Metody wstępnej obróbki surowców lignocelulozowych w procesie produkcji bioetanolu drugiej generacji

Marta Wilk, Małgorzata Krzywonos * Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Methods for pretreatment of lignocellulose raw materials in second-generation bioethanol production Metody wstępnej obróbki surowców lignocelulozowych w procesie produkcji bioetanolu drugiej generacji DOI: 10.15199/62.2015.4.20 A review, with 122 refs., of chem., phys. and mech. methods and industrial projects of the process commercialization. Przedstawiono metody obróbki wstępnej materiałów lignocelulozowych, kluczowego etapu produkcji bioetanolu, od którego zależy efektywność procesu. Opisano wady i zalety każdej z metod konwersji. Przytoczono przykłady biorafinerii wytwarzających etanol drugiej generacji, wraz z opisem stosowanej metody przetwarzania surowców. Wizja kurczących się zasobów ropy naftowej oraz globalnego ocieplenia skłania ludzkość do poszukiwania alternatywnych źródeł energii. Paliwa konwencjonalne zastępuje się biopaliwami wytwarzanymi z odnawialnych surowców, głównie roślinnych. Biopaliwa motorowe pierwszej generacji produkowane na skalę przemysłową to bioetanol cukrowo-skrobiowy i biodiesel z rzepaku. Bioetanol wytwarzany jest głównie przez fermentację alkoholową z wykorzystaniem drożdży. Pierwszym etapem produkcji jest wstępne przetwarzanie surowca w celu uwolnienia z niego cukrów prostych, po nim następuje fermentacja z udziałem mikroorganizmów syntezujących alkohol etylowy, poddawany następnie destylacji i dehydratacji. W ten sposób otrzymuje się etanol o czystości powyżej 99%. Procesy produkcji bioetanolu różnią się w zależności od stosowanego surowca, którym mogą być surowce cukrowe, skrobiowe i lignocelulozowe. Różnice wynikają z konieczności zastosowania mniej lub bardziej złożonego etapu wstępnej obróbki surowca. Surowce cukrowe (buraki cukrowe, trzcina cukrowa) zawierają w swoim składzie cukry proste i dzięki temu nie wymagają skomplikowanych czynności przygotowawczych przed fermentacją. Po rozdrobnieniu i ekstrakcji otrzymuje się cukier prosty potrzebny do syntezy etanolu. W przypadku bogatych w polisacharydy surowców skrobiowych (zboża, ziemniaki, kukurydza, ryż) do obróbki wstępnej dodatkowo stosuje się enzymy rozkładające wielocukry do cukrów prostych. Choć technologia produkcji biopaliw pierwszej generacji jest stosunkowo prosta, to wykorzystuje ona surowce konkurujące z żywnością, co w przeszłości doprowadziło do wzrostu cen produktów spożywczych, a w przyszłości może spowodować kryzys żywnościowy 1, 2). Alternatywą wydają się być paliwa drugiej generacji, do których produkcji stosowana jest biomasa bogata w lignocelulozę i/lub odpady z przemysłu, takie jak drewno (wierzba, topola, eukaliptus), trawa (proso rózgowate, miskant), trzcina, słoma, resztki drewna lub pulpa drzewna z przemysłu papierniczego, omłoty zbóż Mgr inż. Marta WILK w roku 2010 ukończyła studia na Wydziale Inżynieryjno-Ekonomicznym Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Obecnie jest asystentem w Katedrze Bioutylizacji Odpadów Rolno-Spożywczych w Instytucie Chemii i Technologii Żywności, Wydział Inżynieryjno-Ekonomiczny Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Specjalność technologia żywności i żywienia. Dr hab. inż. Małgorzata KRZYWONOS w roku 1997 ukończyła studia na Wydziale Inżynieryjno- -Ekonomicznym Akademii Ekonomicznej im. Oskara Langego we Wrocławiu. Obecnie jest profesorem nadzwyczajnym w Katedrze Inżynierii Bioprocesowej w Instytucie Chemii i Technologii Żywności na Wydziale Inżynieryjno- Ekonomicznym Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu. Specjalność technologia żywności i żywienia. * Autor do korespondencji: Katedra Inżynierii Bioprocesowej, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Wydział Inżynieryjno-Ekonomiczny, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, ul. Komandorska 118/120, 53-345 Wrocław, tel.: (71) 368-08-72, fax: (71) 368-07-53, e-mail: malgorzata.krzywonos@ue.wroc.pl 94/4(2015) 599

