Catalyzed Signal Amplification (CSA) System Do uŝycia z pierwszymi mysimi przeciwciałami Nr katalogowy K1500 15 ml Licencja ograniczonego uŝytkowania Niniejszy produkt moŝe być rozpowszechniany i sprzedawany uŝytkownikowi końcowemu zgodnie z licencją uzyskaną od firmy NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. dla uŝytku przez uŝytkownika końcowego w ręcznym lub automatycznym przetwarzaniu wyłącznie na oprzyrządowaniu firmy Dako do szkiełek mikroskopowych lub innego materiału podporowego (innego niŝ mikromatryce oraz bio-chipy) zawierające próbki komórkowe lub tkankowe w celu zbadania tychŝe próbek pod mikroskopem (w tym zautomatyzowane systemy chwytania obrazu oraz analizy) do celów wykrywania docelowych kwasów nukleinowych lub białek. Zakup nie obejmuje ani nie niesie ze sobą jakichkolwiek praw do odsprzedaŝy lub przeniesienia niniejszego produktu ani jako oddzielnego produktu, ani jako elementu innego produktu. Jakiekolwiek uŝytkowanie niniejszego produktu róŝniące się od uŝytkowania licencjonowanego bez wyraŝonej pisemnej autoryzacji przez firmę NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. jest ściśle zabronione. System CSA (ang. Catalyzed Signal Amplification amplifikacja katalizowanego sygnału) zawiera technologie opracowane przez firmę NEN Life Science Products, Inc. i pozostające na jej licencji (patent amerykański numer 5 196 306). Produkt ten jest równieŝ chroniony prawami autorskimi zawartymi w amerykańskim patencie nr 4 684 609. Informacje nt (1) sposobu postępowania (2) materiałów niezbędnych, lecz nie dostarczonych (3) przechowywania, (4) przygotowania próbek, (5) procedury barwienia, (6) kontroli jakości, (7) rozwiązywania problemów, (8) interpretacji wyniku barwienia i (9) ogólnych ograniczeń podano w rozdziale General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje dotyczące barwienia immunohistochemicznego) lub w instrukcjach systemu wykrywania procedur IHC. Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Niniejsze instrukcje odnoszą się do systemu Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, Peroxidase (system CSA, HRP). Zestaw ten jest przeznaczony do uŝycia z pierwszymi przeciwciałami mysimi do identyfikacji antygenów przy uŝyciu mikroskopii świetlnej, w tkankach zdrowych i patologicznych utrwalonych w formalinie, zanurzonych w parafinie. System ten moŝe być równieŝ uŝywany z pierwszymi przeciwciałami króliczymi przy uŝyciu CSA Rabbit Link (nr katalogowy K1498). Podsumowanie i wyjaśnienie Sposób postępowania System CSA, HRP jest niezwykle czułą procedurą barwienia immunohistochemicznego (IHC) łączącą metodę amplifikacji sygnału opartą na katalizowanym przez peroksydazę składowaniu biotynylowanych związków fenolowych, 1 po której następuje drugorzędowa reakcja z peroksydazą streptawidyny. W wyniku tej procedury, pierwsze mysie przeciwciało jest najpierw wykrywane przy uŝyciu biotynylowanego drugiego przeciwciała. Następnie kompleks streptawidyna-biotyna-peroksydaza wiąŝe się z biotynylowanym drugim przeciwciałem poprzez jego streptawidynę. PoniŜszy etap wykorzystuje związaną peroksydazę do katalizy precypitacji w próbce biotynylowanego fenolu, co z kolei powoduje amplifikację liczby cząsteczek biotyny dostępnych do związania dla następnego odczynnika, peroksydazy streptawidynowej. Barwienie jest kończone przy uŝyciu diaminobenzydyny / nadtlenku wodoru jako chromogenu / substratu. Przeprowadzone porównania ze standardową znakowaną biotyną streptawidynową (LSAB) wykazały, Ŝe system CSA System, HRP daje 50-cio krotnie większą czułość. Wykorzystywana procedura powoduje uzyskanie wysokiej amplifikacji sygnału co pozwala na detekcję niezmiernie małych ilości docelowego antygenu. Techniki uŝyte w niniejszym systemie zostały oparte na metodologiach awidyna-biotyna oraz peroksydaza. Próbki są najpierw inkubowane przez pięć minut z produktem blokującym peroksydazę Peroxidase Block w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazowej. Następnie próbki inkubuje się przez pięć minut z produktem blokującym białka, w celu supresji nieswoistego wiązania kolejnych odczynników, po czym przeprowadza się inkubację z odpowiednio scharakteryzowanym i rozcieńczonym pierwszym mysim przeciwciałem oraz odczynnikiem kontroli ujemnej. Następnie wykonywane są kolejno 15-minutowe inkubacje z biotynylowanym przeciwciałem łączącym, kompleksem streptawidyna-biotyna-peroksydaza, odczynnikiem amplifikującym oraz ze streptowidyną-peroksydazą. Barwienie jest kończone przez 5-minutową inkubację z czterochlorkiem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), które daje rezultat pod postacią brązowego precypitatu w miejscu występowania antygenu. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 1/11
