MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 39-46 Występowanie i charakterystyka genu aac(6 )-Ib-cr kodującego enzym modyfikujący fluorochinolony u opornych na ciprofloksacynę szczepów Enterobacteriaceae wyizolowanych od ludzi. Occurrence and characterisation of aac(6 )-Ib-cr gene encoding fluoroquinolone-modifying enzyme in clinical ciprofloxacin-resistant Enterobacteriaceae strains isolated in Poland Katarzyna Piekarska 1, Magdalena Rzeczkowska 1, Anna Chróst 1, Tomasz Wołkowicz 1, Katarzyna Zacharczuk 1, Elżbieta Bareja 2, Monika Olak 2, Rafał Gierczyński 1 1 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny 2 Pracownia Bakteriologii Zakładu Diagnostyki Laboratoryjnej Wojskowego Instytutu Medycznego U 15 opornych na fluorochnolony izolatów pałeczek należących do rodziny Enterobacteriaceae poszukiwano obecności genu aac(6 )-Ib-cr, warunkującego wytwarzanie dwufunkcyjnego enzymu acetylotransferazy aminoglikozydowej. Stosując technikę PCR, a następnie wykonując analizę restrykcyjną powstałych produktów PCR przy użyciu endonukleazy BseGI, obecność tego genu wykryto u 11 izolatów. Analiza sekwencji DNA produktów PCR pozwoliła stwierdzić występowanie mutacji znaczących niezbędnych do redukcji przeciwbakteryjnej aktywności hydrofilowych fluorochinolonów - ciprofloksacyny i norfloksacyny w dwóch kluczowych kodonach tj. 102 i 179. W kodonie 102 nastąpiła substytucja Trp102 Arg (W102 R), zaś w kodonie 179 Asp179 Tyr (D179 Y). Wykrycie obecności genu aac(6 )- -Ib-cr w przypadku 11 izolatów na 15 stanowiących przedmiot badania może wskazywać na znaczne rozpowszechnienie tego mechanizmu oporności wśród opornych na fluorochinolony pałeczek Enterobacteriaceae. Słowa kluczowe: acetylotransferaza aminoglikozydowa wariant, aac(6 )-Ib-cr, fluorochinolony, mechanizmy plazmidowe, Enterobacteriaceae Badania wykonane w ramach projektu badawczego NN 404 0850 40.
40 K. Piekarska i inni Nr 1 ABSTRACT Introduction: The aac(6 )-Ib-cr gene encodes a variant of aminoglycoside acetyltransferase that confers reduced susceptibility to hydrophilic fluoroquinolones such as ciprofloxacin and norfloxacin. AAC(6 )-Ib-cr has two amino acid changes, Trp102Arg and Asp179Tyr, which together are necessery and sufficient for the enzyme s ability to reduce the activity of fluoroquinolones, including ciprofloxacin and norfloxacin. The aim of this study was to evaluate the prevelance of aac(6 )-Ib-cr determinant among 15 Enterobacteriaceae isolates randomly chosen from 215 fluorochinolone resistant strains recovered during the 6 months of 2010. Methods: The aac(6 )-Ib was detected by PCR. The presence of aac(6 )-Ib-cr gene variant was futher identified by digestion with BseGI (BtsCI) and sequencing. Results: 11/15 of the resistant (MIC CIP 2-1024 µg/ml) Enterobacteriaceae strains carried aac(6 )-Ib-cr variant. Conclusion: This is the first study identifying the variant of aminoglycoside acetyltransferase determinant in Poland. Our results demonstrate that this enzym may be even more widespread than Qnr determinants among fluoroquinolone resistant Enterobacteriaceae in Poland. Key words: aminoglicoside acetyltransferase, aac(6 )-Ib-cr, fluoroquinolones, plasmid- -mediated resistance, Enterobacteriaceae WSTĘP Zarówno