czy kaczany kukurydzy 3 5). Szacuje się, że z 1 t suchej słomy kukurydzianej, ryżowej lub wytłoków trzciny cukrowej można otrzymać odpowiednio 428, 416 i 422 L bioetanolu 6). Celem pracy było przedstawienie na podstawie studiów literaturowych dotychczasowych metod przetwarzania materiałów lignocelulozowych w procesie produkcji etanolu drugiej generacji. Charakterystyka surowców lignocelulozowych Błony komórkowe biomasy składają się głównie z polimerów, takich jak celuloza, hemiceluloza i lignina. Właściwości tych polimerów utrudniają i komplikują obróbkę wstępną surowca. Silne wewnątrz- i międzycząsteczkowe wiązania wodorowe utrudniają hydrolizę enzymatyczną celulozy krystalicznej 7). Celuloza to polimer składający się z podjednostek D-glukozy połączonych wiązaniami β-(1-4)glikozydowymi. Hemicelulozy są grupą polimerów z krótkimi łańcuchami bocznymi zbudowanymi z monocukrów. Pełnią one funkcję łącznika włókien celulozy i ligniny, przez co zapewniają spójność kompleksowi celuloza-hemiceluloza-lignina 8, 9). Najczęściej występującymi hemicelulozami są ksylany, co świadczy o znacznej zmienności strukturalnej hemiceluloz 10). Lignina jest amorficznym heteropolimerem złożonym z układu trzech różnych alkoholi fenylopropanowych: p-kumarylowego, koniferylowego i sinapylowego i zawiera najwięcej związków aromatycznych. Uważana jest często za polimer najbardziej oporny na degradację biologiczną i chemiczną 11, 12). Zdania naukowców na temat wpływu ligniny na wydajność scukrzania biomasy są różne. W niektórych pracach naukowych sugeruje się, że zawartość ligniny i krystaliczność biomasy determinują stopień obróbki surowca 13) i że usunięcie ligniny poprawia wydajność uwalniania cukru z biomasy 14, 15), a w innych, że ważniejszym czynnikiem od delignifikacji jest wzrost dostępności celulozy 16). Struktura i zawartość celulozy, hemiceluloz i ligniny w biomasie jest różna w zależności od gatunku, tkanek i dojrzałości ścian komórkowych rośliny 17). Właściwości tych polimerów utrudniają i komplikują obróbkę wstępną surowca, a właściwe jego przygotowanie w znaczący sposób wpływa na efektywność procesu delignifikacji 18). Konwersja materiałów lignocelulozowych zależy od ich składu biochemicznego oraz organizacji i interakcji między składnikami, a ich heterogeniczna natura i zróżnicowany udział poszczególnych składników biomasy utrudniają dobór metody obróbki wstępnej dla wielu surowców jednocześnie. Etap ten jest ważny ze względu na duży wpływ, jaki wywiera na przebieg pozostałych czynności w produkcji bioetanolu, a także ogólną wydajność i koszt biopaliwa 19). Aby proces obróbki biomasy mógł znaleźć zastosowanie w skali przemysłowej, powinien charakteryzować się maksymalnym odzyskiem przy minimalnej degradacji składników, minimalnym nakładem kosztów kapitałowych i operacyjnych, zastosowaniem do różnych rodzajów biomasy oraz minimalną koniecznością dalszej obróbki surowca przed wytworzeniem produktu końcowego 20, 21). Metody konwersji Rozróżnia się fizyczne, chemiczne, fizykochemiczne i biologiczne metody konwersji biomasy, na którą wpływają m.in. takie czynniki, jak krystaliczność celulozy, struktura hemicelulozy, powierzchnia przestrzeni strukturalnej, wielkość porów oraz skład ligniny 11, 22). Do biologicznej obróbki wykorzystywane są grzyby białej, brązowej i miękkiej zgnilizny oraz bakterie, które mają zdolność modyfikowania składu chemicznego i/lub struktury biomasy lignocelulozowej. Generalnie brązowa zgnilizna atakuje celulozę z drobną modyfikacją ligniny, podczas gdy grzyby białej i miękkiej zgnilizny z powodzeniem degradują również składniki ligniny 23). Grzyby mają zdolność degradacji ligniny dzięki produkcji enzymów działających wg mechanizmów oksydacyjnych. Tego rodzaju enzymy to np. peroksydaza ligninowa, oksydazy polifenolowe, peroksydazy zależne od manganu i lakkaza 24). Rozkład celulozy i hemicelulozy zachodzi pod wpływem reakcji hydrolitycznych. Endo-(1,4)-β-glukanazy, celobiohydrolazy i β-glukozydazy to grupy enzymów, pod wpływem których synergicznego działania przebiega degradacja celulozy 25). Enzymy, takie jak endo-ksylanazy, endo-α-l-arabinazy, endo-mannazy, β-galaktozydazy i β-glukozydazy to produkty mikroorganizmów, które rozkładają hemicelulozę 26). Grzyby mogą być stosowane do obróbki m.in. biomasy drzewnej, słomy kukurydzianej, słomy pszennej lub prosa rózgowego 27 30). Zalety stosowania biologicznej metody degradacji materiałów lignocelulozowych to niskie zużycie energii i niski koszt procesu ze względu na brak konieczności zakupu środków chemicznych i specjalnej aparatury. Jednak wymóg przestrzegania odpowiednich warunków procesu, wykorzystanie dużej powierzchni oraz czas trwania obróbki wynoszący przeważnie 10 14 dni sprawiają, że metoda jest mało atrakcyjna dla przemysłu w kontekście zastosowania jej jako jedyny sposób obróbki wstępnej 31). Fizyczna obróbka biomasy to zazwyczaj jej mechaniczne rozdrobnienie poprzez ciosanie, krojenie i mielenie. Proces ten prowadzi do rozerwania ścian komórkowych roślin i dysocjacji tkanek: naskórka, miąższowych i naczyniowych 17), co powoduje zwiększenie powierzchni biomasy, a to przyspiesza przebieg reakcji, zmniejsza stopień polimeryzacji i krystalizacji celulozy 32). Wielkość uzyskanych na tym etapie cząstek biomasy wpływa na wymagania