Odczynniki dostarczane Niniejszy system zawiera następujące odczynniki wystarczające do uŝycia z maks. 150 skrawkami: Ilość Opis 1x15 ml Peroxidase Block 3% roztwór nadtlenku wodoru w wodzie. 1x15 ml Protein Block (Blok białka) Bez-surowicze białko w roztworze soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem Phosphate Buffered Saline (PBS) z 0,015 mol/l azydkiem sodu. 1x15 ml Link Antibody (Przeciwciało łączące) Biotynylowane królicze przeciw-mysie immunoglobuliny w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące oraz 0,015 mol/l azykdu sodu. 1x1 ml Streptavidin-Biotin Complex, Reagent A (Kompleks streptawidyna-biotyna, Odczynnik A) Streptawidyna w buforze PBS zawierającym środek przeciwbakteryjny. 1x1 ml Streptavidin-Biotin Complex, Reagent B (Kompleks streptawidyna-biotyna, Odczynnik B) Biotyna sprzęŝona z peroksydazą chrzanową w buforze PBS zawierającym środek przeciwbakteryjny. 1x25 ml Streptavidin-Biotin Complex, Diluent (Kompleks streptawidyna-biotyna, Rozcieńczalnik) Bufor PBS zawierający środek przeciwbakteryjny i białko stabilizujące. 1x15 ml Amplification Reagent (Odczynnik amplifikacyjny) Tyramid biotynylowy oraz nadtlenek wodoru w buforze PBS zawierającym środek przeciwbakteryjny i białko stabilizujące. 1x15 ml Streptavidin-Peroxidase (Streptawidyna-peroksydaza) Streptawidyna sprzęŝona z peroksydazą chrzanową w buforze PBS zawierającym środek przeciwbakteryjny i białko stabilizujące. 10 Substrate Tablets, DAB Chromogen (Tabletki substratu, chromogen DAB) KaŜda tabletka zawiera 10 mg tetrachlorku 3,3 -diaminobenzydyny (DAB) zapakowanego z środkiem wysuszającym. 1x6 ml Substrate, Tris Buffer Concentrate (Substrat, koncentrat buforu Tris) Koncentrat buforu Tris-HCl. 1x2 ml Substrate, Hydrogen Peroxide (Substrat, nadtlenek wodoru) 0,8% roztwór nadtlenku wodoru w wodzie. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 2/11
Akcesoria 1 5 ml wykalibrowana probówka testowa z nasadką do uŝycia podczas przygotowywania kompleksu streptawidyna-biotyna 1 pojemnik z substratami 1 10 ml wykalibrowana probówka testowa z nasadką do uŝycia podczas przygotowywania odczynnika substrat-chromogen 1 szczypczyki Materiały wymagane, lecz nie dostarczane W celu uzyskiwania optymanych wyników przy korzystaniu z systemu CSA System, HRP (nr katalogowy K1500) zaleca się uŝywanie systemu CSA Ancillary System (nr katalogowy K1499). System ten zawiera roztwór odzyskiwania docelowego, roztwór soli fizjologicznej zbuforowany Tris z Tween 20, system blokowania biotyny oraz rozcieńczalnik przeciwciała z elementami redukującymi tło. W przypadku barwienia króliczymi pierwszymi przeciwciałami zaleca się korzystanie z produktu CSA Rabbit Link (nr katalogowy K1498) zamiast dostarczanego Link Antibody. Biotin Blocking System (system blokowania biotyny, nr katalogowy X0590 lub w K1499) Tkanka kontrolna, pozytywna i negatywna Barwienie negatywne; jak np. Mayer s Hematoxylin lub Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (nr katalogowy S3309) Środki mocowania jak Glycergel Mounting Medium (nr katalogowy C0563) lub Faramount Aqueus Mounting Medium, Gotowy do uŝytku (nr katalogowy S3025) Pierwsze przeciwciała i odczynniki kontroli ujemnej Rozcieńczalnik pierwszych przeciwciał, taki jak np. Antibody Diluent with Background Reducing Components (Rozcieńczalnik przeciwciał z elementami redukującymi tło, nr katalogowy S3022 lub w K1499) Szkiełka pokryte poli-l-lizyną lub Silanized Slides (Nr katalogowy S3003) Roztwór buforu przemywającego, jak np. TBST (sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween 20), x 10 koncentrat (nr katalogowy S3306 lub w K1499) Wymagane materiały opcjonalne lecz nie dostarczane Wodorotlenek amonu, 0,037 mol/l Roztwór odzyskiwania docelowego jak np. Target Retrieval Solution (kod S1699, S1700 lub w K1499) Łaźnia wodna (umoŝliwiająca utrzymywanie temperatury 95 99 C), parnik lub au toklaw do przeprowadzania odzyskiwania docelowego Środki ostroŝności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN 3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc nagromadzenie silnie wybuchowych tlenków metali. Po usunięciu spłukiwać duŝą ilością wody Ŝeby zapobiec nagromadzenie azydków w kanalizacji. 2,3 3. Nie wolno uŝywać odczynników po upływie daty waŝności dla danego sposobu przechowywania. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ wskazane w ulotce produktu, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. 4. Nie wolno zamieniać odczynników z innych numerów partii lub z zestawów pochodzących od innych producentów. 5. Wystawienie enzymów oraz substratów-chromogenów na działanie silnego światła moŝe mieć na nie niekorzystny wpływ. Nie przechowywać elementów, ani nie prowadzić barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 6. Zastosowanie czasów inkubacji i temperatur innych niŝ podano w instrukcji moŝe spowodować błędne wyniki. Tego typu zmiany muszą zostać sprawdzone przez uŝytkownika. 7. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 8. Niewykorzystany roztwórutylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. 