych w sortowanej populacji Sca-1 + lin - CD45 - Komórki nerwowe Mięśnie szkieletowe Kardiomiocyty Markery KM Sca-1 + lin - CD45 + Sca-1 + lin - CD45 - GFAP 0.64 ± 0.03 243.41 ± 31.03 * Nestin 0.39 ± 0.06 128.31 ± 18.74 * III tubulin 0.95 ± 0.09 201.36 ± 36.38 * Olig1 1.02 ± 0.42 36.17 ± 7.14 * Olig2 1.14 ± 0.47 15.20 ± 2.13 * Myf5 1.41 ± 0.29 179.76 ± 16.78 * MyoD 0.77± 0.50 151.78 ± 15.56 * Myogenin 0.76 ± 0.45 76.73 ± 3.21 * Nsx2.5/Csx 2.05 ± 0.12 98.63 ± 7.93 * GATA-4 2.74 ± 0.41 268.63 ± 31.42 * Hepatocyty -Fetoprotein 0.57 ± 0.02 45.93 ± 3.83 * CK19 1.12 ± 0.75 60.08 ± 9.01 * Nablonek jelit Nkx 2-3 0.30 ± 0.01 130.03 ± 10.27 * Tcf4 0.26 ± 0.02 33.74 ± 4.27 * Komórki trzustki Nkx 6.1 0.68 ± 0.08 13.71 ± 2.65 * Pdx 1 0.76 ± 0.06 8.41 ± 1.90 * Sródblonek VE-cadherin 1.05 ± 0.38 142.36 ± 12.49 * Naskórek Krt 2-5 1.25 ± 0.05 62.31 ± 6.81 * Krt 2-6a 0.69 ± 0.11 33.24 ± 3.24 * BNC 1.49 ± 0.41 57.53 ± 2.29 * DCT 0.42 ± 0.02 6.49 ± 1.94 * Melanocyty TYR 0.38 ± 0.01 8.04 ± 1.08 * Leukemia 2006,20:857-869 TRP 1.08 ± 0.20 13.95 ± 2.16 *
From >>June 2005 Mariusz Z. Ratajczak answers a few questions about this month's emerging research front in field of Molecular Biology & Genetics: Molecular Biology & Genetics Article: Stem cell plasticity revisited: CXCR4-positive cells expressing mrna for early muscle, liver and neural cells 'hide out' in the bone marrow Authors: Ratajczak, MZ;Kucia, M;Reca, R;Majka, M;Janowska-Wieczorek, A; Ratajczak, J Journal: LEUKEMIA, 18: (1) 29-40, JAN 2004 Addresses: Univ Louisville, James Graham Brown Canc Ctr, Stem Cell Biol Program, 529 S Jackson St, Louisville, KY 40202 USA.
mrna (fold difference) Sortowane komórki Sca-1 + lin - CD45 - wykazują ekspresję embrionalnych czynników transkrypcyjnych 200 Pełna populacja BMMNC Sca-1 + lin - CD45 + 160 Sca-1 + lin - CD45-120 80 40 0 Oct-4 Nanog Rex-1 Dppa3 Rif1 PSC markers Markery PKM Leukemia 2006,20:857-869
SEM mysich komórek Sca-1 + lin - CD45 - (VSEL)
TEM mysich komórek Sca-1 + lin - CD45 - oraz Sca-1 + lin - CD45 + Sca-1 + lin - CD45-2 m 1 m 1 m 1 m Sca-1 + lin - CD45 + 4 m 2 m 2 m 2.5 m Kucia et al. Leukemia 2006,20:857-869
Nanog Oct4 SSEA-1 Komórka macierzysta VSEL (Very Small Embryonic-Like stem cell) Komórka macierzysta krwiotwórcza Sca-1 + lin - CD45 - Sca-1 + lin - CD45 + 7-AAD M1 Kucia et al. Leukemia 2006,20:857-869 0 200 400 600 800 1000 FL2-A VSEL są diploidalne VSEL usuwają 7-ADD
Ekspresja SSEA-1, Oct-4 oraz Nanog w Sca-1 + lin - CD45 - w komórkach szpiku kostnego SSEA-1 Oct-4 Nanog Kucia et al. Leukemia 2006,20:857-869
Mysie erytrocyty, płytki krwi oraz VSEL - ImageStream analiza 10µm 4.94 0.46 µm Erytrocyty 10µm 3.63 0.27 µm VSEL 10µm 2.19 0.71 µm Ratajczak et al. Exp. Hematology 2008,36:742 751 Płytki krwi
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 SSC Sca-1 Sca-1 Sca-1 Lineage R1 Sca-1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 Sca-1 Sca-1 Fenotyp mysich VSEL MHC-I, MHC-II - CD90 - CD105 - CD106 + CD49f + FSC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 R2 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD45 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 MHC-I 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD105 - - - 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 MHC-II 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD106 (VCAM) 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD90 - + + 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD49f (VLA6 )
