CYTOGENETYKA seminarium III rok WLI mgr inż. Łukasz Kuszel CYTOGENETYKA: Klasyczna analiza kariotypu, techniki prążkowania chromosomów Molekularna stosowanie sond molekularnych, technika FISH BUDOWA CHROMOSOMU - struktura znajdująca się w jądrze, zbudowana z liniowej cząsteczki DNA i białek, wzdłuż której ułożone są geny, widoczna pod mikroskopem podczas podziałów komórkowych. TYPY MORFOLOGICZNE CHROMOSOMÓW klasyfikowane na podstawie współczynnika SDR (stosunek długości ramion): Metacentryczne Submetacentryczne Akrocentryczne ABERRACJE CHROMOSOMOWE: Aberracje: o chromosomów autosomalnych o chromosomów płci Aberracje o liczby chromosomów o struktury chromosomów
ABERRACJE LICZBY CHROMOSOMÓW Poliploidia o Triploidia (69,XXX,XXY lub XYY) 1-3% wszystkich poczęć, w większości przypadków poronienia samoistne Aneuploidia (autosomy) o Nullisomia (utrata pary chromosomów homologicznych) letalne przed implantacją o Monosomia (utrata jednego chromosomu) letalne w stadium embrionalnym o Trisomia (jeden chromosom dodatkowy) zwykle letalne, z wyjątkiem trisomii chromosomów 13, 18, 21 Aneuploidia (chromosomy płci) o Dodatkowy chromosom płci normalna długość życia o Utrata chromosomu płci 99% przypadków-poronienia samoistne, normalna inteligencja, bezpłodność TRIPLOIDIA Triploidia to obecność dodatkowego haploidalnego zestawu chromosomów w wyniku czego w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 69 chromosomów. Triploidia powstaje w wyniku: o Zapłodnienia komórki jajowej przez dwa plemniki, czyli tak zwanej dispermii o Połączenia się nieprawidłowej diploidalnej gamety żeńskiej z prawidłowym plemnikiem, czyli tak zwanej dygynii o Połączenia się nieprawidłowego diploidalnego plemnika z prawidłową gametą żeńską, czyli tak zwanej diandrii Skutki fenotypowe zależą od tego, czy dodatkowy materiał genetyczny pochodzi od ojca czy matki: o Typ I (ojcowski) - łożysko jest duże (często dochodzi do powstania częściowego zaśniadu groniastego), a masa dziecka jest odpowiednia do wieku płodowego. Noworodki z I typem triploidii umierają zwykle w pierwszej dobie życia. o Typ II (matczyny) - łożysko jest małe i obserwuje się wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrastania płodu. U noworodków z typem II triploidii obserwowano nawet kilkutygodniowe przeżycia. o Najdłużej żyły noworodki, u których stwierdzono kariotyp mozaikowy z dwoma liniami komórkowymi: diploidalnymi i triploidalnymi. ABERRACJE STRUKTURALNE Zmiany w strukturze (morfologii) chromosomów Dzielimy je na zrównoważone i niezrównoważone Zrównoważone, czyli takie, w wyniku których zmienia się struktura chromosomu, ale nie zmienia się ogólna ilość DNA
Niezrównoważone są zawsze związane z nieprawidłową strukturą chromosomu oraz nieprawidłową ilością DNA w jądrze komórkowym Podział na aberracje zrównoważone i niezrównoważone odzwierciedla ich odmienną manifestacją kliniczną są wynikiem pęknięć i/lub przeniesienia fragmentów chromosomów oraz połączenia ich w nowe konfiguracje mogą powstawać de novo, jako błędy podziału mejotycznego (nieprawidłowy proces crossing-over) częściej są wynikiem błędów spermatogenezy niż oogenezy mogą zostać odziedziczone od rodziców w takiej samej lub zmienionej formie TRANSLOKACJE Przemieszczenie się materiału genetycznego pomiędzy chromosomami Translokacja wzajemna zrównoważona Fragmenty chromosomów odrywają się i zamieniają miejscami. Nie dochodzi do utraty materiału genetycznego. Translokacja robertsonowska Dotyczy chromosomów akrocentrycznych Dwa chromosomy akrocentryczne tracą ramiona krótkie i łączą się ze sobą powstaje jeden chromosom dwuramienny Translokacja robertsonowska jest translokacją zrównoważoną, ponieważ utrata ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych nie powoduje utraty genów INWERSJE Chromosom ulega złamaniu w 2 miejscach, a fragment pomiędzy złamaniami ulega odwróceniu o 180 stopni. Inwersja jest aberracją zrównoważoną. Powodują wysokie ryzyko poronień. Im bliżej telomerów położone są punkty złamań chromosomu tym większe jest prawdopodobieństwo przeżycia płodu do narodzin. Inwersja paracentryczna oba złamania są w obrębie jednego ramienia i odwrócony fragment nie zawiera centromeru. Inwersja pericentryczna złamania nastąpiły w obydwu ramionach chromosomu i odwrócony fragment zawiera centromer. DELECJE I DUPLIKACJE Delecja utrata części chromosomu Duplikacja podwojenie części chromosomu Delecje i duplikacje są aberracjami niezrównoważonymi łączą się z utratą lub nadmiarem materiału genetycznego. Skutki delecji są poważniejsze niż duplikacji. Najczęściej występują de novo. Zawsze wiążą się z nieprawidłowym fenotypem pacjenta.