9. Na Ŝądanie dostępne są karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału. 10. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŝy stosować prawidłowe procedury postępowania. Uwaga Streptavidin Biotin Complex Diluent: 10-30% Glycerol H320 Wywołuje podraŝnienie oczu. P280 Stosować ochronę oczu lub twarzy. P264 Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. P305 + P351 + W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. P338 Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. P337 + P313 Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. Uwaga Amplification Reagent: 10-30% Glycerol H320 Wywołuje podraŝnienie oczu. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 3/11
P264 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. Niebezpieczeństwo DAB Chromogen Tablets: 10-30% kwas borowy, 5-10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 MoŜe powodować raka. H360 MoŜe działać szkodliwie na płodność lub na dziecko w łonie matki. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. H335 MoŜe powodować podraŝnienie dróg oddechowych. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P281 Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej. P271 Stosować wyłącznie na zewnątrz lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. P261 Unikać wdychania par. P308 + P313 P304 + P340 + P312 P405 P501 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeŝe powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umoŝliwiającej swobodne oddychanie. W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Przechowywać pod zamknięciem. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Uwaga Substrate Buffer Concentrate: 10-30% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Działa draŝniąco na oczy. H315 Działa draŝniąco na skórę. P280 Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. P264 Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. P302 + P352 + P362-2 + P363 W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŝą ilością wody z mydłem. Zdjąć zanieczyszczoną odzieŝ. Wyprać zanieczyszczoną odzieŝ przed ponownym uŝyciem. P332 + P313 W przypadku wystąpienia podraŝnienia skóry: Zgłosić się do lekarza po poradę. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. P337 + P313 Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę.. Przechowywanie Odczynniki systemu CSA System, HRP naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamraŝać. Nie uŝywać po dacie waŝności wydrukowanej na fiolkach odczynnika i etykiecie produktu. Zmiana w wyglądzie odczynnika, jak np. precypitacja moŝe wskazywać na niestabilność lub rozkład. W takim przypadku nie wolno korzystać z reagentu (reagentów). Brak czywistych oznak wskazujących na niestabilność produktów. Dlatego teŝ naleŝy jednocześnie testować kontrole dodatnie i ujemne podczas badania próbek pacjenta. W razie wystąpienia nieoczekiwanego barwienia, którego nie moŝna wytłumaczyć róŝnicami w procedurach laboratoryjnych i podejrzeniu, Ŝe przyczyną mogą być komponenty zestawu prosimy o kontakt z Działem Wsparcia Technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek Przed wybarwieniem immunohistochemicznym, skrawki tkankowe muszą zostać utrwalone oraz przetworzone. Utrwalanie zapobiega autolizie oraz gniciu, zachowuje antygenowość, wzmacnia wskaźnik załamania światła elementów składowych tkanek oraz zwiększa odporność elementów komórkowych na przetwarzanie tkanki. Przetwarzanie tkanek obejmuje odwodnienie, oczyszczenie z środków odwadniających, nasączenie środkiem zatapiającym, zatopienie oraz ich cięcie na skrawki tkankowe. Najpowszechniej stosowane utrwalacze immunohistochemicznej preparatyki tkankowej zostały omówione w rozdziale General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne informacje dotyczące barwienia immunohistochemicznego). Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalny sposób postępowania musi zostać określony i zweryfikowany przez uŝytkownika. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 4/11
Przygotowanie odczynników Wskazane jest przygotowanie następujących odczynników przed wykonaniem barwienia. Roztwór buforu przemywającego Badania wykazały, Ŝe 0,05 mol/l buforu Tris-HCl o ph 7.6, zawierającego 0,3 mol/l NaCl i 0,1% Tween 20 (nr katalogowy S3306 lub w K1499), w znaczący sposób pomaga w minimalizowaniu barwienia tła. Zdecydowanie zaleca się uŝywanie tego roztworu. Skrawki tkankowe naleŝy płukać w roztworze TBST i inkubować w temperaturze pokojowej przez minimum trzy minuty w co najmniej jednej świeŝej łaźni TBST pomiędzy kaŝdym etapem odczynnikowym w protokole systemu CSA System, HRP. W celu dalszej supresji barwienia tła skrawki tkankowe naleŝy inkubować przez pięć minut w trzech świeŝych łaźniach TBST pomiędzy kaŝdym etapem odczynnikowym. Bufor przemywający nie moŝe