VSEL ukrywają się w fibroblastach podścieliska szpiku kostnego FACS SORTER Komórki Sca-1 + lin - CD45 - Komórki podścieliska BM VSEL posiadają receptor CXCR4 Leukemia 2005, 19, 1118-1127
VSEL ukrywają się w fibroblastach podścieliska szpiku kostnego Leukemia 2005, 19, 1118-1127
VSEL ukrywają się w fibroblastach podścieliska szpiku kostnego
BONE MARROW-DERIVED PSC ISOLATED AS POPULATIONS OF FIBROBLAST ALIKE ADHERENT CELLS: Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC) Unrestricted Somatic Stem Cells (USSC) Marrow Isolated Adult Multilineage Inducible Cells (MIAMI) Multipotent Adult Stem Cells (MASC)?
BONE MARROW-DERIVED PSC ISOLATED AS POPULATIONS OF FIBROBLAST ALIKE ADHERENT CELLS: Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC) Unrestricted Somatic Stem Cells (USSC) Marrow Isolated Adult Multilineage Inducible Cells (MIAMI) Multipotent Adult Stem Cells (MASC)?
Very Small Embryonic Like (VSEL) Stem Cell
Niespodzianka!!! Very Small Embryonic Like (VSEL) Stem Cell C2C12 OP9 MSC
Sfery formowane przez VSEL w kokulturze z komórkami C2C12 Barwienie sfer w kierunku płodowej formy alkalicznej fosfatazy (PLAP) Sfery formowane przez GFP + VSEL Analiza zawartości DNA Oct4 GATA-6 Cdx2 Sox2 HNF3 AFP Oct4 GATA-6 Cdx2 Sox2 HNF3 AFP VSEL Komórki sfer formowanych przez VSEL Analiza ekspresji genów w komórkach sfer Różnicowanie komórek sfer
- brak radioprotekcji - nie tworza kolonii Sca-1 + lin - CD45 - VSEL OP9 cells VSEL- tworza cobble stone area - kolonie - radioprotekcja
- brak radioprotekcji - nie tworza kolonii Sca-1 + lin - CD45 - VSEL OP9 cells VSEL- tworza cobble stone area - kolonie - radioprotekcja
Ekspresja wybranych genów hematopoetycznych w swieżo izolowanych KKM i VSEL oraz komórkach poddanych ekspansji na podłożu OP9 Swieżo izolowane KKM VSEL (-) Ikaros Ikaros Komórki namnożone z KKM VSEL (-) Lmo2 Lmo2 GATA-2 PU.1 SCL myb Oct-4 GATA-2 PU.1 SCL myb Oct-4
Ekspresja wybranych antygenów hematopoetycznych na komórkach poddanych ekspansji na podłożu OP9 CD45 CD41 Gr-1 34% 25% Lin-Sca-1+CD45- VSEL M1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 M1 M1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 76% 47% Lin-Sca-1+CD45+ KKM M1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 M1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 M1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
EKM MSC PKM??? KKM Komórki macierzyste ukierunkowane tkankowo (monopotentne) Hematopoeza Limfopoeza
EKM MSC PKM??? KKM Komórki macierzyste ukierunkowane tkankowo (monopotentne) Hematopoeza Limfopoeza
PKM? - Anemia aplastyczna? - Megaradiochemioterapia? EKM MSC?? KKM Komórki macierzyste ukierunkowane tkankowo (monopotentne) Hematopoeza Limfopoeza
VSEL są mobilną populacją komórek macierzystych..?