aminoglikozydy, jak i fluorochinolony należą do związków przeciwbakteryjnych o szerokim spektrum działania, powszechnie stosowanych w terapii zakażeń. Wraz ze wzrostem używania tych leków w lecznictwie, bakterie rozwinęły różne mechanizmy zabezpieczające je przed śmiercią. Przez wiele lat panował pogląd, że oporność na fluorochinolony warunkowana jest głównie przez mechanizmy chromosomalne, tj. mutacje w genach gyrazy i topoizomerazy IV. Ponadto sądzono, że oporność na te związki jest także wynikiem niespecyficznych mechanizmów tj. nadekspresji białek błonowych tzw. pomp efflux lub spadku przepuszczalności białek porynowych (6). Jednakże, w 1998 roku opisano pierwszy plazmidowy mechanizm oporności na fluorochinolony warunkowany przez gen qnr (obecnie qnra) kodujący białko, które chroni bakteryjne DNA gyrazy i topoizomerazy IV przed działaniem fluorochinolonów (5). W 2006 roku, zidentyfikowano drugi plazmidowo warunkowany mechanizm oporności dwufunkcyjny enzym acetylotransferazy aminoglikozydowej, którego wytwarzanie skutkuje redukcją wrażliwości na wybrane fluorochinolony (9). Wśród pałeczek gram ujemnych, acetylotransferazy aminoglikozydowe AAC(6 )-Ib stanowią jeden z najbardziej rozpowszechnionych mechanizmów oporności na antybiotyki aminoglikozydowe (7). Wytwarzanie enzymów z tej grupy, warunkowane jest obecnością genu aac(6 )-Ib, występującego w około 30 wariantach. Ich działanie polega na modyfikacji cząsteczki aminoglikozydu, powodującej utratę powinowactwa do podjednostki 16S rrna, stanowiącej przyczynę oporności na najczęściej stosowane w lecznictwie antybiotyki z tej grupy tj, tobramycynę, kanamycynę i amikacynę (10, 11, 14). W ostatnich latach zidenty-
Nr 1 Enzym pałeczek Enterobacteriaceae modyfikujący fluorochinolony 41 fikowano dwufunkcyjny wariant acetylotransferazy aminoglikozydowej, oznaczany jako AAC(6 )-Ib-cr, który dodatkowo posiada zdolność do strukturalnej modyfikacji fluorochinolonów (9). Wariant ten charakteryzuje się obecnością dwóch określonych mutacji znaczących, prowadzących do substytucji aminokwasów w kodonach Trp102 Arg (W102 R) i Asp179 Tyr (D179 Y) (2, 8, 10, 11, 14). Zmiany te są niezbędne do redukcji przeciwbakteryjnej aktywności hydrofilowych fluorochinolonów tj. ciprofloksacyny i norfloksacyny (10). Związane jest to ze zdolnością białka AAC(6 )-Ib-cr do N-acetylacji grupy aminowej znajdującej się w pierścieniu piperazynowego podstawnika hydrofilowych fluorochinolonów (2, 8, 10, 11). Obie wspomniane mutacje znaczące są wynikiem polimorfizmu jednego nukleotydu T304C/A i G535C (4, 13), co było podstawą wyróżnienia dwóch subwariantów tj. aac(6 )-Ib-crA i aac(6 )-Ib-crC (12, 13). Pomimo tego, że wytwarzanie wariantu cr acetylotransferazy determinuje niski poziom oporności na hydrofilowe fluorochinolony, to przyczynia się jednak skutecznie do selekcji szczepów charakteryzujących się wysokim poziomem oporności na te chemioterapeutyki, warunkowanym obecnością mutacji znaczących w określonych rejonach tzw. QRDR (ang. quinolone resistance - determining regions) podjednostek gyrazy i topoizomerazy IV. Według niektórych autorów, genetyczna determinanta aac(6 )-Ib-cr rozprzestrzenia się szybko, zaś jej obecność stwierdzona została u różnych gatunków z rodziny Enterobacteriaceae (2, 8, 11). W krajowym piśmiennictwie brak jest jak dotąd prac dotyczących sposobu wykrywania, jak i częstości występowania genu aac(6 )-Ib-cr. Dlatego prezentowane badania były próbą udzielenia odpowiedzi na te dwa pytania. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Badaniom poddano 15 losowo wybranych, spośród 215, opornych na fluorochinolony izolatów należących do rodziny Enterobacteriaceae, które wyosobniono z materiału klinicznego od chorych w jednym z warszawskich szpitali. Izolaty kolekcjonowano przez okres 6 miesięcy, tj. od 1.03. do 31.08.2010 roku. Przynależność gatunkową i profil lekowrażliwości badanych izolatów określono przy użyciu komercyjnego zestawu diagnostycznego Vitek 2 (BioMerieux, Francja). MIC. Oznaczanie wartości najmniejszego stężenia hamującego (MIC) norfloksacyny, ciprofloksacyny i sparfloksacyny metodą podwójnych rozcieńczeń w podłożu agarowym dla 215 izolatów wykonano zgodnie z wytycznymi CLSI (4). Interpretację uzyskanych wyników przeprowadzono zgodnie z zaleceniami EUCAST, przyjmując za oporne szczepy, których wartość MIC norfloksacyny i ciprofloksacyny wynosiła (>1 µg/ml). Przy oznaczaniu wrażliwości na fluorochinolony jako kontrolę zastosowano szczep E. coli ATCC 25922. Izolacja genomowego DNA i PCR. Preparaty matrycowego DNA badanych szczepów przygotowywano według wcześniej opisanej procedury (3). W celu amplifikacji wariantów genu aac(6 )-Ib posłużono się starterami PCR: F - 5 TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA i R - 5 CTCGAATGCCTGGCGTGTTT stosując warunki termiczne reakcji PCR opisane przez Park i wsp. (8). Analiza restrykcyjna. Produkty PCR o oczekiwanej wielkości 482 pz poddano analizie restrykcyjnej używając, wcześniej opisany przez Yang i wsp. (16), enzym BseGI (BtsCI) firmy Fermentas. Brak fragmentów restrykcyjnych o wielkości 210 i 272 pz,
42 K. Piekarska i inni Nr 1 wskazywał na obecność genu aac(6 )-Ib-cr, warunkującego wytwarzanie wariantu acetylotransferazy aminoglikozydowej. Sekwencjonowanie. Produkty PCR oczyszczono przy użyciu odczynnika ExoSAP- -IT (Affymetrix), a następnie poddano reakcji sekwencjonowania (Genomed) stosując starter 5 CGTCACTCCATACATTGCAA (8). Analizę sekwencji nukleotydowych prowadzono przy użyciu programu CLC Sequence Viewer v. 6.3. (CLC). PFGE. Analizę polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych chromosomalnego DNA przeprowadzono przy użyciu endonukleazy XbaI (Fermentas Life Science) i aparatu CHEF DR II (Biorad, USA) według metodyki przedstawionej uprzednio (16). Analizę uzyskanych profili PFGE przeprowadzono przy użyciu programu BioNumerics v. 6.6. (Applied Maths) stosując współczynnik podobieństwa Dice a. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wykrywanie genu aac(6 )-Ib-cr opiera się głównie na stosowaniu techniki PCR i sekwencjonowaniu uzyskanego produktu (1). Niektórzy autorzy uzyskane produkty PCR poddają analizie restrykcyjnej z zastosowaniem odpowiedniej endonukleazy (8, 16). Opisano także odmianę sekwencjonowania DNA umożliwiającą szybkie wykrywanie genów aac(6 )-Ib i aac(6 )-Ib-cr (4). W prezentowanych badaniach, w celu wykrycia obecności genu aac(6 )-Ib-cr posłużono się techniką PCR, a uzyskany produkt PCR poddano zarówno analizie restrykcyjnej stosując