Inkubacja 20 min rozpuszczania Bufor do

FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight Clone 34βE12 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS051 Przeznaczenie Podsumowanie i wyjaśnienie Dostarczony odczynnik Do badań diagnostycznych in vitro. FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight (HMW), Clone 34βE12 (1), Ready-to- Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), są przeznaczone do uŝytku w immunohistochemii razem z narzędziami Autostainer/Autostainer Plus firmy Dako. Przeciwciało jest przydatne w identyfikacji komórek podstawnych i nabłonka płaskiego w róŝnych tkankach. Dodatni wynik pomaga w rozróŝnieniu łagodnego przerostu gruczołu krokowego od gruczolakoraka prostaty oraz w wykryciu róŝnic w nabłonku w rakach o małym zróŝnicowaniu. Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Cytokeratyny to białka występujące w filamentach pośrednich cytoszkieletu, odgrywające kluczową rolę w rozwoju i róŝnicowaniu komórek nabłonka. Zidentyfikowano około dwudziestu róŝnych cytokeratyn, które klasyfikuje się na kategorie numeryczne na podstawie masy cząsteczkowej i punktów izoelektrycznych (2). Ogólnie rzecz biorąc, cytokeratyny o niskiej masie cząsteczkowej (40 54 kda) występują w nabłonku innym niŝ wielowarstwowy płaski 7-8 i (lub) 17-20 w klasyfikacji Molla (3). Cytokeratyny o wysokiej masie cząsteczkowej (48 67 kda) występują w nabłonku wielowarstwowym płaskim kategorie 1-6 i (lub) 9-16 (3). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub instrukcje obsługi systemów detekcji IHC. Gotowe do uŝycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu w stęŝeniu 0,015 mol/l. Klon: 34βE12(1) Izotyp: IgG 1, kappa. Immunogen Rozpuszczalny immunogen keratynowy wyekstrahowany z ludzkich komorek warstwy rogowej (1). Swoistość Środki ostroŝności Wykazano, Ŝe przeciwciała anty-ck HMW klon 34βE12 reagują z białkami o masie cząsteczkowej 66, 57, 51 i 49 kda odpowiadającymi cytokeratynom 1, 5, 10 i 14 w klasyfikacji Molla (1, 2, 4). 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN 3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Jak w przypadku kaŝdego materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury obchodzenia się z nim. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą, naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 5. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie uŝywać po upływie daty waŝności podanej na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma jednoznacznych oznak niestabilności produktu. Dlatego, równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŝy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. JeŜeli zaobserwuje się nieoczekiwane barwienie, którego nie moŝna wyjaśnić odchyleniami w procedurach laboratoryjnych i podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Skrócony przepis Krok Komentarze Utrwalanie Formalina Obróbka wstępna EnVision FLEX +, High ph (nr kat. K8004) 20 min HIER, 3-w-1 przy uŝyciu PT Link i PT Link Rinse Station Zakres Gotowy do uŝycia Inkubacja 20 min rozpuszczania Bufor do Rozcieńczony fabrycznie rozcieńczania Kontrola ujemna FLEX Negative Control, Mouse (nr kat. IS750) Inkubacja 20 min (115650-002) 307118PL_002_IS051/2012.07 1/5