Ratajczak et al. Biol Cell 2005, 97, 113-146.
G-CSF indukuje mobilizację VSEL
VSEL HSC No of VSELs/1ml PB MNC WBC (K/ l) 1000 VSELs WBC 40 800 30 5 m 600 20 400 200 10 0 unmobilized G-CSF 0 -sarcomeric actinintroponin I CD45-FITC DAPI OCT4 -PE merged Olig 1 III tubulin GFAP C peptide insulin 5 m Kucia et al. Stem Cells 2008,26:2083-2092
VSEL są mobilizowane w zawale serca
Mobilizacja VSEL po zawale mięśnia sercowego No of VSELs / ul of blood 5 4 3 * # * # * vs. kontrola # vs. kontrola (sham) P < 0.025 2 1 0 Kontrola Kontrola (sham) 24h 48h 7 dni HSCs CD45 + /Lin - /Sca-1 + VSEL CD45 - /Lin - /Sca-1 + 5µm Zuba et al. J Mol Cell Cardiol. 2008, 44:865 873 CD45 FITC Oct-4 TRITC DAPI
VSELS [cells/µl] WBC [10 3 cells/µl] Mobilizacja VSEL po zawale mięśnia sercowego 15 12 9 6 3 0 VSELs WBC *P<0.003 CTRL MI 24 hrs 18 16 14 12 10 8 6 4 2 * 0 CXCR4 Oct-4 CXCR4 Oct-4 merged CXCR4 Oct-4 DAPI SSEA-4 SSEA-3merged SSEA-4 DAPI merged SSEA-4 DAPI Wojakowski et al. Circulation 2004, 110, 3213-3220. Wojakowski et al. Journal American College of Cadiology 2008 (in press)
Wojakowski et al. Journal American College of Cadiology 2008 (in press)
VSEL są mobilizowane w udarze mózgu
mrna (fold difference) VSEL sa mobilizowane do krwi obwodowej w udarze mozgu 12 10 8 control PBMNC 24 h 3 rd day after stroke 7 th day P<0.001 vs control 6 4 2 0 Oct4 Nanog GFAP Nestin β-iii-tubulin Olig1 Olig2 Sox2 Musashi-1 PSC markers CXCR4 Oct-4 CXCR4 + Oct 4 GFAP GFAP + DAPI Paczkowska et al. Stroke 2008 (in press)
VSEL krązą w krwi pępowinowej?
Strategia izolacji VSEL z krwi pępowinowej Metoda dwustopniowa izolacji i) liza krwi w hipotonicznym roztworze chlorku amonu oraz ii) użycie sortera komórkowego
NANOG OCT4 SSEA-4 Komórki CD133 + CXCR4 + Lin - CD45 - - VSEL krwi pępowinowej CXCR4 + Lin - CD45 - Oct4 Nanog DAPI CD133 + Lin - CD45 - CD34 + Lin - CD45 - DAPI DAPI 1 m 1 m 1 m Kucia et al. Leukemia 2007, 21, 297-303.
CXCR4 + lin - CD45 - (VSEL) 1 m 1 m 1 m Kucia et al. Leukemia 2007, 21, 297-303.
Human CB-VSELs, Erythrocytes and Platelets 10µm 6µm 4µm 2µm 1µm Synthetic beads Platelets 2.98±0.45µm CB-VSELs 6.75 ± 1.04µm Erythrocytes 7.87±0.85µm
Różnicowanie VSEL z krwi pępowinowej w kierunku komórek nerwowych oraz kardiomiocytów Różnicowanie w kierunku lini neuronalnych. Panel a Ekspresja nestyny (fluorescencja zielona) oraz III tubuliny (fluorescencja czerwona) w obrębie neurosfery. Panel b - d Komórki wyprowadzone z neurosfery zróżnicowane w neurony pozytywne pod względem nestyny (b) i III tubulin (c) oraz oligodendrocyty wykazujące ekspresję O4 (d). Jądra komórkowe wybarwione DAPI. Różnicowanie w kierunku kardiomiocytów. Ekspresja białkek strukturalnych: Panel a, b -aktyniny (fluorescencja czerwona). Panel c, d troponin I (fluorescencja zielona). Jądra komórkowe wybarwione DAPI.