i charakterystykę dalszych etapów procesu. Techniki frakcjonowania surowca opracowywane są pod kątem izolacji głównych składników biomasy (celuloza, hemicelulozy, ligniny), co ułatwia ich przemysłową obróbkę 33). Wielostopniowa obróbka mechaniczna w połączeniu z obróbką chemiczną pozwala uzyskać np. rozkład słomy na włókna, cukry z hemicelulozy i oligomery ligniny 34). Inną metodą fizycznej obróbki materiałów lignocelulozowych jest ekstruzja, która polega na przetłoczeniu biomasy przez ekstruder. Projektując proces, optymalizuje się wilgotność i stopień rozdrobnienia surowca, prędkość obrotów ślimaka oraz temperaturę, co w efekcie pozwala na rozerwanie wiązań ligniny i ułatwia późniejszą obróbkę enzymatyczną, która w tym procesie nie jest inhibowana przez furfurale i hydroksymetylofurfural (HMF). Zaletą metody jest możliwość prowadzenia procesów ciągłych 35). Do obróbki chemicznej wykorzystuje się zasady (NaOH, Ca(OH) 2, KOH, hydrazynę, NH 3 ), kwasy (H 2, HCl, H 3 PO 4, kwasy organiczne), ozon, rozpuszczalniki organiczne i ciecze jonowe 19). Metoda ta została najlepiej przebadana i scharakteryzowana pod względem wymagań do zastosowania jej na skalę przemysłową. Do hydrolizy kwasowej węglowodanowych polimerów biomasy stosuje się kwasy zarówno stężone, jak i rozcieńczone. Zastosowanie tego procesu pozwala na zwiększenie rozpuszczalności hemicelulozy i ligniny, a w przypadku zastosowania stężonych kwasów możliwa jest też hydroliza celulozy. Proces obróbki stężonymi kwasami, inaczej niż w przypadku kwasów rozcieńczonych, nie wymaga zastosowania temperatur wyższych niż 160 C. Oprócz rozkładu polisacharydów może powstać więcej związków przeszkadzających w dalszej biochemicznej obróbce biomasy (furfural, HMF, fenole, aldehydy, związki alifatyczne) 36). Poza tym istnieje ryzyko korozji sprzętu i konieczność odzyskania kwasu w celu obniżenia kosztów procesu 37). Za tanią i efektywną metodę obróbki biomasy uważa się stosowanie kwasów rozcieńczonych. Podwyższona temperatura procesu i niskie stężenie kwasu mogą zapewnić szybkie i niemal 100-proc. usunięcie hemicelulozy. Poprzez naruszenie struktury ligniny wzrasta efektywność enzymatycznej hydrolizy celulozy 38, 39). Obróbka alkaliami prowadzi głównie do rozerwania wiązań estrowych i glikozydowych biomasy, co powoduje zmiany w strukturze ligniny, częściową dekrystalizację celulozy i częściowe rozpuszczenie hemicelulozy. Metoda ta ma głównie na celu delignifizację biomasy i jest mniej skuteczna w rozpuszczaniu celulozy i hemicelulozy, zarówno od procesów hydrotermalnych, jak i hydrolizy kwasowej. Zaletą obróbki alkaliami jest to, że celuloza zawarta w biomasie staje się bardziej dostępna dla enzymów 40). Prowadzenie procesu nie wymaga szczególnych warunków, ponieważ reakcja może zachodzić w temperaturze pokojowej, jednak z drugiej strony czas obróbki 600 94/4(2015)

94/4(2015) jest dłuższy w porównaniu z innymi metodami chemicznymi, może wynosić nawet kilka dni. Obróbka alkaliami nie powoduje tak dużej degradacji cukrów, jak obróbka kwasem, dlatego bardziej polecana jest w procesach produkcji etanolu z odpadów rolnych niż z drewna 41,42). Alkalia używane w tej metodzie to wodorotlenki sodu, potasu, wapnia (wapno) i amoniak. Jedną z najtańszych metod wstępnego przygotowania biomasy do dalszego procesu jest obróbka wapnem, które jest łatwo odzyskiwane za pomocą CO 2 43). Wydajność procesu można poprawić, stosując natlenianie lub napowietrzanie 44). Na zwiększenie reaktywności polisacharydów po obróbce zasadami wpływa nie tylko usuwanie ligniny, ale także acetylu i innych podstawników kwasu uronowego w hemicelulozie, które utrudniają enzymom dostęp do celulozy 44, 45). Znaczny wzrost skuteczności delignifikacji uzyskuje się, stosując ozonowanie jako jeden z etapów obróbki wstępnej biomasy. Podczas ozonowania w niewielkim stopniu zostają naruszone wiązania hemicelulozy, ale bez degradacji celulozy. Wysoki stopień delignifikacji wpływa na wydajność obróbki enzymatycznej i np. dla słomy pszennej wzrasta ona o ok. 60% w porównaniu z procesami, w których nie stosowano ozonowania 46). W metodzie tej wykorzystuje się ozon, który jest silnym utleniaczem, dzięki czemu delignifikacja zachodzi już w warunkach normalnego ciśnienia i w temperaturze pokojowej. Ozon ulega łatwemu rozkładowi, co nie prowadzi do zanieczyszczenia środowiska. Podczas ozonowania nie tworzą się związki inhibitujące działanie enzymów ani substancje toksyczne 23). Ozonowanie może znaleźć zastosowanie w produkcji bioetanolu z trawy, słomy lub drewna 47 49). Wadą metody jest jej wysoki koszt ze względu na duże zużycie ozonu podczas obróbki biomasy 23). Obiecującą metodą