Genom człowieka. Typy mutacji genomu i związane z tym choroby genetyczne. III Rok WL1 dr Katarzyna Wicher 1. Budowa, funkcje i rodzaje DNA -podstawowe funkcje kwasu deosyrybonukleinowego -struktura prawoskrętnej helisy DNA-B, rodzaje wiązań stabilizujących strukturę helisy, pojęcie komplementarności nici, zasada Chargaffa -konformacje DNA: DNA-A, DNA-B, DNA-Z -etapy kondensacji chromatyny (nukleosom, nukleofilamenty, solenoid, włókienka wyższego rzędudomeny pętlowe, chromosom metafazowy) 2. Genom-całkowity DNA zawarty w komórce danego organizmu. Genom człowieka zawiera około 21 000 genów kodujących białka, a odcinki kodujące stanowią tylko ok. 3% całego genomu. Budowa fizyczna genomu człowieka Genom jądrowy zbudowany z około 3 Gb (3000 Mb), dsdna złożony z 24 rożnych liniowych cząsteczek chromosomów zakres wielkości cząsteczek (chromosomów) od 55 Mb do 250 Mb wśród chromosomów wyróżniamy autosomy i heterosomy Genom mitochondrialny dziedziczony w linii matczynej zbudowany z około 16 kb kolista cząsteczka dsdna występuje w komórce w wielu kopiach obecny we wszystkich mitochondriach (w wielu kopiach) wykazuje wyższą częstość mutacji niż DNA jądrowy (wolne rodniki tlenowe, brak systemów naprawczych, inna struktura mtdna - brak histonów, brak intronów) charakterystyczny wzór dziedziczenia (rodowód: chora matka ma wszystkie dzieci chore, chory ojciec nie przekazuje choroby potomstwu) 3. Geny i sekwencje związane z genami (30%) eksony introny pseudogeny fragmenty genów sekwencje regulatorowe (blisko i dalekozasięgowe) 4. Budowa genu- eksony, introny oraz sekwencje 5 oraz 3 flankujące
. Dwa przykłady niezwykłej organizacji genów: Geny nakładające się W niektórych regionach chromosomów, w których zagęszczenie genów jest duże, a sekwencja jest bogata w pary GC mamy do czynienia ze zjawiskiem nakładania się genów (ang. overlapping genes). Zwykle sekwencje aminokwasowe białek kodowanych przez kilka genów zachodzących na siebie nie są podobne. Przykładem mogą być geny kompleksu HLA w chromosomie pary 16 (lokalizacja 16p21.3). Geny wewnątrz genów Jeden gen znajduje się wewnątrz intronu innego genu stosunkowo powszechna cecha genomów jądrowych. Gen NF1 (neurofibromina 1) zawiera w obrębie swojej sekwencji intronowej trzy inne, mniejsze geny: OGMP, EVI2B i EVI2A. Geny te ulegają transkrypcji w kierunku przeciwnym niż gen NF1. Pojęcie nici sensownej i antysensownej. 5. Pozagenowy DNA sekwencje unikatowe sekwencje powtórzone (repetytywne): rozproszone i tandemowe (zwarte) Sekwencje powtórzone tandemowe (zwarte) Satelitarne większość powtórzeń występuje w regionach centromerowych chromosomu, odgrywając tam prawdopodobnie funkcję strukturalną; powtórzenia dochodzą do setek tysięcy par zasad: - minisatelitarne fragmenty długości sięgającej 20 kb, z powtarzająca się jednostką długości około 10-100 bp; występują najczęściej w telomerach lub w pobliżu końców chromosomu; funkcja nieznana - mikrosatelitarne powtórzenia krótkie, zwykle poniżej 150 bp, a jednostka powtórzona to najczęściej 2-4 bp; funkcja nieznana, ale powtórzenia tego typu znalazły zastosowanie jako marker molekularny (np. ustalanie profilu genetycznego kryminalistyka, wykluczenie ojcostwa, diagnostyka chorób genetycznych). Sekwencje powtórzone rozproszone (transpozony i retrotranspozony)