VSEL występują w różnych narządach doroslych myszy..
Oct-4 mrna expression (fold difference) Małe komórki Sca-1 + lin - CD45 - izolowane z mysich narządów A Oct3/4 1000 B 2m 100 10 Oct3/4 2m 1
Oct-4 + komórki VSEL w mysich narzadach Trzustka Grascia 10µm 10µm ImageStream system Trzustka 5 m 5 m Mikroskop fluorescencyjny Grasica 5 m Oct-4 DAPI 5 m SSEA-1 DAPI Trzustka Grasica DAPI CD45 Sca-1 Oct-4 Merged 5µm Mikroskop konfokalny 5µm
Oct-4 + VSEL / organ [x10 3 ] Rozkład komórek VSEL w narządach myszy 60 50 40 30 4.8% 7.1% Oct-4 + VSELs 7.9% 12.8% 16.7% 37.0% Brain Kidneys S. muscles Pancreas B. marrow Liver Lungs Spleen Testes Thymus Heart 20 10 0
Mikroskop konfokanlny VSELs w roznych narzadach Zuba-Surma et al. Cytometry 2008 (in press).
Czy liczba VSEL w szpiku kostnym zależy od wieku osobnika??
Zawartość VSELs [%] SSC Lineage PE Counts Liczba komórek VSEL w szpiku spada z wiekiem Sca-1 + Lin - CD45 - R1 R2 R3 R4 FSC 0.08 0.07 Sca-1 PE-Cy5 CD45 APC-Cy7 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 2 4 7 10 12 18 24 36 Wiek myszy [miesiące]
A 1-miesieczna mysz B 2-letnia mysz VSEL hodowane na komórkach C2C12 Sfery ( - )
fold of difference Szpik kostny krótkożyjących myszy szczepu DBA/2J zawiera znacznie mniej komórek VSEL 1 Oct-4 Nanog Rex1 0.1 B6 Sca-1 + lin - CD45 - DBA/2J Sca-1 + lin - CD45-0.01 Okres życia DBA/2J - ½ roku 0.001 B6-2 lata Exp. Hematol 2005, 33, 613-623.
VSEL i regeneracja dane in vivo..?
A Intramyocardial injection of GFP + VSEL 48h 30 days Evaluation of the contribution of GFP + cells to the myocardiac regeneration B Intramyocardial injection of GFP + VSEL expanded cardiomyocytes 48h 180 days Evaluation of the contribution of GFP + cells to the myocardiac regeneration
mm % mm Vehicle (n=8) HSCs (n=13) VSELs (n=7) * P < 0.05 vs. Vehicle-treated P < 0.05 vs. HSCs 80 LV Ejection Fraction 7 LV End-systolic Diameter 70 6 60 50 40 30 * * * 5 4 3 * 20 2 10 1 0 BSL 48 h 1 mo 3 mo 6 mo 0 BSL 48 h 1 mo 3 mo 6 mo 1.2 Infarct Wall Thickness (Diastole) 1.0 0.8 0.6 0.4 * 0.2 0.0 BSL 48 h 1 mo 3 mo 6 mo Dawn et al. Stem Cells 2008;26:1646 1655 -sarcomeric actin GFP
Pochodzenie rozwojowe komórek VSEL..komórki linii (zarodkowej) gametoidalnej i somy..?