enzym BseGI (BtsCI), jak i sekwencjonowanie. Gen aac(6 )-Ib-cr cechuje się brakiem miejsca restrykcyjnego charakterystycznego dla edonukleazy BseGI po trawieniu enzymem pozostaje jeden prążek (8). Natomiast w przypadku szczepu dzikiego, który posiada gen aac(6 )-Ib nie będący wariantem cr, restryktaza tnie produkt PCR na dwa odcinki 242 i 240 pz. U 11 spośród 15 izolatów stanowiących przedmiot badań wykryto amplifikat genu aac(6 )-Ib. Izolaty te należały do gatunków E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae i P. mirabilis. Analiza restrykcyjna tych amplifikatów wykazała brak miejsca cięcia, wskazując tym samym, że w przypadku wszystkich izolatów (n = 11), obecny był gen aac(6 )-Ib-cr warunkujący wytwarzanie wariantu cr acetylotransferazy aminoglikozydowej. Analiza sekwencji nukleotydów wykazała w przypadku 8 z 11 izolatów występowanie subwariantu aac(6 )-Ib-crC tzn. w pozycji 304 nastąpiła zmiana nukleotydu T C, co jest zgodne z danymi piśmiennictwa (4, 13). Ponadto, Guillard i wsp. (4) w pozycji 535 stwierdzili zmianę nukleotydów polegającą na podstawieniu G C. Natomiast w naszych badaniach we wszystkich 11 badanych izolatach w pozycji 535 wykryto zmianę polegającą na podstawieniu G A. W przypadku 8 izolatów, stwierdzono obecność mutacji znaczących w dwóch kluczowych kodonach tj. 102 i 179. W kodonie 102 nastąpiła substytucja Trp102 Arg (W102 R), zaś w kodonie 179 Asp179 Tyr (D179 Y), co obserwowali również inni autorzy (2, 8, 10, 11, 14). Natomiast, w przypadku 3 izolatów (Ryc. 1), u których w kodonie 102 występuje litera X, niemożliwa była jednoznaczna interpretacja uzyskanego wyniku, gdyż w chromatogramie, w pozycji 304 obserwowano wysoki poziom sygnału dla dwóch nukleotydów tj. T i C, co może świadczyć o heterogenności DNA w komórkach badanych izolatów i wskazuje na potrzebę przeprowadzenia dokładnych analiz.
Nr 1 Enzym pałeczek Enterobacteriaceae modyfikujący fluorochinolony 43 U trzech izolatów, oznaczonych na Ryc. 1 jako 36, 181 i 208, stwierdzono jedynie mutację znaczącą występującą w kodonie 179 (D179 Y). Według Vetting i wsp. (15) występowanie pojedynczej substytucji w kodonie 179 przyczynia się do niewielkiego wzrostu wartości MIC ciprofloksacyny (w porównaniu z wartościami osiąganymi w przypadku występowania dwóch mutacji). Dlatego też, substytucji tej przypisuje się rolę polegającą na zwiększeniu powinowactwa wytwarzanego wariantu enzymu, AAC-(6 )-Ib-cr, do hydrofilowych fluorochinolonów. Natomiast substytucja w kodonie 102 pełni rolę stabilizatora tej reakcji (15). Zgodnie z tą tezą uzyskny wynik może świadczyć o niezależnie zachodzącym procesie kierunkowej selekcji wariantu cr u różnych szczepów. Wymienione wyżej izolaty charakteryzowały się wysoką opornością na ciprofloksacynę (MIC CIP 64 mg/l; MIC NOR 128 mg/l) (Tabela I), co prawdopodobnie jest wynikiem obecności mutacji znaczących w QRDR gyrazy i topoizomerazy IV. Tabela 1. Charakterystyka 15 izolatów wykazujących oporność na fluorochinolony Nr izolatu Gatunek Materiał MIC (mg/l) NOR CIP SPX Profil oporności na aminoglikozydy aac-(6 )- Ib-cr 3 E. cloacae mocz 4 2 2 GM, TOB + 13 E. coli mocz 256 128 64 TOB + 92 E. cloacae mocz 32 15 32 GM, TOB + 134 E. coli mocz 1024 512 256 GM, TOB + 155 E. coli mocz 512 256 