Wydział Nauk o Zdrowiu Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach Klinika Położnictwa i Ginekologii Wojewódzki Szpital Zespolony w Kielcach BIOMARKERY W DIAGNOSTYCE ZMIAN SZYJKI MACICY Jastarnia 20. 06. 2015 r.. dr hab. n. med., prof. UJK Wojciech Rokita 1 1 1
Rak Szyjki Macicy na Świecie Liczba zachorowań 500.0000 Liczba zgonów 233.000 Drugi co do częstości występowania nowotwór u kobiet Drugie miejsce wśród przyczyn zgonów nowotworowych u młodych kobiet w Europie Codziennie na raka szyjki macicy umiera w Europie 74 kobiety Arbyn M., Raifu A.O., Autier P. [et al.] Burden of cervical cancer in Europe: estimates for 2004. Ann.Oncol. 2007, 18 2 2
Rak Szyjki Macicy w Polsce 3270 nowych zachorowań (2008 r.) 1745 zgonów (2008r.) 7 miejsce wśród przyczyn zgonów u kobiet na nowotwory złośliwe współczynnik umieralności (standaryzowany) 5,3/100.000 Wojciechowska U., Didkowska J., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2008 roku. Centrum Onkologii Instytut. Warszawa 2010 3 3
Rak Szyjki Macicy w Polsce 3270 nowych zachorowań (2008 r.) 1745 zgonów (2008r.) 7 miejsce wśród przyczyn zgonów u kobiet na nowotwory złośliwe współczynnik umieralności (standaryzowany) 5,3/100.000 Wojciechowska U., Didkowska J., Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2008 roku. Centrum Onkologii Instytut. Warszawa 2010 4 4
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce Raka Szyjki Macicy 1926 Aurel Babes (1886-1961) Bukareszt (Rumunia) odkrycie rozmazu cytologicznego jako narzędzia w diagnostyce raka szyjki macicy 1928 George Nicholas Papanicolau (1883-1962) New York (USA) cytologia w diagnostyce raka szyjki macicy 1942 G.N. Papaniculaou (USA) pierwsza klasyfikacja rozmazów cytologicznych Torres JE, Riopelle MA. History of colposcopy in the United States. Obstet Gynecol Clin N Am, 1993, 20, 1-12 5 5
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce Raka Szyjki Macicy CoxTJ. The Road to Cervical Cancer Prevention: Historical Perspective. In: Modern Colposcopy Textbook&Atlas ed. Mayeaux EJ Jr, Cox TJ. Wolters Kluwer, Philadelphia 2012, 1-13. 6 6
Rozwój Cytodiagnostyki w Profilaktyce Raka Szyjki Macicy 1944 wprowadzenie skriningu cytologicznego w Europie (Wielka Brytania, Skandynawia) 1947 Ayre (Kanada) opatentował szpatułkę do pobierania rozmazów cytologicznych 1949 wprowadzenie skriningu cytologicznego w USA 1988 wprowadzenie systemu oceny rozmazów według Bethesda (The Bethesda System) Torres JE, Riopelle MA. History of colposcopy in the United States. Obstet Gynecol Clin N Am, 1993, 20, 1-12 7 7
Badania Profilaktyczne Raka Szyjki Macicy w Polsce Lata 70-te XX wieku skrining oportunistyczny: Białystok (Kazanowska), Warszawa (Teter), Kielce (Malarewicz) Lata 80-90 te XX wieku początki skriningu aktywnego: Białystok, Warszawa (Ursynów) 2005 r. Wprowadzenie Populacyjnego Programu Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki Macicy 8 8
Skrining Cytologiczny Raka Szyjki Macicy Michalas SP. The Pap test: George N Papanicolaou (1883-1962) A screening test for the prevention of cancer of uterine cervix. Eur J Obstet Gynecol Reprod 2000 Biol 90, 135-138. 9 9
Struktura Organizacyjna PPPWWRSZ w Polsce 10 10