Oocyt + Plemnik Trofoektoderma Zygota Morula ICM Epiblast Trofoektoderma?? Mezoderma Ektoderma Endoderma Ratajczak et al. Leukemia 2007, 21, 860-867. Pierwotne komórki gamet (PGC) Gamety Mezoderma Ektoderma Endoderma
Status VSEL Linia zarodkowa (germinalna) jako żrodło i szkielet układu KM Układ nerwowy Pierwotne komórki gamet (PGC) Zarodek Ektoderma pozazarodkowa Mięśnie szieletowe Wyciszenie 1. Nisza ektotopowa 2. Czynniki hamujące 3. Usunięty somatic imprint Wąroba płodowa Szpik kostny Legenda: Gradient SDF-1 EPIBLAST (Prymitywna ektoderma) CXCR4 + komórki epiblastu/pgc (VSEL) Mięsień sercowy Zawiązki gonad Nadnercza Aktywacja 1. Stan zapalny, uszkodzenie tkanek 2. Zmiany epigenetyczne 3. Przywrócenie somatic imprint
Oocyt + Plemnik Trofoektoderma Zygota Morula ICM Epiblast Trofoektoderma Usuniecie imprintu?? Usuniecie imprintu Mezoderma Ektoderma Endoderma Ratajczak et al. Leukemia 2007, 21, 860-867. Pierwotne komórki gamet (PGC) Gamety Mezoderma Ektoderma Endoderma
Podstawy molekularne zjawiska imprintu somatycznego u ssaków łożyskowych Wyrózniamy ~80 genów posiadajacych imprint które odgrywaja kluczowa role w embriogenezie/rozwoju (ulegajac ekspresji tylko na matczynym lub tylko na ojcowskim chromosomie) Ich ekspresja jest regulowana przez tzw. imprinting control regions (ICRs) lub tzw. methylated regions (DMRs), które sa metylowane (na CpG islands) na jednym z dwóch rodzicielskich aleli. W wiekszosci ICR, metylacja aleliczna dotyczy matczynego chromosomu (np. Igf2R). W kilku tylko przypadkach powstaje podczas spermatogenezy (np. Igf2-H19). Usunięcie imprintu somatycznego kontroluje proliferację pluripotencjalnych KM (np. pierwotnych komórek plciowych (PGC) oraz VSEL) i chroni przed powstawaniem potworniaków.
Primordial germ cells
Primordial germ cells
Primordial germ cells
Primordial germ cells VSEL?
Igf2-H19 imprinting decyduje o proliferacji TKM Kaguya mysz partenogenetyczna
MOLECULAR BASIS OF ICR1/DMR1 (Igf2-H19) IMPRINT H19 is transcribed from maternal chromosome Igf2 is transcribed from paternal chromosome
MOLECULAR BASIS OF ICR1/DMR1 (Igf2-H19) IMPRINT Consequences of imprint erasure H19 over-expressed Igf2 - down-regulated
Kucia et al. 2009, Leukemia Fold difference (mrna) Fold difference (mrna) (A) Igf2 16 CpGs H19 ICR1/DMR1 (Igf2-H19) ICR1/DMR1 (B) VSEL HSC MSC ESC-D3 12.5 H19 1.0 IGF2 (C) VSEL TaqI - + HSC - + MSC ESC-D3 - + - + UMe Me 10.0 7.5 5.0 0.8 0.6 0.4 2.5 0.2 0.0 VSEL HSC 0.0 VSEL HSC
Paternally imprinted genes VSEL HSC MSC ESC-D3 Igf2-H19 7.6 % 43.8 % 52.7 % 66.1 % VSEL HSC ST ESC-D3 Rasgrf1 10.4 % 52.5 % 40.0 % 64.6 % VSEL HSC ST ESC-D3 Meg3 67.4 % Shin et al. 2009 (submitted). 66.4 % 65.6 % 66.7 %
Stan metylacji kluczowych genow posiadajacych piętno genomowe VSEL HSC MSC ESC Oct-4 Igf2-H19 N N Rasgrf1 N N N Igf2R N N KCNQ1 N N Peg1/Mest N N N SNRPN N N N N Legend - : hypermethylation, : hypomethylation, N : normal status Shin et al. 2009 (submitted).
Stan metylacji kluczowych genow posiadajacych piętno genomowe VSEL HSC MSC ESC Oct-4 Igf2-H19 N N Rasgrf1 N N N Igf2R N N KCNQ1 N N Peg1/Mest N N N SNRPN N N N N Legend - : hypermethylation, : hypomethylation, N : normal status VSEL: Increase in mrna for Decrease in mrna for H19, p57 Kip2, Igf2R IGF2, Rasgrf1 Shin et al. 2009 (submitted).