obróbki wstępnej materiałów lignocelulozowych jest ich rozkład z użyciem rozpuszczalników organicznych OP (organosolv pretreatment) w czystej postaci lub w formach uwodnionych (metanol, etanol, aceton, glikol etylenowy, glicerol, etery, fenole, ketony) 32, 50). Reakcję można przeprowadzać z użyciem katalizatorów w postaci kwasów nieorganicznych (HCl, H 2 ) lub kwasów organicznych (szczawiowy, acetylosalicylowy i salicylowy), które ułatwiają rozpuszczenie hemicelulozy i ekstrakcję ligniny 23). Obróbkę biomasy metodą OP przeprowadza się w wysokiej temperaturze (100 250 C). Kinetyka delignifikacji różni się w zależności od użytego rozpuszczalnika podczas obróbki wstępnej. W kinetyce delignifikacji drewna występują faza inicjacji, faza zasadnicza i faza resztkowa, podczas gdy w kinetyce delignifikacji trzciny cukrowej brak jest fazy inicjacji, co odzwierciedla stopień rozkładu ligniny w różnych surowcach 51). Dużą zaletą OP w porównaniu z innymi metodami obróbki biomasy jest odzysk relatywnie czystej ligniny jako produktu ubocznego 50, 52). Poza dużą czystością, lignina poddana OP jest wolna od siarki i ma małą masę cząsteczkową, więc może być wykorzystana jako paliwo zasilające zakład obróbki wstępnej biomasy, lub po dalszym oczyszczeniu i otrzymaniu ligniny wysokiej jakości może posłużyć jako zamiennik poliuretanów, poliizocyjanianów i żywic epoksydowych w produkcji biopolimerów 53). OP to jedyna wysoce efektywna fizykochemiczna metoda obróbki materiałów lignocelulozowych o wysokiej zawartości ligniny. Metodę tę można łączyć z innymi lub może stanowić jeden z etapów obróbki biomasy, dzięki czemu proces frakcjonowania biomasy jest bardzo efektywny 54). Po zakończeniu procesu rozpuszczalniki organiczne można łatwo odzyskać poprzez destylację, a następnie zawrócić do procesu, co pomaga zmniejszyć koszty obróbki biomasy 55). Dzięki temu, że metoda OP nie wymaga szczególnego rozdrobnienia surowca oszczędza się energię potrzebną na obróbkę mechaniczną 56). Z drugiej strony zakup rozpuszczalników organicznych i niektórych katalizatorów czyni proces kosztownym. Wadą metody OP jest problem z zastosowaniem dalszego mikrobiologicznego rozkładu biomasy po obróbce katalizowanej kwasem, ponieważ powstałe z monosacharydów furfural i 5-HMF hamują przebieg fermentacji. Ze względu na używane w procesie lotne ciecze organiczne poddawane wysokim temperaturom wymagane jest stosowanie zbiorników zamkniętych, a ich rozszczelnienie grozi pożarem, wybuchem, zanieczyszczeniem środowiska i utratą zdrowia 20). Pomimo tych trudności kanadyjska firma Lignol Energy Corporation opracowała proces obróbki wstępnej drewna i biomasy rolniczej z wykorzystaniem OP, a projekt czeka na komercjalizację 57). Francuska firma Compagnie Industrielle de la Materière Végétale opracowała proces z wykorzystaniem OP, w którym oprócz pulpy celulozowej otrzymuje się m.in. wysokiej czystości ligninę 58). Finlandzka firma Chempolis Ltd w Oulu wprowadza proces produkcji wysokiej jakości włókien z niezdrewniałych odpadów rolnych do wytwarzania papieru, tektury lub opakowań 59). Ciecze jonowe IL (ionic liquid) to stosunkowo nowe rozwiązanie w procesie fizykochemicznej obróbki biomasy. Mają one punkt topnienia poniżej 100 C, wysoką polarność, wysoką stabilność termiczną i znikome ciśnienie pary 60). Ich budowa, na którą składają się wyłącznie kationy i aniony, wpływa na właściwości fizykochemiczne rozpuszczalnika (lepkość, hydrofobowość, punkt topnienia, stabilność hydrolityczna) 61). IL nazywane są zielonymi rozpuszczalnikami, ponieważ nie tworzą ani toksycznych, ani wybuchowych gazów 62). Większość IL mających zastosowanie we frakcjonowaniu biomasy to sole imidazolowe. Badania dowodzą, że octan 1-etylo-3- metyloimidazolu (EMIM[Ac]), chlorek 1-allilo-3-metyloimidazolu (AMIM[Cl]) i chlorek 1-butylo-3-metyloimidazolu (BMIM[Cl]) mogą posłużyć jako efektywne, niederywatyzujące rozpuszczalniki celulozy w temp. poniżej 100 C 63 65), a spośród ponad 20 przetestowanych cieczy jonowych AMIM[Cl] okazał się doskonałym rozpuszczalnikiem zrębków drewna 63). Dodatek BMIM[Cl] powoduje, że początkowa szybkość hydrolizy enzymatycznej i wydajność procesu wstępnej obróbki celulozy wzrastają odpowiednio 50- i 2-krotnie w porównaniu z procesem, w którym nie zastosowano IL 66). Obserwowano również 2-krotny wzrost wydajności hydrolizy enzymatycznej trzciny cukrowej w procesie jej obróbki z dodatkiem N-tlenku 1,3-N-metylomorfoliny (NMMO) 67). Wzrost szybkości hydrolizy enzymatycznej celulozy w IL wiąże się ze wzrostem produkcji cukrów prostych, które mogą zostać przekonwertowane na paliwo. Ponadto proces degradacji biomasy z wykorzystaniem IL jest mniej