Ograniczenia konwencjonalnej cytodiagnostyki niska czułość wysoki odsetek wyników fałszywie pozytywnych niska jakość techniczna konwencjonalnych rozmazów cytologicznych Belinson J, Qiao Y L, Pretorius R, et al. Shanxi Province Cervical Cancer Screening Study: A cross-sectional comparative trial of multiple techniques to detect cervical neoplasia. Gynecol Oncol. 2001, 83, 439-44. 11 11
Nowe metody cytodiagnostyczne Cytologia na podłożu płynnym (LBC) USA 1996 ThinPrep CYTYC Corporation, Boxborough, MA. 1999 BD SurePath (AutoCyte PREP, BD Diagnostics) 1999 ThinPrep-2000 2000 ThinPrep-3000 Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010, 45. 12 12
Nowe metody cytodiagnostyczne Cytologia na podłożu płynnym (LBC) Poza USA CYTOscreen System (Seroa) Turbitec (Labonord) PapSpin (Shandon) Cytoslide (Menarini) Spin Thin (Shandon) Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010, 45. 13 13
Cytologia na podłożu płynnym (LBC) 14 14
Cytologia na podłożu płynnym (LBC) Rozmaz konwencjonalny Cytologia na podłożu płynnym 15 15
Cytologia na podłożu płynnym (LBC) Rozmaz konwencjonalny Cytologia na podłożu płynnym 16 16
Cytologia na podłożu płynnym (LBC) 17 17
Skrining Cytologiczny Raka Szyjki Macicy Badanie Liczba przypadków Punkt końcowy Czułość (%) Specyficzność (%) AHCPR 1999 > 5000 CIN2+ 51 98 Rokita W 2006 180 CIN2+ 64 87 Cuzick J 2006 60000 CIN 2+ 52 96 Rokita W 2011 687 CIN1+ 58 63 AHCPR Publication No. 99-E010, February 1999., Rokita W. Przeg Gin Poł 2006, 6, 161-65., Cuzick J, Clavel C, Petry KU [et al.]. Int J Cancer 2006, 119, 1095-101, Rokita W. Ginekol Pol 2011, 82, 607-11. 18 18
Skrining Raka Szyjki Macicy w USA Nieprawidłowe wyniki badań cytologicznych 12,200 Ca 300,000 HSIL 1.25 mln LSIL 2-3 mln ASC-US Gravitt PE, Belinson JL, Salmeron J [et al.]. Looking ahead: a case for human papillomavirus testing of selfsampled vaginal specimens as a cervical cancer screening strategy. Int J Cancer 2011, 129, 517-27. 19 19
Skrining Raka Szyjki Macicy w Polsce Nieprawidłowe wyniki badań cytologicznych 01. 01. 2008 31.12. 2008 10 8 6 4 2 0 Spaczyński M, Kotarski J, Nowak-Markwitz E [et al.].postępowanie w przypadku nieprawidłowego wyniku przesiewowego badania cytologicznego. Rekomendacje Centralnego Ośrodka Koordynującego Populacyjny Program Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki Macicy, Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego, Polskiego Towarzystwa Patologów i Polskiego Towarzystwa Kolposkopii i Patofizjologii Szyjki Macicy. Ginekol Pol 2009, 80, 134-138. 20 20
Koszty Skriningu Raka Szyjki Macicy w USA Goldie SJ. Chapter 15: Public health policy and cost-effectiveness analysis. J Natl Cancer Inst Monogr 2003, 102-110 21 21
Postępowanie w przypadku nieprawidłowego wyniku badania cytologicznego kontrolny rozmaz cytologiczny kolposkopia z biopsją celowaną diagnostyczno-terapeutyczne usunięcie zmiany (LLETZ/LEEP, konizacja) test HPV (DNA HPV HR, mrna HPV HR) diagnostyka immunocytochemiczna (p16, Ki67) Spaczyński M, Kotarski J, Nowak-Markwitz E [et al.].postępowanie w przypadku nieprawidłowego wyniku przesiewowego badania cytologicznego. Rekomendacje Centralnego Ośrodka Koordynującego Populacyjny Program Profilaktyki i Wczesnego Wykrywania Raka Szyjki Macicy, Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego, Polskiego Towarzystwa Patologów i Polskiego Towarzystwa Kolposkopii i Patofizjologii Szyjki Macicy. Ginekol Pol 2009, 80, 134-138. 22 22