6. Mapowanie genomu - Krótkie SINE (ang. short interspersed nuclear element) - krótkie rozproszone sekwencje jądrowe o długości około 100-400 bp. Najbardziej znana to sekwencja Alu o wielkości 300 bp, która powtarza się ok. miliona razy i tworzy 10% ludzkiego DNA. - Długie LINE (ang. long interspersed nuclear element) - długie rozproszone sekwencje jądrowe; sekwencje o długości około 6 kb. Najbardziej znana to sekwencja LINE-1 powtórzona ok. 800 tys. razy, zajmująca 21% ludzkiego DNA. Mapowanie polega na opracowaniu szczegółowych map chromosomów, które odzwierciedlają położenie znanych genów, jak również sekwencji DNA o nieznanej funkcji w genomie. Mapowanie genomu opiera się na dwóch metodach: - mapowaniu fizycznym - mapowaniu genetycznym Mapowanie fizyczne: Mapy fizyczne tworzy się za pomocą sklonowanych odcinków DNA, których funkcja w organizmie nie musi być znana. W odróżnieniu do map genetycznych uwzględniają takie szczegóły molekularne, jak: eksony, introny, sekwencje regulatorowe itp. Jednostką mapowania fizycznego jest para zasad (ang. base pair)- bp. Mapowanie genetyczne: Podstawą mapowania genetycznego jest zjawisko rekombinacji Mapy genetyczne sporządza się, analizując sprzężenia na podstawie oceny częstości rekombinacji pomiędzy genami leżącymi na tym samym chromosomie. Im bliżej siebie leża dwa geny, tym mniejsza szansa, że będą one rozdzielone podczas rekombinacji (crossing-over), dlatego współczynnik rekombinacji może być używany jako miernik odległości między genami Współczynnik rekombinacji wynoszący 1% (1c-o na 100 podziałów), nazywany jest centymorganem (cm) 7. Sekwencjonowanie genomu człowieka Cele: Fakty: skonstruowanie szczegółowych map fizycznych i genetycznych całego genomu człowieka, zlokalizowanie wszystkich genów w obrębie genomu człowieka wypracowanie metod przechowywania i udostępniania uzyskanych danych; ulepszenie metod sekwencjonowania uzyskanie wiedzy na temat skutków społecznych, ideologicznych i etycznych nowych technologii genetycznych 2003 kompletna sekwencja genomu człowieka 2007 opublikowano sekwencję genomu Craiga Ventera 2007 - James Watson - pierwszy osobisty genom (1 milion dolarów, 2 miesiące, sekwencja opublikowana: http://jimwatsonsequence.cshl.edu/cgiperl/gbrowse/jwsequence/, za wyjątkiem genu ApoE) 2008 pierwszy zsekwencjonowany genom osoby pochodzącej z Europy oraz pierwszy genom kobiety, Holenderki dr Marjolein Kriek (40.000 Euro, 6 miesięcy)
2008 opublikowano sekwencje genomu Azjaty (Chińczyka Han) oraz Nigeryjczyka (plemię Yoruba) 11 marca 2009 - Personal Genome Project Osobiste Genomy - cel - zsekwencjonowanie genomów 100 000 ochotników PG-10 pierwszych 10 ochotników, których dane są ogólnie dostępne http://www.personalgenomes.org/mission.html Sekwencjonowanie genomu - przyszłość The Personal Genome Sequencing Service 10 czerwca 2009 - Illumina - amerykańska firma z obszaru life-science, zajmująca się sekwencjonowaniem, genotypowaniem i ekspresją genów, zaoferowała możliwość komercyjnego sekwencjonowania genomu za kwotę mniejszą niż 50 000 dolarów (dane zawierałyby informacje o polimorfizmach typu SNP oraz CNV) Dr Jay Flatley (President of Illumina) - przewiduje, że w 2019 roku sekwencjonowanie genomu będzie rutynową techniką wykonywaną tuż po urodzeniu dziecka, a cena sekwencjonowania genomu spadnie poniżej 1000 dolarów 8. Mutacje Mutacją nazywamy utrwaloną zmianę w materiale dziedzicznym. Zmiany w DNA mogą być różnego typu (w zależności, jakiej części genomu dotyczy). Mutacje mogą być dla organizmu korzystne, neutralne oraz szkodliwe (przykłady). 