Zastosowanie dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej do separacji kumaryn Wstęp Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej (2D-TLC) do separacji i identyfikacji kumaryn. W trakcie ćwiczenia zostanie wykonana ekstrakcja kumaryn ze sproszkowanych korzeni arcydzięgla w aparacie Soxhleta. Następnie ekstrakt zostanie rozdzielony techniką 2D-TLC, co umożliwi identyfikację wybranych kumaryn arcydzięgla. 6 5 4 3 7 8 1 2 Rys. 1. Struktura benzo-α-pironu. Kumaryny są pochodnymi benzo-α-pironu (rys. 1) występującymi zarówno w postaci wolnej oraz jako glikozydy. Ze względu na budowę strukturalną wyodrębnia się cztery typy kumaryn: kumaryny proste, izokumaryny, furanokumaryny oraz piranokumaryny. KUMARYNY PRSTE H H 3 C umbeliferon 7-hydroksykumaryna ostol H 3 C CH 3 FURANKUMARYNY angelicyna psoralen H 3 C H 3 C bergapten 5-metoksypsoralen ksantotoksyna 8-metoksypsoralen Rys. 2. Wzory strukturalne wybranych kumaryn prostych oraz furanokumaryn występujących w arcydzięglu 1
Najbogatszym źródłem kumaryn są rośliny z rodzin Rutaceae oraz Apiaceae. Arcydzięgiel litwor (Angelica archangelica, synonim Archangelica officinalis) przedstawiciel rodziny Apiaceae zawiera między innymi furanokumaryny: angelicynę, archangelicynę, bergapten, imperatorynę, ksantotoksynę oraz kumaryny proste: ostol i umbeliferon (rys. 2). Zawartość ostolu wynosi nawet około 0,2 % suchej masy korzenia arcydzięgla. Archangelicae radix (korzeń arcydzięgla) jest wykorzystywany w lecznictwie (w zaburzeniach trawienia, wzdęciach, jako środek wzmagający łaknienie i pobudzający wydzielanie soku trawiennego). Uwaga: furanokumaryny mają działanie fotouczulające. Kumaryny są substancjami stosunkowo lotnymi o charakterystycznym zapachu. Rozpuszczalność kumaryn zależy od obecności (bądź nie) wiązania glikozydowego oraz od podstawników hydroksylowych w cząsteczkach. Glikozydy kumarynowe rozpuszczają się dobrze w wodzie i polarnych rozpuszczalnikach takich jak metanol i etanol. Furanokumaryny i piranokumaryny są rozpuszczalne w średniopolarnych i niepolarnych rozpuszczalnikach takich jak chlorek metylenu, chloroform czy eter naftowy. Dobór rozpuszczalnika do ekstrakcji kumaryn zależy od rodzaju kumaryn występujących w badanej próbce. Analizy TLC kumaryn są najczęściej wykonywane na żelu krzemionkowym. Fazy ruchome stosowane do separacji furanokumaryn i piranokumaryn to mieszaniny: eter naftowy-eter dietylowy, toluen-octan etylu, heksan-octan etylu natomiast do separacji kumaryn prostych: średniopolarne rozpuszczalniki takie jak na przykład chlorek metylenu. Analizy TLC kumaryn monitoruje się za pomocą światła UV. Kumaryny wykazują silne właściwości fluorescencyjne pod wpływem promieniowania UV, co powoduje, że ich detekcja jest stosunkowo prosta. Fluorescencja jest to zjawisko emitowania przez niektóre związki chemiczne światła pod wpływem naświetlania zewnętrznym promieniowaniem. Można zaobserwować charakterystyczne kolory plamek kumaryn; na przykład: niebieski (umbeliferon), niebiesko-zielony (ksantotoksyna), żółto-zielony (izopimpinelina) pod wpływem światła UV o długości fali 365 nm. bserwowane kolory kumaryn nie pozwalają na ich ostateczną identyfikację i mogą być jedynie wskazówką przy identyfikacji. Niestety występujące w naturze mieszaniny kumaryn są trudne do rozdzielenia za pomocą jednowymiarowych technik TLC. Dlatego do separacji kumaryn stosuje się często technikę dwuwymiarową (2D-TLC) dla pełnego rozdzielenia związków o podobnych właściwościach chemicznych. Pojedynczą próbkę nanosi się w jednym rogu płytki TLC, którą następnie rozwija się w pierwszym kierunku (rys. 3). Składniki próbki są częściowo 2