Wizualizacja EnVision FLEX, High ph (nr kat. K8010). 20 min inkubacji, 2x5 min DAB + inkubacja Barwienie EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8018) Inkubacja 5 min kontrastowe Tkanka kontrolna Migdałki Odczyn Szkiełka podstawowe/ montowanie FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020) Zalecane dla uzyskania lepszego przylegania materiału. Wymagane trwałe nakrywanie preparatów Oprzyrządowanie Dako Autostainer/Autostainer Plus NaleŜy stosować fiolki dostosowane do aparatu (S3425) *UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem. Przygotowanie próbek Wykonanie odczynu Skrawki zatapiane w parafinie: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm. Obróbka wstępna: Wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje po przeprowadzeniu na tkankach HIER przy uŝyciu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (nr kat. K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie antygenu (HIER) moŝna przeprowadzić z uŝyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera Instrukcja uŝytkownika aparatu PT Link. Dla aparatów PT Link naleŝy stosować następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65 C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97 C prz ez 20 (±1) minut, następnie ochłodzić do 65 C. Usunąć statywy na szkiełka ze zbiornika aparatu PT i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) wypełnionym rozcieńczonym buforem EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1 5 minut. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone i zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High ph (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Program: Wybrać protokół podany poniŝej. Przed uŝyciem odczynniki muszą być odpowiednio rozcieńczone. Wszystkie etapy powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (nr kat. DM821) przez 5 (±1) minut. 2. Płukać w EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 3. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl odczynnika Primary Antibody (nr kat. IS051) przez 20 (±1) minut. 4. Płukać w EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 5. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX/HRP (nr kat. DM822) przez 20 (±1) minut. 6. Płukać w EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 7. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 5 (±1) minut (czynność dodatkowa). 8. Płukać w EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 9. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX Substrate Working Solution (nr kat. DM823 and DM827) przez 5 (±1) minut. 10. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX Substrate Working Solution (nr kat. DM823 and DM827) przez 5 (±1) minut. 11. Płukać w EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 1 5 minut. 12. Poddawać preparat barwieniu kontrastowemu preparatem EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8018) przez 5 (±1) minut. 13. Płukać preparaty wodą dejonizowaną przez 1 5 minut. 14. Inkubować skrawki tkanek z 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007) przez 5 (±1) minut. 15. Płukać preparaty wodą dejonizowaną przez 1 5 minut. 16. Zatapianie preparatów naleŝy przeprowadzić za pomocą właściwego środka do trwałego zatapiania. Tabela programowania przy zalecanych oznaczeń: (115650-002) 307118PL_002_IS051/2012.07 2/5

Dla etapu auxiliary naleŝy ustawić opcję rinse buffer w programach barwienia 10 preparatów. W przypadku programów barwienia >10 preparatów etap Auxiliary naleŝy ustawić na none. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŝywanym urządzeniu Autostainer, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Barwienie kontrastowe: Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŝyciu EnVision FLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŝy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŝyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować komórki nabłonka płaskiego, natomiast we wszystkich preparatach dodatnich komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części Charakterystyka wydajnościowa. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750). Interpretacja wybarwienia Charakterystyka działania Przeciwciała dają odczyn. Tkanki prawidłowe (5): Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Składniki tkankowe dające dodatni odczyn Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Składniki tkankowe dające dodatni odczyn Nadnercza (3) 0/3 Jajniki (3) 3/3 Nabłonek powierzchniowy (80 100%), Szpik kostny (3) 0/3 Trzustka (3) 3/3 Nabłonek przewodu trzustkowego (50 80%), Gruczoły sutkowe (2) 2/2 Nablonek gruczolowy i Przytarczyce (3) 0/3 przewodowy (80%), MóŜdŜek (3) 0/3 Przysadka 0/3 mózgowa (3) Mózgowie (3) 0/3 Gruczoł krokowy (3) (3/3) Komorki podstawne i nablonek przewodowy (90%), jadrowy Szyjka macicy (2) 2/2 Nabłonek płaski powierzchniowy (100%), Jelito grube (3) 3/3 Nabłonek powierzchniowy (10%), Przełyk (3) 3/3 Nabłonek płaski (100%), Ślinianki (3) 3/3 Wydzielniczy nabłonek przewodowy (100%), Skóra (3) 3/3 Nabłonek płaski (100%), 3/3 Nabłonek przewodowy i gruczołowy gruczołów potowych (80 100%), Serce (3/3) 0/3 1/3 Nabłonek gruczołów łojowych (100%), (115650-002) 307118PL_002_IS051/2012.07 3/5