energochłonny, prostszy do przeprowadzenia i bardziej przyjazny środowisku niż dotychczas poznane rozwiązania 68 70). Z drugiej strony wysoki koszt IL, brak danych toksykologicznych i podstawowej charakterystyki fizykochemicznej wielu rozpuszczalników utrudniają wprowadzenie tego rodzaju procesu na skalę przemysłową. Departament Energii USA zrealizował pionierski projekt, w którym z sukcesem zastosowano IL do obróbki biomasy na większą skalę 6). Aby proces był ekonomicznie opłacalny, należy zmniejszyć zużycie wody oraz opracować skuteczny system recyklingu IL 71). Podejmowano próby obniżenia kosztów pozyskania rozpuszczalnika 72), zastępując IL na bazie imidazolu cieczą pozyskaną z aldehydów aromatycznych ligniny i hemicelulozy, czyli produktów ubocznych z produkcji biopaliw. Uzyskane wyniki były zbliżone, choć reakcja z zastosowaniem EMIM[Ac] była nieznacznie wolniejsza. Wprowadzenie takiego rozwiązania na skalę przemysłową pozwoliłoby biorafineriom na całkowite wykorzystanie surowca roślinnego. Połączenie procesów fizycznych i chemicznych to metody: eksplozji pary, AFEX (ekstruzja z użyciem amoniaku), perkolacyjna z zamkniętym obiegiem amoniaku lub gorącej wody i obróbka z wykorzystaniem płynów nadkrytycznych 19, 73). Eksplozja pary (steam explosion) polega na działaniu na surowiec wysoką temperaturą (160 260 C) i ciśnieniem (0,69 4,83 MPa) przez krótki czas (kilka sekund lub minut), a następnie gwałtownym rozprężeniu do ciśnienia atmosferycznego, co powoduje rozerwanie wiązań polimerowych 19, 74 76). Wysoka temperatura zapewnia degradację hemicelulozy i transformację ligniny 77). Metoda eksplozji pary wymaga mniejszych nakładów energetycznych w porównaniu z obróbką mechaniczną, nie ma negatywnego wpływu na środowisko i nie generuje kosztów związanych z recyklingiem. Aby osiągnąć takie samo rozdrobnienie surowca metodą mechaniczną co podczas eksplozji pary, należałoby użyć 70% więcej energii 78). Obróbka parą pod ciśnieniem jest jedną z najbardziej opłacalnych metod delignifikacji twardego drewna lub odpadów rolnych, 601

a mniej drewna miękkiego. Do ograniczeń metody można zaliczyć częściową destrukcję frakcji ksylanu, niecałkowite rozerwanie wiązań węglowodanowych ligniny i generowanie związków hamujących działanie mikroorganizmów na dalszym etapie procesu. Aby zapewnić optymalne warunki fermentacji, inhibitory wymywa się, przepłukując biomasę wodą. W trakcie takiego zabiegu wraz ze związkami niechcianymi usuwa się rozpuszczalną w wodzie hemicelulozę, a co za tym idzie potrzebny do produkcji etanolu cukier prosty, który powstałby z rozkładu tego polimeru 79). W celu poprawy hydrolizy enzymatycznej, w metodzie eksplozji pary można zastosować katalizatory w postaci H 2, SO 2 lub CO 2. Pozwalają one na obniżenie temperatury i skrócenie czasu procesu, a ponadto blokują powstawanie niechcianych związków i zwiększają stopień hydrolizy hemicelulozy. Podczas obróbki parą hemiceluloza hydrolizuje do kwasu, który pełni funkcję katalizatora w dalszej hydrolizie oligomerów rozpuszczalnej hemicelulozy 80). Obniżenie nakładów energetycznych w procesie eksplozji pary może zapewnić zastosowanie metody dwustopniowej eksplozji pary, która prowadzi do oddzielenia hemiceluloz, a w kolejnym etapie do rozerwania węglowodanowych wiązań celulozy 32). Gdy do obróbki zamiast pary zastosuje się gorącą wodę LHW (liquid hot water), koszty procesu będą niższe ze względu na cenę rozpuszczalnika i rodzaj reaktora, w którym nie będzie dochodziło do tak gwałtownych rozprężeń pary, więc wymagania konstrukcyjne i technologiczne będą niższe 43). Proces LHW nie wymaga użycia wysokich temperatur. Hydroliza enzymatyczna po obróbce drewna topoli już w 180 C jest 1,72 razy skuteczniejsza niż w przypadku drewna nie potraktowanego LHW 81). Aby uniknąć formowania inhibitorów, należy przeprowadzać proces w zakresie ph 4 7, ponieważ cukry hemicelulozy w tych warunkach zachowują swą oligomeryczną budowę 82). Dzięki zastosowaniu wody i niskich temperatur procesu nie tworzą się produkty degradacji i nie jest konieczne ani usuwanie, ani neutralizowanie rozpuszczalnika. Podejmuje się próby udoskonalenia obróbki LHW pod kątem zwiększenia dostępności celulozy z zachowaniem wszystkich zalet metody. Potencjalną zieloną technologią ekstrakcji hemicelulozy jest wprowadzenie do LHW ditlenku węgla pod ciśnieniem 83). Czynnikami ograniczającymi zastosowanie obróbki LHW na skalę przemysłową są duże zapotrzebowania procesu na wodę i energię 84). LHW może być używana zarówno do obróbki roślin zielnych oraz odpadów rolnych, jak i twardego drewna 85). Zbliżoną metodą do LHW jest metoda perkolacyjna ARP z zamkniętym obiegiem wody