zawierać azydku sodu poniewaŝ ten inaktywuje peroksydazę chrzanową i powoduje tworzenie barwienia negatywnego. NieuŜyty bufor przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie uŝywać zamglonych buforów. Do przemywania bloku peroksydazy, substratu-chromogenu oraz barwienia negatywnego naleŝy uŝywać wody destylowanej. Pierwsze Przeciwciało / odczynnik kontroli ujemnej W razie potrzeby pierwsze przeciwciało oraz odczynnik kontroli ujemnej mogą być dalej rozcieńczone przy pomocy produktu Antibody Diluent with Background Reducing Components (nr katalogowy S3022 lub w K1499) Streptavidin-Biotin Complex Przygotować kompleks streptawidyna-biotyna przynajmniej 30 minut przed uŝyciem. Przygotowany kompleks streptawidyna-biotyna pozostaje stabilny przez okres do dwóch tygodni przy przechowywaniu w temperaturze 2 8 C. KaŜdy 1 ml przygotowanego kompleksu streptawidyna-biotyna wystarcza na 10 skrawków. ETAP 1 ETAP 2 W zaleŝności od liczby szkiełek do barwienia, przenieść wystarczającą ilość objętości 1 ml buforu z butelki 7 (Streptavidin-Biotin Complex Diluent) do dostarczonej 5 ml wykalibrowanej probówki testowej. Do kaŝdego 1 ml buforu dodać jedną kroplę (40 µl) z butelki 5 (Streptavidin-Biotin Complex, Reagent A) oraz jedną kroplę (40 µl) z butelki 6 (Streptavidin-Biotin Complex, Reagent B) i zmieszać. Przygotować przynajmniej 30 minut przed uŝyciem. Dostarczana 5 ml wykalibrowana probówka testowa moŝe być uŝywana wielokrotnie. Probówkę testową dokładnie wypłukać po kaŝdym uŝyciu wodą destylowaną. Roztwór substrat-chromogen Roztwór substrat-chromogen zawierający nadtlenek wodoru moŝna przechowywać przez około osiem godzin po sporządzeniu. Roztwór nie wykorzystany po tym czasie naleŝy usunąć. Pozostały roztwór DAB nie zawierający nadtlenku wodoru naleŝy przechowywać w ciemnym miejscu do pięciu dni w temperaturze 2 8 C, lub d łuŝej w temperaturze 20 C. W celu przygotowania rozt woru substratchromogen naleŝy doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać nadtlenku wodoru zgodnie z potrzebami. ETAP 1 ETAP 2 ETAP 3 ETAP 4 Przed otwarciem poczekać aŝ butelka 10 (tabletki substratu) osiągnie temperaturę pokojową. Umieścić 10 kropli z butelki 11 (koncentrat buforu Tris) w wykalibrowanej probówce testowej o pojemności 10 ml. Uzupełnić wodą destylowaną do kreski i wymieszać. UŜyć szczypczyków do przeniesienia jednej tabletki substratu do 10 ml rozcieńczonego buforu Tris. Dokładnie zamknąć pojemnik z tabletkami. Zakryć probówkę testową i potrząsać lub wirować w celu rozpuszczenia tabletki. 2 ml roztworu substrat-chromogen wystarczają na okres do 20 sekund. Korzystając z jednorazowej pipety przenieść odpowiednią ilość roztworu DAB (po 2 ml) do pojemnika Substrate Container, dodać jedną kroplę (40 µl) z butelki 12 (Substrate Hydrogen Peroxide, substrat nadtlenek wodoru) na kaŝde 2 ml roztworu DAB, przyłączyć końcówkę zakraplającą i zmieszać. Uwaga: W celu zapobieŝenia kontaminacji nie dotykać końcówki zakraplającej palcami. Zaleca się zakładanie i zdejmowanie końcówki zakraplającej w nałoŝonych rękawiczkach. Dostarczona z systemem 10 ml skalibrowana probówka testowa oraz pojemnik substratu mogą być uŝywane wielokrotnie. Probówkę testową oraz pojemnik substratu dokładnie wypłukać wodą destylowaną po kaŝdym uŝyciu. Barwienie negatywne Barwny końcowy produkt reakcji barwnych jest nierozpuszczalny w alkoholu i moŝna go uŝywać w barwieniu negatywnym na bazie alkoholu lub wody, takim jak hematoksyliną Mayera. Po barwieniu negatywnym hematoksyliną wykonać dokładne płukanie w wodzie destylowanej, następnie zanurzyć szkiełka z tkankami w łaźnii z wodą amoniakalną lub z podobnym czynnikiem barwiącym na niebiesko o stęŝeniu 0,037 mol/l. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 5/11
Środki mocowania Zaleca się korzystanie z następujących środków mocowania: Glycergel (nr katalogowy C0563) lub Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nr katalogowy S3025). Szkiełka moŝna trwale zamocować uŝywając niewodnego trwałego środka mocowania. Przygotowanie skrawków zatopionych w parafinie Ogólne uwagi Przed wybarwieniem immunohistochemicznym, skrawki tkankowe muszą zostać utrwalone oraz przetworzone. Przetwarzanie tkanek obejmuje odwodnienie, oczyszczenie z środków odwadniających, nasączenie środkiem zatapiającym, zatopienie oraz ich cięcie na skrawki tkankowe. Optymalny sposób postępowania musi zostać określony Ii zweryfikowany przez uŝytkownika. (Konkretne informacje dotyczące utrwalania i przetwarzania tkanek zostały zawarte w pozycjach piśmienninctwapiśmiennictwa pod numerem 5 i 6.) Przetrwanie antygenów tkankowych do barwienia immunologicznego zaleŝy od rodzaju i stęŝenia utrwalacza, od czasu utrwalania oraz od rozmiaru utrwalanej próbki tkankowej.7 Niezmiernie waŝne jest utrzymanie optymalnych znormalizowanych warunków utrwalania, kiedy tylko jest to moŝliwe w celu uzyskania