Nerki (3) 3/3 Nabłonek kanalików nerkowych (10 30%), Wątroba (3) 3/3 Nabłonek przewodów Ŝółciowych (50%), Płuca (3) 3/3 Nabłonek oskrzeli (10%), Jelito cienkie (3) 3/3 Nabłonek (20 50%), Śledziona (3) 0/3 śołądek (3) 3/3 Nabłonek gruczołowy krypty Ŝołądkowej (10 30%), Jądra (3) 0/3 3/3 Nabłonek pęcherzyka płucnego (50%), Komórki 2/2 Nabłonek mezodermalny (100%), Grasica (3) 3/3 Nabłonek płaski (100%), międzybłonka (2) Mięsień sercowy (3) 0/3 Tarczyca (3) 1/3 Komórki gwiaździste (5%), cytoplazmatyczne Mięśnie szkieletowe 0/3 Migdałki (3) 3/3 Nabłonek płaski (100%), (3) Nerwy obwodowe (3) 0/3 Macica (2) 2/2 Nabłonek endometrialny (5 80%), Tkanki patologiczne: Dodatnią immunoreaktywność z przeciwciałem anti-ck HMW, 34βE12 odnotowano w raku płaskonabłonkowym, nabłonka przewodowego i przejściowego w tym: raku płaskonabłonkowym skóry, płuc i nosogardzieli, raku nabłonka przewodowego piersi, trzustki, przewodów Ŝółciowych i ślinianek; raku nabłonka przejściowego pęcherza i nosogardzieli oraz grasiczakach (6-11). Wykazano równieŝ, Ŝe Anti-CK HMW, 34βE12 dodatnio identyfikuje międzybłoniaki nabłonkowe, ale nie reaguje z międzybłoniakami mięsakowymi i desmoplastycznymi (12). Zmienną dodatniość odnotowano z anti-ck HMW 34βE12 w gruczolakorakach jajników, układu pokarmowego i tarczycy. Nowotwory odnotowane jako znacznie niereaktywne z klonem 34βE12 to m.in. gruczolaki gruczołów hormonalnych, rak wątroby (rak wątrobowokomórkowy), rak endometrium, nerek i rak neuroendokrynny (6, 7, 11). W prostacie klon 34βE12 dodatnio oznakowuje komórki podstawne zmian łagodnych takich jak atrofia, atypowa hiperplazja gruczolakowata i hiperplazaj postwardnieniowa. Brak barwienia warstwy podstawnej z anti-ck HMW, 34βE12 sugeruje raka prostaty, ale nie jest podstawą do zdiagnozowania choroby rozrostowej i wymaga więcej danych morfologicznych (3, 7, 13-15). Zanotowano, Ŝe Anti-CK HMW klon 34βE12 oznakowuje komórki rakowe w niektórych gruczolakorakach o budowie groniastej (3.15). Fałszywe barwienie immunologiczne zanotowano równieŝ z klonem 34βE12 (7,16). Referencje 1. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to intermediate filament proteins of human cells: Unique and cross-reacting antibodies. J Cell Biol 1982; 95:414-24. 2. Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31:11-24. 3. Miettinen M. Keratin immunohistochemistry: update of applications and pitfalls. Pathol Ann 1993; 28:113-43. 4. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins II. Distribution of filaments in normal human tissues. Amer J Pathol 1984; 114:309-21. 5. IR051(IHC003-D09346). 6. Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins. III. Analysis of tumors. Am J Clin Pathol.1985 Oct;84(4):413-24. 7. Diagnostic immunohistochemistry: theranostic and genomic applications. Dabbs, David J. 3rd ed. Philadelphia, PA : Saunders /Elsevier, 2010. 8. Hurlimann J, Gardiol D. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of liver carcinomas. Amer J Surg Pathol 1991; 15:280-8. 9. Dairkee SH, Puett L, Hackett AJ. Expression of basal and luminal epithelium-specific keratins in normal, benign and malignant breast tissue. J Nat Can Inst 1988; 80:691-5. 10. Thike AA, Cheok PY, Jara-Lazaro AR, Tan B, Tan P, Tan PH. Triple-negative breast cancer: clinicopathological characteristics and relationship with basal-like breast cancer. Mod Pathol 2010;23(1):123-33. 11. Gown AM, Vogel AM. Anti-intermediate fillament monoclonal antibodies; tissue-specific tools in tumor diagnosis. Surv Synth Pathol Res. 1984;3:369-385. 12. Bolen JW, Hammar SP, McNutt MA. Reactive and neoplastic serosal tissue: a light-microscopic, ultrastructural, and immunocytochemical study. Amer J Surg Pathol 1986; 10:34-47. 13. Varma M, Amin MB, Linden MD, Zarbo RJ. Discriminant staining pattern of small glandular and preneoplastic lesions of the prostate using high molecular weight cytokeratin antibody A study of 301 consecutive needle biopsies. Mod Pathol 1997; 10:93A 14. O Malley FP, Grignon DJ, Shum DT. Usefulness of immunoperoxidase staining with high-molecular-weight cytokeratin in the differential diagnosis of small-acinar lesions of the prostate gland. Virch Arch Pathol Anat 1990; 417:191-6. 15. Brimo F, Epstein JI. Immunohistochemical pitfalls in prostate pathology. Hum Pathol 2012;43:313-24. 16. Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem 1995; 3:45-53. (115650-002) 307118PL_002_IS051/2012.07 4/5

Wydanie 07/12 (115650-002) 307118PL_002_IS051/2012.07 5/5