Skrining raka szyjki macicy testy DNA HPV wysoka czułość niska swoistość wysoki koszt pojedynczego badania mała przydatność w selekcji pacjentek z ASC-US i LSIL brak możliwości zróżnicowania zakażenia latentnego i przetrwałego Rokita W, Kędzia W, Gaj A, Kulig B. Aspekt ekonomiczny wykorzystania wybranych biomarkerów w badaniach przesiewowych raka szyjki macicy. Ginekologia Polska 2010, 81, 774-777. 23 23
Biomarker (marker) nowotworowy Immunocytochemiczna identyfikacja ekspresji białek p16 i Ki67 24 24
Biomarker (marker) nowotworowy substancja wielkocząsteczkowa białko lub glikolipid wytwarzana wyłącznie w komórkach nowotworowych, albo w komórkach nowotworowych i prawidłowych, ale wytwarzanie w komórce nowotworowej znacząco wyższe niż w komórce prawidłowej Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105. 25 25
Biomarkery raka szyjki macicy Białka MCM (monichromosome maintenance proteins) Białko CDC6 (cell division cycle 6) PCNA (proliferating cell nuclear antygen) Telomeraza Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105. 26 26
Biomarkery raka szyjki macicy Inhibitory cyklinozależnej kinazy (A/E-cdk2 oraz Cip/Kip (P21, P27, P57) Czynniki transkrypcyjne Brn-3a i Brn-3b Metylacja DNA Białko p53 Białko Bcl2 Będkowska GE, Ławicki S, Szmitkowski M. Molekularne markery karcynogenezy w diagnostyce raka szyjki macicy. Postepy Hig Med. Dośw, 2009, 63, 99-105. 27 27
Biomarkery raka szyjki macicy Białko p16 INK4a Białko Ki-67 Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010. 28 28
Biomarkery raka szyjki macicy Rola białka p16 kontrola prawidłowego cyklu komórkowego inhibitora cyklinozależnej kinazy CDK hamowanie fosforylacji białka retinoblastoma zatrzymanie podziału komórki w fazie G1 wzrost ekspresji po zapoczątkowaniu transformacji nowotworowej Rokita W. Analiza wartości diagnostycznej wybranych testów molekularnych i immunocytochemicznych w wykrywaniu zmian patologicznych szyjki macicy. Poznań 2010. 29 29
Biomarkery raka szyjki macicy Rola białka Ki 67 marker proliferacji komórkowej uczestnictwo w rybosomalnej biosyntezie ekspresja w fazach: późnej G1, S, G2 i M brak ekspresji w fazie G0 uczestniczy w rybosomalnej biosyntezie Whitfield M.L., George L.K., Grant G.D., Perou C.M.: Common markers of proliferation. Nat. Rev. Cancer, 2006; 6: 99 106. 30 30
Mechanizm ekspresji białka p16 31 31
Białko p16 a rak szyjki macicy białko wpływające na regulację cyklu komórkowego silna ekspresja w stanach przedrakowych i raku szyjki macicy związana z zakażeniem wirusem HR HPV (niezależnie od typu wirusa) bezpośredni związek ekspresji p16 z inaktywacją białka Rb zastępczy marker dla zakażeń HR HPV powodujących transformację nowotworową komórek 32 32
Immunocytodetekcja p16 a p16/ki67 o o o immunocytodetekcja p16 wymaga dodatkowo oceny morfologicznej komórek nabłonkowych immunocyodetekcja p16/ki67 równoczesna identyfikacja dwóch biomarkerów w tej samej komórce marker świadczący o zaburzeniu regulacji cyklu komórkowego poprzez inaktywację białka RB w proliferujacych komórkach nabłonka szyjki macicy 33 33
Immunocytodetekcja p16/ki67 Rozmaz konwencjonalny Cytologia na podłożu płynnym 34 34
Immunocytodetekcja p16/ki 67 35 35
Immunocytodetekcja p16/ki 67 36 36
Immunocytodetekcja p16/ki 67 37 37
Immunocytodetekcja p16/ki 67 38 38