rozdzielone wzdłuż jednego boku płytki. Chromatogram po wysuszeniu i obróceniu o 90 jest rozwijany ponownie w drugim kierunku z użyciem fazy ruchomej o innym składzie. Rys. 3. Dwuwymiarowa chromatografia cienkowarstwowa Część doświadczalna Ekstrakcja dważyć około 5 g zmielonego korzenia arcydzięgla za pomocą wagi precyzyjnej w zlewce o V = 100 ml. Wprowadzić próbkę do gilzy, którą po zamknięciu niewielką ilością waty należy umieścić w aparacie Soxhleta. Do kolby okrągłodennej o V = 250 ml wrzucić kamyczki wrzenne i wprowadzić 120 ml eteru naftowego. Kolbę wraz z zawartością umieścić w płaszczu grzejnym, połączyć z aparatem Soxhleta oraz chłodnicą zwrotną. Po włączeniu przepływu wody przez chłodnicę należy włączyć stabilizator napięcia i ustawić jego pokrętło w pozycji 2-3. Ekstrakcję prowadzić 1,5 godziny, po czym wyłączyć ogrzewanie. Zawartość kolby ekstrakcyjnej przenieść przez lejek porcjami do kolby o V = 100 ml, zatężyć do objętości około 1,0 1,5 ml na odparowywaczu obrotowym w temp. 30 C, następnie przelać do szklanej ampułki i zatężyć w strumieniu azotu do objętości 0,25 ml. Chromatografia cienkowarstwowa TLC Należy wykonać analizy TLC ekstraktu z korzenia arcydzięgla oraz wzorców kumaryn (bergapten, umbeliferon, ksantotoksyna) na małych płytkach TLC (o wymiarach 4 6,5 cm) przy użyciu następujących faz ruchomych: - faza 1: chloroform, - faza 2: eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v). Należy policzyć wartości współczynników opóźnienia (R F ) dla rozdzielanych wzorców kumaryn oraz składników ekstraktu z obu analiz. 3
Następnie należy wykonać analizę TLC ekstraktu z korzenia arcydzięgla przy zastosowaniu techniki dwuwymiarowej na dużej płytce TLC (o wymiarach 10 10 cm). W tym celu należy nanieść ekstrakt na płytkę w lewym dolnym rogu w odległości 1,5 cm od obu brzegów płytki. Nie należy nanosić na jedną płytkę dwóch (lub więcej) różnych roztworów. Rozwijanie chromatogramu w jednym kierunku trwa co najmniej 0,5 godziny. dpowiednio wcześniej należy przygotować dwie duże komory chromatograficzne zawierające: - komora 1 faza 1: chloroform, - komora 2 faza 2: eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v). Rozwinąć chromatogram przy użyciu fazy 1. Wysuszyć bardzo dokładnie płytkę tak, aby usunąć całkowicie rozpuszczalnik. bejrzeć płytkę TLC w świetle UV i bardzo delikatnie obrysować plamki ołówkiem. Nie wolno zniszczyć powierzchni sorbentu. Należy policzyć wartości współczynników opóźnienia (R F ) dla składników ekstraktu. Rozwinąć ponownie chromatogram przy użyciu fazy 2 w kolejnej komorze chromatograficznej. W tym celu należy płytkę wprowadzić do komory obróconą o 90 w lewo. Powtórnie obejrzeć płytkę TLC w świetle UV i bardzo delikatnie obrysować plamki ołówkiem. Następnie policzyć wartości współczynników opóźnienia (R F ) dla składników ekstraktu. Zidentyfikować składniki ekstraktu dzięki porównaniu ich wartości współczynników opóźnienia z wartościami uzyskanymi dla