CHROMOSOMY PIERŚCIENIOWE Chromosom pęka w obu ramionach, dystalne części chromosomów ulegają utracie, a pozostała część chromosomu tworzy pierścień. Aberracja chromosomowa niezrównoważona. IZOCHROMOSOM Nieprawidłowy chromosom, który ma delecję jednego, a duplikację drugiego ramienia. Może powstać wskutek poprzecznego podziału centromeru. Aberracja niezrównoważona. ADDYCJA Przyłączenie do chromosomu fragmentu zawierającego materiał niejasnego pochodzenia. CHROMOSOMY MARKEROWE Małe dodatkowe chromosomy niejasnego pochodzenia, stwierdzane 1/2500 ciąż. W 90% przypadków pochodzą z krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych (około połowa pochodzi z chromosomu 15). Chromosomy markerowe wymagają identyfikacji metodami cytogenetyki molekularnej (FISH malowanie chromosomów). KARIOTYP Sklasyfikowany pod względem morfologicznym zestaw chromosomów danej komórki lub osoby. WSKAZANIA DO SKIEROWANIA NA BADANIE KARIOTYPU Zespół wad wrodzonych Cechy dysmorfii Opóźnienie rozwoju psychoruchowego lub umysłowego Cechy kliniczne charakterystyczne dla danego zespołu chromosomowego Zaburzenia dojrzewania płciowego Nieprawidłowa budowa narządów płciowych, obojnactwo Kliniczne zaburzenia wzrostu Występowanie aberracji chromosomowej w rodzinie Poronienia nawracające Postępowanie przed zapłodnieniem in vitro (IVF) Wiek matki powyżej 35 lat MATERIAŁ BIOLOGICZNY DO BADANIA KARIOTYPU Limfocyty krwi obwodowej Szpik kostny Fibroblasty skóry Płyn owodniowy Kosmówka Limfocyty krwi obwodowej najczęściej stosowana tkanka przy określaniu kariotypu Do określenia kariotypu potrzeba 2-5 ml krwi u osoby dorosłej, 1 ml krwi u noworodka. Krew pobierana jest do probówki z heparyną (nie z EDTA - trudności w hodowli).
Jeśli transport następuje dnia następnego, probówkę z krwią przechowujemy w lodówce w temp. +4 C. Probówki z krwią nie zamrażamy. Probówkę z krwią można przesyłać szybką pocztą. W przypadku pobierania krwi do badania cytogenetycznego (lub innej tkanki niż krew), pacjent nie musi być specjalnie przygotowywany (np. na czczo, o określonej porze dnia). Istotny jest natomiast sposób pobrania i przechowywania krwi lub innego materiału biologicznego. Jakość materiału biologicznego (sterylne pobranie, odpowiednie przechowywanie, czas dostarczenia do laboratorium) wpływa bezpośrednio na powodzenie hodowli. METODY CYTOGENETYCZNE Techniki klasyczne: Techniki prążkowe - Q (zastosowanie kwinakryny) - metoda prążkowa C (barwienie centromerów) - AgNOR (barwienie satelit) - metoda prążkowa R (prążkowania odwrotnego, ang. reverse) - GTG (trawienie trypsyną i barwienie odczynnikiem Giemsy) Techniki cytogenetyki molekularnej: FISH - (Fluorescent In Situ Hybridization) fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH rodzaje sond: malujące (wcp. ang. whole chromosome paint) pokrywające cały chromosom lub poszczególne ramiona alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe) specyficzne (unikalne) dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus FISH materiał do badań: fibroblasty limfocyty komórki szpiku kostnego komórki płynu owodniowego komórki trofoblastu komórki nabłonka jamy ustnej skrawki parafinowe niektórych tkanek ZASTOSOWANIE FISH: diagnostyka submikroskopowych i złożonych aberracji chromosomowych identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego identyfikacja chromosomów markerowych szybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych mapowanie genów i sekwencji DNA identyfikacja komórek szpiku kostnego dawcy po przeszczepie
FISH NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE FLOUROCHROMY: FITC (fluoresceina) TRITC (rhodamina) Texas Red Aqua DAPI PJ (jodek propidyny) Cy3 Cy5 SKY-FISH: Umożliwia wybarwienie 24 chromosomów w jednej reakcji Diagnostyka złożonych aberracji strukturalnych zwłaszcza jeżeli w translokacji bierze udział kilka chromosomów Diagnostyka translokacji ukrytych Identyfikacja chromosomów markerowych ARRAY-CGH Wysoka rozdzielczość badania Możliwość wykrywania małych delecji Brak możliwości wykrywania aberracji zrównoważonych Wysoki koszt badania Utrudniona diagnostyka mozaikowości