9. Typy chorób genetycznych (w zależności od rodzaju oraz obszaru uszkodzenia materiału genetycznego) 1. Spowodowane aberracjami chromosomowymi (13,18,21, X, XXY) 2. Spowodowane mutacją pojedynczego genu (choroby jednogenowe) 3. Choroby mitochondrialne 4. Mikrorearanżacje (np. zespoły mikrodelecji) 5. Zaburzenia piętnowania genomowego (Angleman, Prader-Willi) 6. Uwarunkowane wieloczynnikowo 10. Aberracje chromosomowe Mutacje o dużym zasięgu występowania (dostępne do badania technikami mikroskopii świetlnej), dotyczące dużego obszaru DNA. Można je podzielić na: liczbowe (odchylenie od normalnej liczby chromosomów) strukturalne (zmienia się struktura chromosomów Liczbowe aberracje chromosomowe Poliploidia (3n,4n itp.) - Triploidia (69,XXX,XXY lub XYY) 1-3% wszystkich poczęć, w większości przypadków poronienia samoistne Aneuploidia (autosomy) (2n+1, 2n-1 itp.) - Nullisomia (utrata pary chromosomów homologicznych) - Monosomia (utrata jednego chromosomu) - Trisomia (jeden chromosom dodatkowy) letalne przed implantacją letalne w stadium embrionalnym zwykle letalne, z wyjątkiem trisomii chromosomów 13, 18, 21
Aneuploidia (chromosomy płci) - Dodatkowy chromosom płci (XXY,XXX,XYY) - Utrata chromosomu płci (45,X) normalna długość życia 99% przypadków-poronienia samoistne, normalna inteligencja, bezpłodność Strukturalne aberracje chromosomowe Zrównoważone: Translokacje (translokacje wzajemne, fuzje centryczne) Inwersje Niezrównoważone: Duplikacje Delecje Chromosomy pierścieniowe Izochromosomy Fragmenty centryczne (chromosomy markerowe) 11. Choroby uwarunkowane jednogenowo Zmiany materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami biologii molekularnej Mutacje dotyczą tylko jednego genu. (Mukowiscydoza, Hemofilia, Głuchota wrodzona, Rdzeniowy zanik mięśni, Zespół łamliwości chromosomu X, Dystrofia mięśniowa Duchenne a, Hemochromatoza, Albinizm, Fenyloketonuria, Galaktozemia, Zespół Retta, Anemia sierpowata i inne) Mutacje genowe etiologia chorób jednogenowych Mutacje genowe - zmiany normalnej sekwencji DNA organizmu, spowodowane błędami w replikacji DNA (mutacje spontaniczne) lub działaniem czynników chemicznych i fizycznych (mutacje indukowane). Zachodzą w zygocie, płodzie, komórkach somatycznych i rozrodczych w ciągu całego życia. Mutacje w komórkach somatycznych (mutacje somatyczne) nie są przekazywane potomstwu, w odróżnieniu od mutacji w komórkach rozrodczych (mutacje germinalne), które mogą zostać potomstwu przekazane. Mutacje somatyczne odgrywają dużą rolę w rozwoju nowotworów u ludzi. Mutacje w komórkach rozrodczych mogą być odziedziczone lub powstają de novo w procesie oogenezy lub spermatogenezy. Mutacje spontaniczne powstają w wyniku: błędów replikacyjnych poślizgu replikacyjnego powstawania struktur trzecio- i czwartorzędowych Częstość mutacji jest niejednakowa dla różnych miejsc w genie (loci). Mutacje spontaniczne mogą powstać z większą częstością w charakterystycznych miejscach genu zwanych gorącymi miejscami (z ang. hot spots). Mutacje indukowane:
Mutageny chemiczne Mutageny fizyczne Typy mutacji genowych: duże zmiany genowe (więcej niż jeden nt) mutacje punktowe (dotyczące jednego nt) mutacje transkrypcyjne (regiony regulatorowe) mutacje splicingowe (GUAG) mutacje dynamiczne Duże zmiany genowe: delecje duplikacje insercje Delecje: Utrata części sekwencji DNA (alfa-talasemia, rdzeniowy zanik mięśni, rodzinna hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa Duchenne a i Beckera, mukowiscydoza, zespół Pradera Willi ego). Delecja małego fragmentu eksonu 44 genu dystrofiny powoduje ciężką formę DMD, natomiast duża delecja, która zajmuje ponad połowę całego genu, powoduje łagodniejszą chorobę BMD. Efekt mutacji zależy więc nie od wielkości delecji, ale od tego czy delecja ta zaburza ramkę odczytu, czy też nie.