64 TOB + 167 E. coli drogi żółciowe 32 16 16 TOB + 184 K. pneumoniae mocz >1024 >1024 16 TOB + 218 P. mirabilis rana 16 4 64 GM, TOB + 42 K. pneumoniae mocz 512 256 32 GM, TOB + 60 K. pneumoniae mocz 1024 1024 256 GM, TOB + 154 E. coli krew 1024 256 128 TOB + 36 K. pneumoniae mocz 128 128 256-181 E. cloacae rana 256 128 32-206 P. mirabilis wym. z tchawicy 8 4 16 GM, TOB - 208 E. coli popłuczyny oskrzelowe 128 64 64 NOR norfloksacyna, CIP ciprofloksacyna, SPX sparfloksacyna, GM gentamicyna, TOB tobramycyna Tylko 1 izolat na 15 poddanych analizie nie posiadał mutacji znaczących w kluczowych kodonach tj. 102 i 179. Zdecydowana większość badanych izolatów (n = 10) charakteryzowała się wysoką opornością na ciprofloksacynę, MIC 32 mg/l (Tabela 1). Ponadto, u 11 izolatów charakteryzujacych się obecnością genu aac(6 )-Ib-cr warunkującego wytwarzanie wariantu acetylotransferazy stwierdzono niewrażliwość (tj. oporność lub średnią wrażliwość) na tobramycynę. Niemniej jednak, wszystkie te izolaty pozostawały wrażliwe na amikacynę, będącą także substratem acetylotransferazy aminoglikozydowej. Natomiast 6 izolatów spośród 11, u których wykryto gen aac(6 )-Ib-cr wykazywało oporność na gentamicynę, związek wolno rozkładany przez acetylotransferazę aminoglikozydową.
44 K. Piekarska i inni Nr 1 Ryc. 1. Zestawienie przewidywanej sekwencji aminokwasowej acetylotransferazy aminoglikozydowej wariant badanych izolatów z referencyjną sekwencją aminokwasową acetylotransferazy aminoglikozydowej (accession no. YP006501621). W tryptofan; R arginina; D kwas asparaginowy; Y tyrozyna; X w pozycji 304 wysoki pik T i C (heterogenność DNA).
Nr 1 Enzym pałeczek Enterobacteriaceae modyfikujący fluorochinolony 45 Według Ruiz i wsp. (13) gen warunkujący wytwarzanie wariantu acetylotransferazy jest bardziej rozpowszechniony wśród pałeczek Enterobacteriaceae niż inne plazmidowo kodowane determinanty warunkujące oporność na fluorochinolony tzn. qnr lub qepa. Także w prezentowanej pracy, na podstawie przedstwaionych wyników badań można postawić tezę, że gen aac(6 )-Ib-cr jest dość powszechny. Jego obecność wykryto u 11 spośród 15 izolatów objętych przedmiotem badań. Uzyskane wyniki genotypowania XbaI-PFGE badanych izolatów E. coli i K. pneumoniae wykazały, iż odsetek podobieństwa wynosił odpowiednio 59% i 56%, co wskazuje na obecność genu aac(6 )-Ib-cr wśród niespokrewnionych izolatów oraz jego horyzontalny transfer. W przypadku dwóch izolatów E. cloacae stwierdzono odsetek podobieństwa rzędu 93%, co świadczy o bliskim pokrewieństwie badanych izolatów. Z najnowszych badań przeprowadzonych przez Ruitz i wsp. (13) wynika, że istnieje możliwość wertykalnego przekazywania genu aac(6 )-Ib-cr, który może znajdować się także w bakteryjnym chromosomie. Dwa izolaty tj. 154 i 208 nie typowały się metodą PFGE. Przypuszcza się, że presja selekcyjna wywierana przez stosowanie aminoglikozydów w terapii zakażeń (głównie tobramycyny, kanamycyny i amikacyny) oraz hydrofobowych fluorochinolonów (tj. norfloksacyny i ciprofloksacyny), łatwo rozkładanych przez wariant cr acetylotransferazy aminoglikozydowej, sprzyja powszechnemu występowaniu genu aac(6 )-Ib-cr (8). Należy mieć też na uwadze fakt, iż wybór do leczenia fluorochinolonu, który nie jest substratem tego enzymu może zapewnić skuteczność terapii i jednocześnie ograniczać selekcję wariantu acetylotransferazy aminoglikozydowej, a w konsekwencji spowolnić narastanie liczby szczepów opornych na wysokie stężenia fluorochinolonów. PIŚMIENNICTWO 1. Cano ME, Rodríguez-Martínez JM, Agüero J i inni. Detection of plasmid-mediated quinolone resistance genes in clinical isolates of Enterobacter spp. in Spain. J Clin Microbiol 2009; 47: 2033-9. 