amoniakalnej (ammonia recycle percolation), która przepływa z prędkością ok. 5 cm 3 /min przez reaktor ze złożem nieruchomym w wysokiej temperaturze (140 210 C) przez 90 min. W tej metodzie używana jest woda amoniakalna o stężeniu 5 15% mas., która po przepłynięciu przez reaktor jest zawracana lub odzyskiwana. Proces ARP jest wysoce efektywny pod względem usuwania ligniny z biomasy. Jednocześnie zachodzi hydroliza hemicelulozy ze spadkiem krystalizacji celulozy 86 88). W metodzie AFEX (ammonia fiber explosion) biomasa poddawana jest działaniu ciekłego bezwodnego amoniaku w warunkach wysokich ciśnienia i temperatury przez określony czas, po którym podobnie jak w metodzie eksplozji pary ciśnienie jest gwałtownie rozprężane, co powoduje puchnięcie i rozerwanie włókien rośliny i częściową dekrystalizację celulozy. Typowa dawka ciekłego amoniaku dla tego procesu to 1 2 kg na kg suchej biomasy. Zwykle proces prowadzi się w temp. 60 90 C przez 10 60 min i pod ciśnieniem ok. 3 MPa 89, 90). W optymalnych warunkach można osiągnąć tą metodą ponad 90-proc. konwersję celulozy i hemicelulozy do cukrów podatnych na fermentację. Obróbka wstępna AFEX znacząco poprawia stopień scukrzenia roślin zielnych i traw, takich jak proso, słoma kukurydziana, słoma ryżowa lub bambus 91 94). Wynik takiej obróbki to dekrystalizacja celulozy, częściowa depolimeryzacja hemicelulozy, usunięcie grup acetylowych, głównie hemicelulozowych, rozkład kompleksu lignino-węglowodanowego, rozkład wiązań C O C ligniny, zwiększenie dostępności powierzchni biomasy do dalszej obróbki oraz umożliwienie lepszej zwilżalności surowca 95, 96). Rozpuszczeniu ulega tylko niewielka ilość stałej masy, a stopień usunięcia hemicelulozy i ligniny jest niewielki, ale w porównaniu z innymi metodami przy obróbce enzymatycznej wystarczy mała dawka enzymów, aby osiągnąć bardzo dobre wyniki 97, 98). Podczas gdy produktem innych obróbek wstępnych, np. eksplozji pary, jest szlam, który można rozdzielić na frakcje stałą i ciekłą, to w obróbce AFEX otrzymuje się tylko produkt stały 84). Proces ten charakteryzuje się małą wilgotnością, możliwością odzyskania użytego odczynnika i zastosowania go po raz kolejny, a dzięki relatywnie niskiej temperaturze procesu i ph < 12 powstaje mniej produktów degradacji cukru i inhibitorów fermentacji. Odzysk amoniaku jest konieczny ze względu na obniżenie kosztów oraz ochronę środowiska. Z drugiej strony cena amoniaku, koszty i złożoność procesu jego odzysku mogą być na tyle duże, że cała obróbka wstępna AFEX stanie się nieopłacalna z punktu widzenia przedsiębiorcy 43, 99 101). Poza tym metoda ta jest mało efektywna w obróbce materiałów o dużej zawartości ligniny, takich jak drewno i łupiny orzechów 89). Metoda AFEX może być również stosowana do wstępnej obróbki słomy prosa, z którego w późniejszym etapie procesu będzie ekstrahowane białko 102), a integracja tego procesu z odzyskiem cukru do produkcji etanolu może wpłynąć na obniżenie ceny tego biopaliwa 84). Zarówno po obróbce AFEX, jak i ARP nie trzeba dostosowywać warunków procesu do przeprowadzenia fermentacji, ponieważ metody są kompatybilne ze stosowanymi mikroorganizmami. Przed przystąpieniem do hydrolizy enzymatycznej stosuje się również moczenie surowca w roztworze amoniaku i wody SAA (soaking in aqueous ammonia). Proces optymalizowany jest pod względem stężenia amoniaku, temperatury i czasu, który może wynosić nawet kilkanaście tygodni 103, 104). Wzrost rozpuszczalności materiału lignocelulozowego uzyskuje się również poprzez zastosowanie cieczy lub gazów w ich nadkrytycznych warunkach SCP (supercritical fluid pretreatment). Takie reagenty mają większą dyfuzyjność, ponieważ ciecz nadkrytyczna to substancja w formie gazowej, która została sprężona w temperaturze powyżej swego punktu krytycznego, dzięki czemu ma gęstość cieczy i swobodę przemieszczania cząsteczek jak gaz. Gęstość substancji nadkrytycznych można regulować poprzez zmianę ciśnienia i temperatury procesu. Najczęściej w metodzie tej używane są H 2 O, amoniak lub CO 2, których cząsteczki mają podobną wielkość i w podobny sposób mogą penetrować pory lignocelulozy 96). W procesie obróbki wstępnej nadkrytyczną wodą oprócz etanolu w osobnym zbiorniku mogą być odbierane pochodne ligniny, które mogą być wykorzystane jako chemiczna alternatywa surowców kopalnych 105). Zastosowanie nadkrytycznego ditlenku węgla jest bardzo korzystne, ponieważ jest on niepalny, nietoksyczny, niedrogi i łatwo dostępny, jednak wprowadzenie tej metody na skalę przemysłową jest utrudnione ze względu na wysokie koszty utrzymania odpowiednich warunków procesu (ciśnienie ok. 20 MPa) 43, 106). Skala pilotażowa i