Duplikacje: Powielenie sekwencji DNA (rodzinna hipercholesterolemia, dystrofia mięśniowa Duchenne a, zespół Westa). Insercje: Wbudowanie dodatkowej sekwencji DNA (np. hemofilia, mukowiscydoza). Przykład: W obrębie wstawionego insertu może znajdować się kodon stop, co w konsekwencji spowoduje syntezę skróconego białka, które okaże się być niefunkcjonalne. Mutacje transkrypcyjne: Występują w regionie genu związanym z regulacją procesu transkrypcji, czego efektem jest spadek produkcji białka (np. polidaktylia - mutacja w rejonie regulatorowym genu SHH). Mutacje splicingowe Położone na złączach intron - ekson, zakłócające proces wycinania intronów (np. fenyloketonuria, beta-talasemia, mukowiscydoza). Mutacje punktowe Dotyczą tylko jednego nukleotydu i są najczęstszymi mutacjami w genomie ludzkim. Typy mutacji punktowych: insercje - wbudowanie dodatkowego nukleotydu delecje - wypadnięcie nukleotydu (głuchota wrodzona; 35delG, zespół Marfana) tranzycje - zamiana puryny na purynę lub pirymidyny na pirymidynę o (achondroplazja, mukowiscydoza) transwersje - zamiana puryny na pirymidynę lub odwrotnie (achondroplazja, anemia sierpowata) Przykład: Achondroplazja - substytucje w genie FGFR3 (ang. Fibroblast Growth Factor Receptor 3) w pozycji nukleotydu 1138: tranzycja G>A u 98% pacjentów transwersja - G>C u 1% pacjentów 80% -mutacja de novo na chromosomie 4 dziedziczonym od ojca Mutacje dynamiczne: Pierwszą mutację dynamiczną odkryto w 1991 roku (gen FMR1) Mutacje dynamiczne stwierdzono tylko u człowieka. Mutacje dynamiczne wykazują dużą zmienność populacyjną. Mutacje dynamiczne stanowią podłoże molekularne 14 jednostek chorobowych mutacje polegające na wzroście liczby powtórzeń (3-, 4-, 12- nukleotydowych) ilość powtórzeń może wzrastać w kolejnych pokoleniach
- antycypacja-objawy choroby zaczynają objawiać się coraz wcześniej i w coraz większym nasileniu w kolejnych pokoleniach - premutacja wzrost ilości powtórzeń poniżej wartości granicznej nie powoduje wystąpienia choroby bezobjawowi nosiciele. Choroby: choroba Huntingtona (CAG), zespół łamliwego chromosomu X (CGG), ataksje módżkowordzeniowe, rdzeniowo-opuszkowy zanik mięśni, dystrofia miotoniczna. Zespół łamliwego chromosomu X (FraX) Mutacja dynamiczna w genie FMR1 w długim ramieniu chromosomu X Wzrost ilości powtórzeń sekwencji CGG powyżej 200 Osoby zdrowe - do 54 powtórzeń, nosiciele bezobjawowi - do 200 powtórzeń (tzw. premutacja) Skutki mutacji genowych: mutacje missens (zmiany sensu) zmiana nukleotydu w pierwszej lub drugiej pozycji kodonu powoduje zmianę kodowanego przez triplet aminokwasu. Zmienia się aminokwas w białku mutacje neutralne (ciche, synonimiczne) nie powodują zmiany kodowanego aminokwasu, ponieważ zmiana nukleotydu następuje w trzeciej pozycji tripletu lub też mutacja nie dotyczy sekwencji kodujących lub z nimi związanych. mutacje nonsens (stop) w wyniku mutacji (delecji, insercji lub substytucji nukleotydu/ów) powstaje przedwcześnie kodon terminacyjny stop, czego efektem jest białko skrócone i pozbawione funkcji mutacje zmiany ramki odczytu - delecja lub insercja w rejonie kodującym (nie będąca wielokrotnością trzech nukleotydów) genu zmienia wszystkie występujące za mutacją kodony; następuje zmiana sekwencji aminokwasowej zmienia się kodowane białko mutacje transkrypcyjne występują w obszarze regulującym proces transkrypcji czego efektem jest spadek lub wzrost produkcji białka (np. polidaktylia - mutacja w rejonie regulatorowym genu SHH) mutacje splicingowe zaburzenia w składaniu RNA (np. beta-talasemia). Skutki mutacji ze względu na funkcję białka: Utrata funkcji mutacja znosi lub zmniejsza aktywność białka; większość mutacji tego typu jest recesywna, ale zdarzają się sytuacje, w których mutacja ma charakter dominujący (np. zespół Marfana, geny supresorowe nowotworów BRCA1). Nabycie funkcji mutacja nadaje białku nietypową aktywność, często niepożądaną lub toksyczną, albo aktywność w niewłaściwej tkance czy okresie rozwoju; mutacje tego typu występują rzadziej i mają najczęściej charakter dominujący (np. protoonkogeny). Mutacje znoszące Istnieją takie mutacje, które znoszą działanie innych, wcześniejszych mutacji. Na przykład pierwsza mutacja powoduje utratę funkcji kodowanego białka, a kolejna znosi tę pierwszą mutację i przywraca wytwarzanie funkcjonalnego białka lub maskuje jego brak. Obie mutacje mogą zachodzić w tym samym regionie DNA lub w zupełnie odległych od siebie miejscach.
14. Polimorfizm, a mutacje Polimorfizm genetyczny oznacza występowanie w populacji dwóch lub więcej form danego genu alleli z częstością większą niż oczekiwana, wynikającą z ogólnej częstości mutacji w danej populacji. Ponieważ częstość mutacji w danej populacji jest trudna do sprecyzowania, przyjęto, że o polimorfizmie można mówić, gdy najrzadszy wariant alleliczny w danym locus występuje z częstością większą niż 1%. Polimorfizm, podobnie jak mutacja, jest efektem zmian sekwencji DNA.