2. Frasson I, Cavallaro A, Bergo C i inni. Prevalence of aac(6 )-Ib-cr plasmid-mediated and chromosome-encoded fluoroquinolone resistance in Enterobacteriaceae in Italy. Gut Pathogens 2011; 3: 12. 3. Gierczyński R, Szych J, Rastawicki W, Jagielski M. The molecular characterisation of the extender spectrum betalactamase (ESBL) producing strain of Salmonella enterica serovar Mbandaka isolated in Poland. Acta Microbiol Polonica 2003; 52: 183 90. 4. Guillard T, Duval V, Moret H i inni. Rapid detection of aac(6 )-Ib-cr quinolone resistance gene by pyrosequencing. J Clin Microbiol 2010; 48: 286-9. 5. Martinez-Martinez L, Pascual A, Jacoby GA. Quinolone resistance from a transferable plasmid. Lancet 1998; 351: 797-9. 6. Nordmann P i Poirel L. Emergence of plasmid-mediated resistance to quinolones in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother 2005; 56: 463-9. 7. O Neill AJ. New antibacterial agents for treating infections caused by multi-drug resistant Gram- -negative bacteria. Expert Opin Investing Drug 2008; 17: 297-302. 8. Park CH, Robisek A, Jacoby GA i inni. Prevalence in the United States of aac(6 )-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50: 3953-3955. 9. Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby GA i inni. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a New adaptation of common aminoglicoside acetyltransferase. Nat Med 2006; 12: 83-8.
46 K. Piekarska i inni Nr 1 10. Robisek A, Jacoby GA i Hooper DC. The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance. Lancet Infect Dis 2006; 6: 629-40. 11. Rodríguez-Martínez JM, Cano ME, Velasco C, Martíinez - Martíinez L, Pascual Á. Plasmid- -mediated quinolone resistance: an update. J Infect Chemother 2011; 17: 149 82. 12. Ruitz J, Pons MJ i Gomes C. Transferable mechanisms of quinolone resistance. Int J Antimicrob Agent 2012; 40: 196-203. 13. Ruiz E, Sáenz Y, Zarazaga M i inni. qnr, aac(6 )-Ib-cr and qepa in Escherichia coli and Klebsiella spp.: genetic enviroments and plasmid and chromosomal location. J Antimicrob Chemother 2012; 67: 886-97. 14. Strahilevitz J, Jacoby GA, Hooper DC, Robicsek A. Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin Microbiol Rev 2009; 22: 664-89. 15. Vetting MW, Park CH, Hedge SS i inni. Mechanistic and structural analysis of aminoglicoside N-acetylotransferase AAC(6 )-Ib and its bifunctional, fluoroquinolone-active AAC(6 )-Ib cr variant. Biochemistry 2008; 16: 9825-35. 16. Yang H, Chen H, Yang Q i inni. High prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance genes qnr and aac(6 )-Ib-cr in clinical isolates of Enterobacteriaceae from nine Teaching Hospitals in China. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 4268-73. Otrzymano: 14 III 2013 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: kpiekarska@pzh.gov.pl