przemysłowa produkcji etanolu lignocelulozowego Już w 2007 r. w York, Nebraska, firma Abengoa Bioenergy uruchomiła pilotażowy zakład produkujący 75,7 tys. L/r etanolu ze słomy pszennej i kukurydzianej, a w październiku 2014 r. rozpoczęła pracę biorafineria w Hugoton (Kansas), której produkcja ma wynosić ok. 95 mln L/r, mająca wykorzystywać do obróbki wstępnej eksplozję pary w połączeniu z wcześniejszą impregnacją kwasem, a kończąca się neutralizacją 107, 108). Departament Energii USA sfinansował budowę dwóch biorafinerii produkujących bioetanol drugiej generacji. Partnerstwo firm INEOS Bio i New Planet Energy zaowocowało uruchomieniem w 2013 r. centrum produkcji etanolu i energii odnawialnej na skalę przemysłową zlokalizowanego w hrabstwie Indian River na Florydzie. Bioetanol produkowany jest z drewna i odpadów wegetatywnych, które poddawane są obróbce termochemicznej. Planowana produkcja etanolu to 602 94/4(2015)

30 mln L/r 109). We wrześniu 2014 r. rozpoczęła działalność pierwsza w USA biorafineria na skalę komercyjną. Spółka Royal DSM i POET LLC uruchomiły produkcję bioetanolu z odpadów kukurydzianych w Emmetsburgu w stanie Iowa. Produkcja biopaliwa początkowo będzie wynosić ok. 76 mln L/r, a w przyszłości ma wzrosnąć o 20 mln L/r 110). Odpady kukurydziane będą również wykorzystywane w Nevadzie (Iowa), gdzie firma DuPont buduje swoją rafinerię opartą na obróbce surowca strumieniem pary amoniaku. Zakład ma zasilać kraj 113,6 mln L bioetanolu rocznie 111). W Fulton, Mississippi, firma BlueFire realizuje projekt budowy rafinerii, która będzie wytwarzać niemal 72 mln L etanolu celulozowego w ciągu roku. Do produkcji będą wykorzystywane odpady drzewne i komunalne, a do obróbki wstępnej firma zastosuje stężony kwas 112). W Brazylii prowadzone są badania na temat zastosowania wytłoków i słomy trzciny cukrowej do produkcji etanolu i wykorzystania produktów ubocznych z procesu. W ramach projektu Proethanol 2G powstało opracowanie na temat wytycznych co do metody zintegrowanej produkcji bioetanolu, bioenergii i żywności ze słomy i wytłoków 113). Raizen Group i Iogen Corporation w listopadzie 2013 r. rozpoczęły budowę komercyjnej biorafinerii w Piracicaba, São Paulo. Etanol produkowany będzie z wytłoków i słomy trzciny cukrowej, a zdolność produkcyjna ma wynieść 40 mln L/r. Zgodnie z technologią Iogen, do obróbki biomasy zostanie użyta zmodyfikowana metoda eksplozji pary 114). We wrześniu 2014 r. firma GranBio otworzyła pierwszą rafinerię etanolu celulozowego na skalę komercyjną na południowej półkuli. Zakład powstał w São Miguel dos Campos, Alagoas, surowcem w procesie są wytłoki i słoma trzciny cukrowej. Początkowa zdolność produkcyjna to 82 mln L/r. Obróbka wstępna opiera się na technologii PROESA TM, która wykorzystuje proces eksplozji 115). Już w 2004 r. w Örnsköldsvik w Szwecji rozpoczęła pracę pilotażowa instalacja przerabiająca wióry sosnowe na etanol, stosując dwustopniową obróbkę wstępną rozcieńczonym H 2 oraz SO 2 116). Duńska firma BioGasol opracowała technologie produkcji biopaliw, a podczas obróbki wstępnej metodą kwasowej eksplozji pary w zaprojektowanym przez firmę reaktorze jest uwalnianych o 37% więcej cukrów C5 niż wynosi średnia oczekiwań branży 117). Obróbkę stężonym kwasem zastosowała norweska firma Weyland AS, która testowała swoją technologię w latach 2010 2012 i rekomenduje ją do zastosowania na skalę przemysłową 118). W 2013 r. w Crescentino we Włoszech powstała pierwsza na świecie przemysłowa instalacja o wydajności 75 mln L/r bioetanolu ze słomy pszennej i ryżowej oraz ziół Arundo Donax. Instalacja jest przystosowana do obróbki różnego rodzaju surowców (rośliny energetyczne, odpady rolne, biomasa drzewna, wytłoczyny z trzciny cukrowej, a stosowana metoda obróbki wstępnej opiera się wyłącznie na użyciu wody i pary (technologia PROESA TM ) 119, 120). W czerwcu 2014 r. firma Inbicon ogłosiła zakończenie trwającej nieprzerwanie 15 tys. h pracy testowej instalacji produkcji bioetanolu ze słomy pszennej w Kalundborg (Dania). Firma sprzedaje licencję na produkcję bioetanolu z pozostałości ze zbiorów ziarna lub trzciny cukrowej, np. z łodyg kukurydzy, różnego rodzaju trawy i słomy oraz wytłoków trzciny cukrowej. Do obróbki wstępnej nie używa się środków chemicznych, a wyłącznie parę 121). Również w Polsce opracowuje się instalację biorafinerii lignocelulozowej z uwzględnieniem logistyki zaopatrzenia w biomasę, logistyki produkcji biopaliw oraz logistyki odzysku i wykorzystania pozostałości po procesach konwersji. Docelowo biorafineria produkowałaby ok. 500 L etanolu dziennie, na co potrzeba ok. 2,5 t suchej masy biomasy lignocelulozowej 122). Podsumowanie Na