VSEL i fizjologiczne konsekwencje ich obecności w tkankach : Czy sa żródłem komórek macierzystych ukierunkowanych tkankowo w stanach fizjologii (steady state conditions) czy też tylko w warunkach stresu? Czy możliwe bedzie wykorzystanie autologicznych VSEL pobranych w młodym wieku (za pomocą mobilizacji) do póżniejszego odmładzania i regeneracji tkanek u pacjentów w starszym wieku? VSEL jako nowy target dla rozwoju nowej generacji leków wydłużających w czasie ich przeżycie w tkankach oraz kontorolowaną proliferację.
Somatic Imprint - Yes Expression of Oct-4, Sox-2, Myc, Klf4 - No Somatic Imprint - No Expression of Oct-4, Sox-2, Myc, Klf4 - Yes 1 st scenario PSC 2 nd scenario To re-establish somatic imprint ipsc VSEL To express Oct-4, Sox-2, Myc and Klf4 Tissue Committed Stem Cells MSC Soma
Czy VSEL uczestniczą w rozwoju nowotworów??
Nowotwory wywodzą się z populacji komórek macierzystych Nowotwory wzrastają raczej ze zmutowanych komórek macierzystych, niż z komórek somatycznych ulegających odróżnicowaniu. Komórki macierzyste nowotworu są odpowiedzialne za jego wzrost, odnowę oraz przerzutowanie. Nowotworzenie wiąże się z nieprawidłowymi mechanizmami kontrolującymi regenerację tkanek oraz samoodnowę komórek macierzystych. Obecność nowotworów towarzyszących chronicznym stanom zapalnym potwierdza model nowotworu, jako efektu ciągłych procesów naprawczo-regeneracyjnych.
Pochodzenie komórek macierzystych nowotworu (KMN) 1 KMN 2 3 KM VSEL J Physiol Pharm. 2006, 57, Supp 7, 5-16
Pochodzenie komórek macierzystych nowotworu (KMN) 1 KMN 2 3 KM VSEL J Physiol Pharm. 2006, 57, Supp 7, 5-16
Embryonal rest theory of cancer development 1829 J. Recamier; 1854 R. Remak; 1958 R. Virchow Zaproponowali ze nowtwory powstają z przetrwałych tkanek plodowych. 1874 F. Durante; 1875 J. Cohnheim Sugerowali że w tkankach znajdują sie komórki embrionalne, ktore jesli ulegną aktywacji tworza nowotwory. 1910 - Wright Zaproponowal że guz Willmsa (nephroblastoma) wywodzi sie z komórek zarodkowych 1911 J. Beard Nowotwory powstają z trofoblastu lub przetrwałych komórek zarodkowych Rudolf Virchow Julius Cohnheim John Beard
Dane sugerujące, że nowtowory powstają w KM linii zarodkowej (germ line) Występowanie klasycznych guzów germinalnych Nasieniak, guzy jajnika, yolk sac tumor, teratoma, teratocarcinoma, Ekspresja Cancer Testis (C/T) Antigens w komórkach nowotworowych Antygeny C/T (~40 opisanych) ulegają ekspresji w komórkach linii zarodkowej, występuja jednak rowniez ekspresji w szeregu nowotworach (np., zoładka, płuca-, wątroby-, pęcherza moczowego, czerniakach, meduloblastoma, mięsakach dzieciecych, guzach germinalnych). Ekspresja gonadotropiny łozyskowj (hcg) oraz antygenu karcyembrionalnego (CEA) w nowotworach Szereg nowotworów syntetyzuje podjednostkę beta hcg lub jej fragment oraz posiada ekspresję CEA. Ekspresja Oct-4 w szeregu nowotworach Oct-4 będący markerem pluripotencjalnych komórek linii zarodkowej ulega ekspresji np. w guzach zołądka, płuca, pęcherza moczowego, sluzówki jamy ustnej oraz guzach germinalnych.