powtarzalnego barwienia. O ile jest to moŝliwe, zaleca się korzystanie z cieńszych próbek oraz krótkich czasów utrwalania. PrzedłuŜona ekspozycja na utrwalacze moŝe powodować maskowanie antygenów oraz przyczyniać się do obniŝonego barwienia. Po utrwaleniu tkanki zostają odwodnione przy uŝyciu szeregu alkoholowego, oczyszczone ksylenem lub substytutem ksylenu oraz nasączone woskiem parafinowym. Następnie tkanka zostaje zanurzona w wosku parafinowym w bloczku, który ułatwia cięcie tkanki. W celu zminimalizowania denaturacji antygenów, nie wystawiać tkanek na temperaturę powyŝej 60 C w trakcie obróbki. Bloczki tkankowe po ukończeniu zanurzania mogą zostać pocięte na skrawki lub mogą być przechowywane w całości. Prawidłowo utrwalone i zanurzone w parafinie tkanki mogą być przechowywane przez nieokreślony okres czasu w chłodnym miejscu. Mocowanie skrawków tkankowych Skrawki tkankowe odcięte z bloczków zanurzonych w parafinie nanieść na czyste szkiełka podstawowe. Odwodnić w piecu przez okres jednej do dwóch godzin w temperaturze 60 C lub krócej i suszyć na powietrzu przez okres od 15 do 24 godzin. W celu zwiększenia adhezji skrawków tkankowych w trakcie immunohistochemicznych procedur barwienia, sugeruje się uŝycie szkiełek opłaszczonych poli-l-lizyną, szkiełek naładowanych lub produktu Silanized Slides (nr katalogowy S3003). Zdecydowanie zaleca się uŝywanie szkiełek naładowanych lub silanizowanych ( Silanized Slides) do procedur wymagających odzyskiwania docelowego. Szkiełka ze skrawkami tkankowymi zanurzonymi w parafinie mogą być przechowywane przez nieokreślony okres czasu w chłodnym miejscu. Procedura barwienia Uwagi dotyczące postępowania Zaleca się korzystanie z poniŝszego protokołu barwienia przy uŝywaniu systemu CSA System, HRP. Protokół ten wymaga 15 minutowych inkubacji w etapach od 3 do 7 oraz pozwala na uzyskanie wysokiej czułości. W przypadkach, kiedy tak wysoka czułość nie jest poŝądana, moŝe zostać wykonana alternatywna procedura poprzez przeprowadzanie 10 minutowych inkubacji w etapach od 3 do 7. Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Podobnie, wszystkie inkubacje naleŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Nie dopuszczać do wysuszenia skrawków tkankowych w trakcie procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkanek mogą wykazywać zwiększone nieswoiste barwienie. Zakryć szkiełka wystawione na działanie ruchów powietrza. Jeśli wykorzystuje się wydłuŝone inkubacje, naleŝy umieścić tkanki w wilgotnym środowisku. W celu zredukowania nieswoistego barwienia tła zdecydowanie zaleca się płukanie skrawków tkankowych w roztworze TBST i inkubowanie ich w temperaturze pokojowej przez minimum trzy minuty w co najmniej jednej świeŝej łaźni TBST pomiędzy kaŝdym etapem odczynnikowym w protokole systemu CSA System, HRP, w tym podczas etapów protokołu systemu blokowania biotyny (Biotin Blocking System). W celu dalszej supresji barwienia tła skrawki tkankowe naleŝy inkubować przez pięć minut w trzech świeŝych łaźniach TBST pomiędzy kaŝdym etapem odczynnikowym. Odparafinowanie skrawków tkankowych Przed wykonaniem barwienia naleŝy usunąć parafinę ze szkiełek z tkankami w celu usunięcia środka, w którym były zanurzone i ponownie je nawodnić. Unikać niepełnego usuwania parafiny. Resztki parafiny spowodują wzrost nieswoistego wybarwienia. Proteolityczne trawienie oraz odzyskiwanie docelowe Formaldehyd wprowadza zmiany konformacyjne w cząsteczkach antygenowych poprzez formowanie międzycząsteczkowych wiązań krzyŝowych. Nadmierne utrwalanie formaliną moŝe maskować miejsca antygenowe oraz pomniejszać barwienie swoiste. W standardowych procedurach ICH, miejsca te mogą zostać odkryte przy pomocy trawienia proteolitycznego danej tkanki przed wykonaniem immunobarwienia. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 6/11
Uwaga: UŜycie wstępnego trawienia proteolitycznego moŝe spowodować duŝe wybarwienie tła przy korzystaniu z niniejszego systemu. Odzyskiwanie docelowe jest przyjmowaną alternatywą trawienia, której wynikiem jest nieznaczny wzrost wybarwienia tła połączony ze znacznym wzrostem barwienia swoistego z wieloma pierwszymi przeciwciałami. W celu określenia czy uzasadniona jest obróbka wstępna tkanek odzyskiwaniem docelowym naleŝy sprawdzić w specyfikacji dostarczanej z kaŝdym pierwszym przeciwciałem. Procedura ta jest wymagana dla niektórych pierwszych przeciwciał. Procedura odzyskiwania docelowego obejmuje zanurzenie skrawków tkankowych zamocowanych na szkiełkach w roztworze (Target Retrieval Solution, nr katalogowy S1699, S1700 lub w K1499) oraz podgrzanie przed wykonaniem barwienia immunohistochemicznego. Dokładnie wypłukać 0,05 mol/l buforem Tris-HCl i kontynuować procedurę barwienia. Uwaga: Tkanki tłuszczowe mogą oddzielać się od szkiełek opłaszczonych poli-l-lizyna w trakcie odzyskiwania docelowego. Zaleca się korzystanie z szkiełek silanizowanych lub naładowanych przy odzyskiwaniu docelowym. Blokowanie endogennej aktywności wiązania awidyny (endogenna biotyna). W konwencjonalnych technikach awidyna-biotyna ocena wybarwienia swoistego moŝe zostać utrudniona w związku z obecnością endogennej biotyny. Fakt ten ma duŝe znaczenie dla systemu CSA System, HRP ze względu na jego duŝą czułość. Zaleca się rutynowe blokowanie endogennej biotyny poprzez naniesienie kolejno awidyny i biotyny. System blokowania biotyny - Biotin Blocking System (nr katalogowy X0590 lub w K1499) został opracowany w taki sposób, aby był kompatybilny z systemem CSA System, HRP. Procedura barwienia ETAP 1 PEROXIDASE BLOCK Strząsnąć nadmiar płynu ze szkiełka. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka gazy) ostroŝnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. Nanieść ilość nadtlenku wodoru z butelki 1 wystarczającą do pokrycia próbki. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Następnie umieścić w świeŝej łaźni buforowej na okres minimum trzech minut. Uwaga: Zdecydowanie zaleca się uŝycie 0,05 mol/l buforu Tris-HCl o ph 7,6 zawierającego 0,3 mol/l NaCl oraz 0,1% Tween 20 jako buforu przemywającego oraz łaźni buforowej. ETAP 2 PROTEIN BLOCK ( BLOK BIAŁKA) Strząsnąć nadmiar płynu ze szkiełka i wytrzeć je we wcześniej opisany sposób. Nanieść ilość kropel z butelki 2 (Protein Block) wystarczającą do pokrycia skrawka tkankowego. Inkubować przez 5 (±1) minut. NIE SPŁUKIWAĆ PRODUKTU PROTEIN BLOCK ETAP 3 PIERWSZE PRZECIWCIAŁO LUB ODCZYNNIK KONTROLI UJEMNEJ Strząsnąć nadmiar produktu Protein Block ze szkiełka i wytrzeć je we wcześniej opisany sposób. Nanieść ilość pierwszego przeciwciała lub odczynnika kontroli ujemnej wystarczającą do pokrycia próbki. Inkubować przez okres 15 (±1) minut o ile nie został konkretnie podany inny czas inkubacji w arkuszuu parametrów pierwszego przeciwciała. Delikatnie przepłukać roztworem buforu TBST z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w maksymalnie do trzech świeŝych łaźniach buforowych, w kaŝdej na okres 3 5 minut. Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała (etap 3) lub przeciwciała łączącego (etap 4) szkiełka moŝna przechowywać zanurzone w kąpieli buforowej do jednej godziny, w temperaturze pokojowej (20 25 C) bez wpł ywu na jakość barwienia. ETAP 4 PRZECIWCIAŁO ŁĄCZĄCE LINK ANTIBODY Wytrzeć szkiełka w opisany wcześniej sposób. Nanieść ilość kropel z butelki 4 (Link Antibody) wystarczającą do pokrycia skrawka tkankowego. Inkubować przez 15 (±1) minut. Przemyć szkiełka w sposób opisany w etapie 3. Umieścic w maksymalnie do trzech świeŝych kąpielachłaźniach buforuowych TBST, w kaŝdej na okres 3 5 minut w kaŝdej. W przypadku uŝywania króliczych pierwszych przeciwciał, zaleca się korzystanie z produktu CSA Rabbit Link (nr katalogowy K1498) zamiast dostarczanego Link Antibody. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 7/11
ETAP 5 ETAP 6 ETAP 7 ETAP 8 ETAP 9 STREPTAVIDIN-BIOTIN COMPLEX (KOMPLEKS STREPTAWIDYNA-BIOTYNA) Wytrzeć szkiełka w opisany wcześniej sposób. Nanieść ilość kropel przygotowanego kompleksu streptawidyna-biotyna wystarczającą do pokrycia skrawka tkankowego. Inkubować przez 15 (±1) minut. Przepłukać szkiełka w opisany wcześniej sposób. Umieścic w maksymalnie do trzech świeŝych kąpielachłaźniach buforu TBST, w kaŝdej na okres 3 5 minut w kaŝdej. AMPLIFICATION REAGENT (ODCZYNNIK AMPLIFIKACYJNY) Wytrzeć szkiełka w opisany wcześniej sposób. Nanieść ilość kropel z butelki 8 (Amplification Reagent) wystarczającą do pokrycia skrawka tkankowego. Inkubować przez 15 (±1) minut. Przepłukać szkiełka w opisany wcześniej sposób. Umieścic w maksymalnie do trzech świeŝych kąpielachłaźniach buforuowych TBST, w kaŝdej na okres 3 5 minut w kaŝdej. STREPTAVIDIN-PEROXIDASE (STREPTAWIDYNA-PEROKSYDAZA) Wytrzeć szkiełka w opisany wcześniej sposób. Nanieść ilość kropel z butelki 9 (Streptavidin-Peroxidase) wystarczającą do pokrycia skrawka tkankowego. Inkubować przez 15 (±1) minut. Przepłukać szkiełka w opisany wcześniej sposób. Umieścić w maksymalnie do trzech świeŝych kąpielachłaźniach buforuowych TBST, w kaŝdej na okres 3 5 minut w kaŝdej. ROZTWÓR SUBSTRAT- CHROMOGEN Wytrzeć szkiełka w opisany wcześniej sposób. Nanieść ilość roztworu substratu-chromogenu wystarczającą do pokrycia próbki (patrz paragraf: Przygotowanie odczynników). Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady substratu-chromogenu do pojemnika na odpady skaŝone w celu właściwego ich usunięcia. BARWIENIE NEGATYWNE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalne) Zanurzyć szkiełka w łaźni hematoksyliny (np. w produkcie takim jak nr katalogowy S3309). Czas trwania inkubacji zaleŝy od stęŝenia zastosowanej hematoksyliny. Delikatnie przepłukać w łaźni wody destylowanej. Zanurzyć szkiełka 10 razy w łaźni wody amoniakalnej o stęŝeniu 0,037 mol/l lub podobnego środka barwiącego na niebiesko. Przepłukać szkiełka w łaźni wody destylowanej lub dejonizowanej przez 2 5 minut. ETAP 10 MOCOWANIE Skrawki tkankowe mocuje się i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym przy pomocy wodnego środka mocującego opartego, na wodzie np.jak Glycergel (nr katalogowy C0563) lub Faramount (nr katalogowy S3025) Kontrola jakości RóŜnice w przetwarzaniu tkanek i w procedurach technicznych w laboratorium uŝytkownika mogą stwarzać znaczące róŝnice w wynikach, wymagające regularnego wykonywania kontroli procedur wykonawczych. Dodatkowe informacje na temat kontroli jakości są zawarte w pozycjach piśmiennictwa od 8 do 10. Informacje szczegółowe dotyczące czułości i immunoreaktywności uŝywanego pierwszego przeciwciała zawsze są podane w jego specyfikacji. Tkanka Kontroli Dodatniej NaleŜy wykorzystywać znane tkanki kontroli dodatniej do monitorowania prawidłowego barwienia przetwarzanych tkanek oraz działania odczynników testowych. Jeśli próba kontroli dodatniej nie wykazuje dodatniego barwienia, wówczas badane próbki naleŝy uwaŝać za niewaŝne. Odczynnik kontroli ujemnej Stosować odczynnik kontroli ujemnej zamiast pierwszego przeciwciała wraz ze skrawkiem kaŝdej próbki testowej dla oceny nieswoistego barwienia i umoŝliwienia lepszej interpretacji swoistego barwienia w miejscu antygenu. JeŜeli na seryjnych skrawkach tkankowych zostaną uŝyte panele przeciwciał, ujemne obszary barwienia na jednym ze szkiełek mogą zostać uŝyte jako ujemna / nieswoista kontrola wiązania tła dla innych przeciwciał. Szczegółowe informacje na temat kontroli ujemnych i dodatnich podano w General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne informacje dotyczące barwienia immunohistochemicznego). Środki zaradcze dotyczące wyników badań stanowiących odchylenie od normy zostały opisane w rozdziale Rozwiązywanie problemów. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 8/11
Interpretacja barwienia Próbki kontroli dodatniej naleŝy badać jako pierwsze, aby stwierdzić czy wszystkie odczynniki działają prawidłowo. Obecność brązowego produktu końcowego w miejscu docelowego antygenu wskazuje na dodatnią reaktywność. Jeśli próba kontroli dodatniej nie wykazuje dodatniego barwienia, wówczas badane próbki naleŝy uwaŝać za niewaŝne. Barwienie nieswoiste (o ile obecne), będzie miało charakter rozproszony lub kropkowy. Wysoka czułość niniejszego systemu jest uzyskiwana poprzez duŝy poziom amplifikacji; wszelkie obecne nieswoiste barwienia tła równieŝ zostaną zamplifikowane. Z tego powodu zaleca się uŝywanie odczynników kontroli ujemnej na kaŝdym skrawku próbek kontrolnych oraz testowych w celu zapewnienia pomocy w interpretacji barwienia (patrz: Ograniczenia, w celu zapoznania się z omówieniem nieswoistego barwienia). Sporadyczne lekkie wybarwienie tkanki łącznej moŝna takŝe zauwaŝyć w wycinkach nadmiernie utrwalonych formaliną. Do interpretacji wyników barwienia naleŝy uŝywać nienaruszonych komórek. Komórki nekrotyczne lub zdegenerowane częste wybarwiają się nieswoiście. Wyniki fałszywie dodatnie mogą być widoczne w związku z nieimmunologicznym wiązaniem odczynników do skrawków tkankowych. Ograniczenia właściwe dla produktu Endogenne immunoglobuliny obecne w próbkach tkanek ludzkich mogą wykazywać róŝne poziomy reaktywności krzyŝowej z drugimi przeciwciałami anty-immunoglobulinowymi. Drugie przeciwciało uŝyte w systemi jest wysoce oczyszczonym biotynylowanym fragmentem F(ab')2 króliczego przeciw-mysiego IgG (swoiste w stosunku do cięŝkiego i lekkiego łańcucha). Przeciwciało to zostało w duŝym stopniu połączone z normalną ludzką surowicą w celu zmniejszenia reaktywności krzyŝowej. JednakŜe ze względu na wysoką czułość systemu, w niektórych próbkach nadal moŝe zostać wykryta reaktywność krzyŝowa względem endogennych immunoglobulin. Barwienie tła pod względem endogennych immunoglobulin jest najlepiej rozpoznawalne jako barwienie w kontroli negatywnej dookoła naczyń krwionośnych i limfatycznych, w tkance łącznej oraz w pozanaczyniowych obszarach tkankowych. Pewne rodzaje nabłonka, szczególnie związane z przewodem pokarmowym, mogą równieŝ wykazywać obecność endogennych immunoglobulin. Barwienie pod względem endogennych immunoglobulin moŝe zostać równieŝ zwiększone przez uŝycie metod odzyskiwania docelowego. Z tego powodu wymagane jest uŝycie odpowiednich odczynników oraz tkanek kontroli ujemnej do interpretacji jakiegokolwiek dodatniego barwienia w próbce, w której podejrzewa się obecność endogennych immunogobulin. Endogenną aktywność wiązania awidyny odnotowano w zamroŝonych skrawkach wątroby (cały guzek wątrobowy) i nerek (nabłonek cylindryczny), jak równieŝ w zamroŝonych i utrwalonych w formalinie tkankach limfoidalnych. 