wzorców kumaryn przy użyciu obu faz. Procedura analizy TLC. Napełnić odpowiednią komorę chromatograficzną fazą ruchomą (mała komora: V = 3 ml, duża komora: V = 40 ml). Przygotować płytki TLC, czyli narysować delikatnie miękkim ołówkiem: - linię startową około 1 cm od dolnego brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia próbek, - linię końcową około 1 cm od górnego brzegu płytki. Nanieść na płytkę po około 1 µl roztworów badanych wzorców (około 2-4 µl roztworu ekstraktu), uważając, aby plamka nie miała średnicy większej niż 2 mm; im mniejsza średnica, tym mniejsze rozmycie plamki w czasie rozwijania chromatogramu. Średnica plamki ma szczególne znaczenie w 2D-TLC. Można powtarzać nanoszenie roztworu po jego wyschnięciu na płytce. Ilość nanoszonego roztworu zależy od jego stężenia. Badane związki mają właściwości fluorescencyjne, co powoduje, że łatwo można kontrolować ilość nanoszonego roztworu. Należy nanieść taką ilość roztworu, aby uzyskać intensywne zabarwienie plamki widoczne w świetle UV. 4
Delikatnie, przy pomocy pęsety, wstawić płytkę TLC z naniesionymi substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory. Zamknąć komorę i rozwijać chromatogram, do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości 1 cm od górnego brzegu płytki, następnie wyjąć i wysuszyć dokładnie płytkę. bejrzeć płytkę TLC w świetle UV, obrysować plamki ołówkiem, zrobić zdjęcie lub zeskenować płytkę TLC i dołączyć do sprawozdania. Wyznaczyć współczynniki opóźnienia R F i zanotować zabarwienie dla wszystkich plamek. Zidentyfikować składniki ekstraktu. Literatura 1. Waksmundzka-Hajnos M., Hawrył M.A. Application of TLC in the isolation and analysis of coumarins. W: Thin layer chromatography in Phytochemistry. Waksmundzka-Hajnos M., Sherma J., Kowalska T. (red.), CRC Press, Boca Raton, 2008. 2. Cieśla Ł., Waksmundzka-Hajnos M. Two-dimensional thin-layer chromatography in the analysis of secondary plant metabolites. Journal of Chromatography A, 1216, 2009, 1035 1052. 3. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. Springer, 2009. Szkło i odczynniki Ekstrakcja: suszony korzeń arcydzięgla (archangelicae radix), zlewka V = 100 ml, łyżka, zestaw do ekstrakcji w aparacie Soxhleta (płaszcz grzejny, regulator napięcia, aparat Soxhleta, chłodnica zwrotna, kolba okrągłodenna V=250 ml), gilzy do ekstrakcji, kamyczki wrzenne do destylacji, cylinder miarowy V = 250 ml, kolbka do odparowywacza V = 100 ml, reduktor do odparowywacza, lejek średni, statyw do lejka, eter naftowy V = 250 ml, wata TLC: płytki do TLC silica gel 60 firmy Merck, o wymiarach 4 6,5 cm oraz 10 10 cm, strzykawka lub kapilary do TLC, chlorek metylenu do mycia strzykawki V = 25 ml, 2 małe komory chromatograficzne do TLC, 2 duże komory chromatograficzne do TLC, metalowa pęseta, pipeta V = 5 ml, pompka do pipet, cylinder miarowy V = 50 ml, linijka oraz miękki ołówek, pisak do szkła, chloroform V = 100 ml, octan etylu V = 100 ml, roztwór eter naftowy-octan etylu (70:30, v/v) V = 100 ml, roztwór wzorcowy bergaptenu c = 5 mg/ml, roztwór wzorcowy umbeliferonu c = 5 mg/ml, roztwór wzorcowy ksantotoksyny c = 5 mg/ml, ręczna suszarka do włosów Uwaga: Nie wolno suszyć komór chromatograficznych w suszarce, ponieważ pękają! W archiwizacji płytek TLC pomocny jest cyfrowy aparat fotograficzny. 5