VSEL HSC MNC VSEL HSC MNC VSEL HSC MNC VSEL HSC MNC Fold difference (mrna) Fold difference (mrna) Fold difference (mrna) Fold difference (mrna) Ekspresja antygenow C/T w komorkach VSEL 250 MAGE-A2 500 MAGE-A10 200 MAGE-B3 60 Ssbx1 200 150 100 50 400 300 200 100 150 100 50 50 40 30 20 10 0 0 0 0
Oct-4 + VSEL jako komórki zapoczątkowujące rozwój nowotworu? Typ nowotworu Teratoma, Teratocarcinoma Germinoma, Seminoma, Teratoma, Dermoid cyst, Hydatidiform mole Mięsaki wieku dziecięcego (Rhabdomyosarcoma, Neuroblastoma, Mięsak Ewinga, nowotwór Willmsanephroblastoma) Inne zmiany nowotworowe (np. rak żołądka związany z zakażeniem Helicobacter pylori) Potencjalne mechanizmy Przetrwały somatic imprint Oct-4 + komórek (pochodzących z epiblastu?), dodatkowe mutacje? Komórki pozostawione w trakcie wędrówki pierwotnych komorek płciowych, przetrwały somatic imprint, dodatkowe mutacje? Zmutowane komórki Oct-4 + zlokalizowane w różnych tkankach? Krążące komórki Oct-4 + wbudowane w niewłaściwe miejsce, w niewłaściwym czasie, dodatkowe mutacje? Fuzja komórkowa- niestabilność chromosomalna? Leukemia 2007, 21, 860-867.
Potencjalny udział VSEL w procesach kancerogenezy Mutacje - Przetrwały somatic imprint - Mutacje A VSEL B C + - Fuzja aneuploidia chromosomów Fuzja Komórka aneuploidalna jako wynik fuzji Chemoatrakcja - Komórki naczyń oraz podścieliska nowotworu pochodzące z VSEL Exp. Opinion Biol. Ther. 2007, 7, 1499-514
Wnioski: Szpik kostny jest miejscem, gdzie zdeponowane są nie tylko komórki macierzyste krwiotwórcze, ale także, jak dowodzą nasze badania komórki VSEL (ang. very small embryonic-like stem cells) populacja pluripotencjalnych komórek macierzystych wywodzących się z epiblastu zarodka. Zgodnie z naszą hipotezą, VSEL zdeponowane są w szpiku kostnym oraz innych narzadach młodych ssaków we wczesnych etapach rozwoju zarodkowego, jako pula rezerwowa komórek pluripotencjalnych, odpowiedzialna za naprawę i regenerację uszkodzonych tkanek. Proliferacja tych komórek jest kontrolowana przez modulację imprintu somatycznego (np. Igf2-H19). VSEL mogą zostać uwolnione ze szpiku płodowego i krążyć w krwi pępowinowej. Uważamy, że VSEL mogą stać się potencjalnym źródłem komórek macierzystych dla celów medycyny regeneracyjnej oraz mogą stać się rzeczywistą alternatywą dla embrionalnych komórek macierzystych izolowanych z zarodków. Komórki macierzyste pochodzące ze szpiku (np. VSEL) mogą również odgrywać istotną rolę w licznych procesach patologicznych, takich jak rozwój nowotworów, czy zwłóknienie tkanek.
UofL: Magdalena Kucia Dong-Myung Shin Maciej Tarnowski Ewa Zuba-Surma Janina Ratajczak Marcin Wysoczyński Wan Wu Chris Worth PAM: Bogdan Machaliński Maciej Halasa Edyta Paczkowska Katarzyna Grymula SUM: Michał Tendera Wojtek Wojakowski
Problemy do zapamiętania Definicja komórki macierzystej (KM) ukierunkowanej tkankowo Komórka macierzysta totipotencjalna a pluripotencjalna Potencjalne zrodla komorek pluripotencjalnych dla medycyny regeneracyjnej plusy i minusy Plastycznosc krwiotworczych komorek macierzystych alteranatywne mechanizmy Rola osi SDF-1-CXCR4 w krązeniu KM Nisze tkankowe KM Krązenie komórek macierzystych w ustroju Rola KM lokalnych i krazacych w regeneracji narządów Komórki macierzyste linii zarodkowej i somatycznej Rola piętna genomowego w fizjologii KM Metylacja regionu regulatorowego genu IGF2-H19 w fizjologii KM Komorki VSELs pochodzenie i potencjalna rola w ustroju w stanach fizjologii i patologii