Immunocytodetekcja p16, Ki 67 (test CINtecPlus Cytology) wykrywanie ekspresji białka p16 wykrywanie ekspresji białka Ki67 wykrywanie zmian na poziomie komórkowym lokalizacja komórek z zaburzonym cyklem komórkowym wysoka czułość w detekcji zmian CIN2+ wysoka specyficzność wygoda stosowania (brak konieczności ponownego wzywania pacjentki) 39 39
Cel pracy Określenie efektywności wykrywania patologii szyjki macicy realizowanej za pomocą cytodiagnostyki w oparciu o założenia metodologiczne programu profilaktyki raka szyjki macicy, na przykładzie wybranych rozpoznań cytologicznych ASC-US, LSIL, HSIL. Analiza zmian w efektywności wykrywania patologii szyjki macicy jakie zachodzą przy modyfikacji stosowanego w skriningu narzędzia diagnostycznego uzupełnionego o oznaczenie DNA HPV HR lub mrna HPV HR lub immunocytodetekcję białka p16 i Ki67 40 40
Cel pracy Analiza ekonomiczna opłacalności proponowanych zmian metody diagnostycznej wykorzystywanej w badaniach przesiewowych raka szyjki macicy. Ocena kosztów wykorzystania detekcji molekularnej DNA HPV HR, mrna HPV HR oraz immunocytochemicznej identyfikacji p16ink4a i Ki67 jako metod wykrywających CIN2+ w skriningu raka szyjki macicy. 41 41
Materiał 630 kobiet w wieku 25 65 lat (średnia 45 lat ± SD) z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego okres prowadzonych badań 01. 01. 2008 31.10.2010 r. ośrodki badawcze Pracownia Patofizjologii Szyjki Macicy GPSK im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Oddział Położniczo Ginekologiczny Szpitala Kieleckiego w Kielcach 42
Materiał 43 43
Materiał Kolposkopia biopsja celowana 44 44
Materiał Wyłączenia kobiety ciężarne podejrzenie w rozmazie cytologicznym zmian w obrębie nabłonka gruczołowego (2 przypadki) 45 45
Metodyka Zastosowane metody badawcze Kolposkopia z biopsją celowaną i badaniem histopatologicznym Diagnostyka cytologiczna (barwienie metodą Papanicolaou) Identyfikacja DNA HPV HR (test Amplicor) Wykrywanie transkryptów mrna HPV HR (test NucliSENS EasyQ ) Immunocytochemiczna identyfikacja białek p16 i Ki67 (test CINtecPlus Cytology) 46 46
Metoda Test AMPLICOR test PCR amplifikacja DNA 13 typów wirusa (16, 18, 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) możliwość wykonania genotypowania bardzo wysoka czułość testu 47 47
Metoda Test NucliSENS EasyQ wykrywanie transkryptów mrna onkogenu E6 HPV16 oraz E7 HPV: 18, 31, 33, 45 wysoka czułość bardzo wysoka specyficzność 48 48
Metoda Immunocytodetekcja p16, Ki 67 (test CINtecPlus Cytology) wykrywanie ekspresji białka p16 wykrywanie ekspresji białka Ki67 wysoka czułość w detekcji zmian CIN2+ wysoka specyficzność wygoda stosowania (brak konieczności ponownego wzywania pacjentki) 49 49
Materiał 50
Wyniki Cała badana populacja Rozmaz cytologiczny (p<0,00001) 200 520 110 222 252 46 277 121 0 51 51
Wyniki Wynik badania histopatologicznego 10 8 6 222 408 287 4 121 2 0 52 52
Analiza statystyczna Czułość (sensitivity SENS) Specyficzność (specificity SPEC) Wskaźnik wiarygodności dodatniego wyniku testu (likelihood ratio-lr+) Wskaźnik wiarygodności ujemnego wyniku testu (likelihood ratio-lr-) Dodatnią wartość predykcyjną (Positive Predictive Value PPV) Ujemną wartość predykcyjną (Negative Predictive Value PPV) Dokładność (Accuracy ACC) 53 53