11 Zaleca się rutynowe uŝywanie systemu Biotin Blocking System (nr katalogowy X0590 lub w produkcie K1499) w celu zredukowania nieswoistego barwienia związanego z endogenną aktywnością wiązania awidyny. Endogenna aktywność peroksydazy lub pseudoperoksydazy moŝe być wykazywana przez hemoproteiny takie jak hemoglobina, mioglobina, cytochromy i katalaza jak równieŝ przez eozynofile. 12,13 Ta aktywność moŝe zostać zahamowana przez inkubację próbki z blokiem peroksydazy (Peroxidase Block, butelka 1 systemu CSA, HRP) przez pięć minut przed naniesieniem pierwszego przeciwciała. Tkanki zawierające antygen powierzchniowy zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienia z peroksydazą chrzanową. 14 Normalne / nieimmunogenne surowice pochodzące z tego samego źródła zwierzęcego co drugie surowice odpornościowe uŝywane w etapach blokowania mogą powodować fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie wyniki związane z auto-przeciwciałami lub naturalnymi przeciwciałami. Nie stosować tego zestawu na mysich tkankach. Przeciwciało łączące przeciw-mysie immunoglobuliny zawarte w niniejszym zestawie będzie reagować z mysimi immunoglobulinami endogennymi dla mysiej tkanki, co spowoduje wysokie zabarwienie tła. Rozwiązywanie problemów Opis problemu Prawdopodobna przyczyna Suggested Action 1. Brak barwienia szkiełek 1a. Odczynniki zastosowane w nieprawidłowej kolejności 1a. Sprawdzić kolejność stosowanych odczynników. 2. Słabe barwienie szkiełek. 3. Nadmierne barwienie tła na wszystkich szkiełkach. 1b. Obecność azydku sodu w kąpieli buforowej 2a. Skrawki zachowują zbyt duŝo roztworu po łaźni przemywającej. 2b. Szkiełka nie były inkubowane dostatecznie długo z przeciwciałami lub substratem. 2c. Trawiony antygen wymaga odzyskiwania docelowego. 3a. Próbki zawierają wysoce endogenne immunoglobuliny. 1b. Zastosować świeŝy bufor nie zawierający azydku sodu. 2a. Łagodnie strząsnąć nadmiar roztworu przed wytarciem dookoła skrawka. 2b. Sprawdzić zalecany czas inkubacji. 2c. Przeprowadzić odzyskiwanie docelowe. 3a.UwaŜnie porównać tkankę badaną z odczynnikiem kontroli ujemnej pod kątem róŝnic. (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 9/11
3b. Próbki zawierają endogenną aktywność wiąŝącą awidynę (endogenna biotyna). 3c. Próbki posiadają wysoką endogenną aktywność peroksydazową. 3d. Parafina nie została całkowicie usunięta. 3e. Szkiełka nie zostały prawidłowo przepłukane 3f. Szybsza niŝ zwykle reakcja substratów spowodowana np. nadmierną temperaturą pomieszczenia. 3g. Skrawki wyschły podczas procedury barwienia 3h. Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka tkankowego. 3b. Nanieść system blokowania biotyny Biotin Blocking System. 3c. Stosować dłuŝszy czas inkubacji z Peroxidase Block. 3d. Stosować świeŝe kąpiele ksylenowe lub toluenowe. JeŜeli jednocześnie jest barwionych kilka szkiełek, druga kąpiel ksylenowa powinna zawierać świeŝy ksylen. 3e. Stosować świeŝe roztwory dla łaźni buforowych i tryskawek. Zalecane jest uŝycie TBST. Inkubować skrawki w maksymalnie do trzech łaźni buforu TBST, w kaŝdej przez 35 minut. 3f. Stosować krótszy czas inkubacji z roztworem substrat-chromogen. 3g. Stosować komorę wilgotną. Jednorazowo wycierać tylko trzy do czterech szkiełek przed naniesieniem odczynnika. 3h. Stosować dłuŝszy czas inkubacji z Protein Block. 3i.Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka tkankowego. 3i. Rozcieńczyć pierwsze przeciwciało w przeciwciele rozcieńczalnikowym. UWAGA: Jeśli problemu nie moŝna przypisać Ŝadnemu z powyŝszych powodów lub, gdy sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŝy skontaktować się z Działem Wsparcia Technicznego firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŝna znaleźć w podręczniku firmy Dako Handbook -Immunochemical Staining Methods 6 (dostępny w firmie Dako) oraz w Atlasie Immunohistologii (Atlas of Immunohistology 15 ). Piśmiennictwo 1. Bobrow M, et al. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. J Immunol Meth 1989; 125:279 2. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78 127, Current 13. August 16, 1976 3. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 4. List of substances which may be candidates for further scientific review and possible identification, classification and regulation as potential carcinogens. Fed Reg 1980; 45(157) 5. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81 6. Naish SJ (ed). Handbook - Immunochemical Staining Methods. Carpinteria: Dako 1989 7. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase: I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14:767 8. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 10. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 11. Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37:223 12. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 13. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 14. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 15. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 10/11
Edition 07/15 (127892-001) P04038PL_01_K1500/2015.07 s. 11/11