Wyniki Rodzaj badania Cytologia Test DNA HPV HR Test mrna HPV HR Wynik Wynik badania histopatologicznego Analiza statystyczna prawidłowy LGSIL HGSIL (CIN2+) norma 51 (23,0%) 39 (14,1%) 20(15,3%) ASC-US 102(45,9%) 87 (31,4%) 33 (25,2%) LSIL 61 (27,5%) 139 (50,2%) 52 (39,7%) HSIL 8 (3,6%) 12 (4,3%) 26 (19,8%) patologia 171 (77,0%) 238 (85,9%) 111 (84,7%) dodatni 140 (67,0%) 212 (91,4%) 107 (91,5%) ujemny 69 (33,0%) 20 (8,6%) 10 (8,5%) dodatni 42 (33,3%) 148 (69,5%) 65 (79,3%) ujemny 84 (66,7%) 65 (30,5%) 17 (20,7%) dodatni 10 (33,3%) 11 (47,8%) 15 (100%) x²=18,20 p<0,00001 ujemny 20 (66,7%) 12 (52,2%) 0 (0,0%) V=0,52 p16 Ki 67 x²=69,79 p<0,00001 V=0,24 x²=53,41 p<0,00001 V=0,31 x²=58,23 p<0,00001 V=0,37 54 54
Wyniki Kobiety z rozpozaniem CIN2+ SENS (%) SPEC (%) LR+ LR- PPV (%) NPV (%) ACC (%) Cytologia- ASC-US 62 33 0,93 1,13 24 72 41 Cytologia - LSIL 72 46 1,33 0,61 46 72 56 Cytologia - HSIL 57 86 4,17 0,50 76 72 73 Rozmaz cytologiczny 85 23 1,10 0,66 39 72 46 Test DNA HPV HR 91 33 1,37 0,26 43 87 54 Test mrna HPV HR 79 67 2,38 0,31 61 83 72 p16 Ki67 100 67 3,00 0,00 60 100 78 55 55
Wyniki Grupa kobiet ze zmianami CIN2+ 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 56 56
Koszt wykrycia pojedynczego przypadku patologii szyjki macicy KPT Koszt = ACC KPT koszt pojedynczego testu ACC dokładność testu 57 57
Koszt wykrycia pojedynczego przypadku CIN2+ Rodzaj badania Koszt w PLN Dokładność testu (ACC ) % Koszt wykrycia CIN2+ w PLN Cytologia 65,00 46 141,00 Test DNA HPV HR 219,00 54 405,00 Test mrna HPV HR 389,00 72 540,00 P16 Ki67 ok. 100,00 78 128,00 Kolposkopia z biopsją celowaną 600,00 100 600,00 58 58
Koszt wykrycia pojedynczego przypadku CIN2+ w PLN 10 8 6 4 2 0 59 59
Szacunkowe koszty realizacji Etapu Pogłębionego Metoda diagnostyczna Szacunkowy PPPWWRSzM koszt całkowity (PLN) Szacunkowa oszczędność (PLN) Kolposkopia z biopsją celowaną 20935200,00 0,00 Test DNAHPV 14131260,00 6803940,00 Test mrna 18841680,00 2093520,00 CINtecPlus P16 Ki67 4466176,00 16469024,00 60
Szacunkowe koszty (w PLN) realizacji etapu pogłębionego PPPWWRSzM 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 61 61
Wnioski 1. Wykorzystanie metody immunocytochemicznej w badaniach przesiewowych do wykrywania zmian typu CIN2+ jest najbardziej ekonomicznie uzasadnione w porównaniu do testów DNA HPV HR i mrna HPV HR oraz cytodiagnostyki 62 62
Wnioski 2. Efektywność cytodiagnostyki konwencjonalnej, stosowanej w polskim programie profilaktyki wtórnej raka szyjki macicy dorównuje europejskim standardom, ale nie zapewnia osiągnięcia wysokich parametrów czułości, swoistości i dokładności tej metody w wykrywaniu patologii szyjki macicy. 63 63
Wnioski 3. Najwyższą efektywność cytodiagnostyki konwencjonalnej uzyskano dla wykrycia rzeczywistej patologii szyjki macicy, czyli zmian przedrakowych dużego stopnia CIN2+. 64 64
Wnioski 4. Satysfakcjonującą efektywność diagnostyczną, wyrażoną maksymalną czułością i wysoką swoistością oraz najwyższą dokładnością w wykrywaniu rzeczywistej patologii szyjki macicy, czyli zmian przedrakowych CIN2+ wykazano dla modyfikacji konwencjonalnej cytodiagnostyki za pomocą immunocytochemicznej identyfikacji biomarkerów p16ink4a i Ki-67. 65 65
Wnioski 5. Analiza kosztów wykrycia patologii szyjki macicy, wykonana pod kątem dokładności metody modyfikującej efektywność konwencjonalnej cytodiagnostyki, wykazała, że immunocytochemiczna identyfikacja biomarkerów p16ink4a i Ki-67 jest najbardziej uzasadnioną ekonomicznie metodą mającą zastosowanie w profilaktycznych badaniach przesiewowych. 66 66
67 67
68 68
69 69
70 70
71 71
Dziękuję za uwagę 72 72