podstawie pierwszych dostępnych w literaturze wyników badań można przypuszczać, że w Polsce obok rafinerii produkujących biodiesel powstaną instalacje wytwarzające etanol drugiej generacji. W światowych technologiach obróbki wstępnej raczej 94/4(2015) odchodzi się od stosowania substancji chemicznych, przeważają metody z wykorzystaniem wody i pary wodnej, co jest ekonomicznie bardziej opłacalne i przyjazne środowisku. Inżynierowie prześcigają się w opracowywaniu technologii zużywających mniej wody, które generują mniej produktów ubocznych, a jeżeli już takie powstają, to powinny być przydatne człowiekowi i w pełni zagospodarowane. Otrzymano: 14-01-2015 LITERATURA 1. J. Baines, New Pol. Econ. 2014, 19, 79. 2. M. Krzywonos, P.F. Borowski, A. Kupczyk, M. Zabochnicka-Świątek, Przem. Chem. 2014, 93, 1124. 3. Z. Chłopek, J. Lasocki, Eksploatacja i Niezawodność Maintenance and Reliability 2013, 15, 44. 4. L.F. Boaretto, P. Mazzafera, Ann. Appl. Biol. 2013, 163, 12. 5. A.P. de Souza, D.C.C. Leite, S. Pattathil, M.G. Hahn, M.S. Buckeridge, Bioenerg. Res. 2013, 6, 564. 6. http://www.afdc.energy.gov, dostęp 19 listopada 2014 r. 7. L. Viikari, J. Vehmaanperä, A. Koivula, Biomass Bioenerg. 2012, 46, 13. 8. S.C. Fry, Annu. Rev. Plant Physiol. 1986, 37, 165. 9. L. Salmen, A.M. Ollson, J. Pulp Pap. Sci. 1998, 24, 99. 10. A. Ebringerová, T. Heinze, Macromol. Rapid Commun. 2000, 21, 542. 11. D.E. Akin, Biofuels Bioprod. Biorefin. 2008, 2, 288. 12. A.T.W.M. Hendriks, G. Zeeman, Bioresour. Technol. 2009, 100, 10. 13. L. Zhu, J.P. O Dwyer, V.S. Chang, C.B. Granda, M.T. Holtzapple, Bioresour. Technol. 2008, 99, 3817. 14. V.S. Chang, M.T. Holtzapple, Appl. Biochem. Biotechnol. 2000, 84-86, 5. 15. B. Yang, C.E. Wyman, Biofuels Bioprod. Biorefin. 2008, 2, 26. 16. J.A. Rollin, Z. Zhu, N. Sathitsuksanoh, Y.H.P. Zhang, Biotechnol. Bioenerg. 2010, 108, 22. 17. A. Barakat, H. de Vries, X. Rouau, Bioresour. Technol. 2013, 134, 362. 18. Ł. Jęczmionek, S. Oleksiak, I. Skręt, A. Marchut, Przem. Chem. 2006, 85, 1570. 19. I. de Costa Sousa, S.P. Chundawat, V. Balan, B.E. Dale, Curr. Opin. Biotechnol. 2009, 20, 339. 20. V.B. Agbor, N. Cicek, R. Sparling, A. Berlin, D.B. Levin, Biotech. Adv. 2011, 29, 675. 21. B.A. Saville, Plant biomass conversion, John Wiley & Sons Inc., New York 2011. 22. F. Monlau, A. Barakat, E. Trably, C. Durnas, J.-P.h. Steyer, H. Carrère, Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 2012, 43, 1. 23. Y. Sun, J. Cheng, Bioresour. Technol. 2002, 83, 1. 24. C. Wan, Y. Li, Biotech. Adv. 2012, 30, 1447. 25. P. Baldrian, V. Valaskova, FEMS Microbiol. Rev. 2008, 32, 501. 26. D. Shallom, Y. Shoham, Curr. Opin. Microbiol. 2003, 6, 219. 27. W. Wang, T. Yuan, K. Wang, B. Cui, Y. Dai, Process Biochem. 2012, 107, 282. 28. M.J. Ray, D.J. Leak, P.D. Spanu, R.J. Murphy, Biomass Bioenerg. 2010, 34, 1257. 29. J. Zeng, D. Singh, S. Chen, Bioresour. Technol. 2011, 102, 3206. 30. C. Wan, Y. Li, Bioresour. Technol. 2011, 102, 7507. 31. L. Magnusson, R. Islam, R. Sparling, D. Levin, N. Cicek, Int. J. Hydrogen. Energy 2008, 33, 5398. 32. J. Kudakasseril Kurian, G. Raveendran Nair, A. Hussain, G.S. Vijaya Raghavan, Renew. Sust. Energ. Rev. 2013, 25, 205. 33. W.E. Mabee, P.N. McFarlane, J.N. Saddler, Biomass Bioenerg. 2011, 35, 4519. 34. M.G. Papatheofanous, E. Billa, D.P. Koullas, B. Monties, E.G. Koukios, Ind. Crops Prod. 1998, 7, 249. 35. C. Karunanithy, K. Muthukumarappan, Biochem. Eng. J. 2011, 54, 71. 36. D.J. Hayes, Catal. Today 2009, 145, 138. 37. V. Chaturvedi, P. Verma, 3 Biotech 2013, 3, 415. 38. C.E Wyman, Handbook on bioethanol. Production and utilization, Taylor & Francis, Washington 1996. 39. B. Yang, C.E. Wyman, Biotechnol. Bioeng. 2004, 86, 88. 40. F. Carvalheiro, L.C. Duarte, F.M. Girio, J. Sci. Ind. Res. 2008, 67, 849. 41. R. Kumar, C.E. Wyman, Biotechnol. Prog. 2009, 25, 302. 42. R. Sharma, V. Palled, R.R. Sharma-Shivappa, J. Osborne, Appl. Biochem. Biotechnol. 2012, 169, 761. 43. G. Brodeur, E. Yau, K. Badal, J. Collier, K.B. Ramachandran, S. Ramakrishnan, Enzyme Res. 2011, 2011, 1 44. S. Kim, M.T. Holtzapple, Bioresour. Technol. 2006, 97, 583. 45. B. Du, L.N. Sharma, C. Becker, S.-F. Chen, R.A. Mowery, G.P. van Walsum, C.K. Chambliss, Biotechnol. Bioeng. 2010, 107, 430. 46. M.T. García-Cubero, G. González-Benito, I. Indacoechea, M. Coca, S. Bolado, Bioresour. Technol. 2009, 100, 1608. 47. A. Panneerselvam, R.R. Sharma-Shivappa, P. Kolar, T. Ranney, S. Peretti, Bioresour. Technol. 2013, 148, 242. 48. R. da Rocha Olivieri de Barros, R. de Sousa Paredes, T. Endo, E.P. da Silva Bon, S.-H. Lee, Bioresour. Technol. 2013, 136, 288. 49. N.A. Mamleeva, S.A. Autlov, N.G. Bazarnova, V.V. Lunin, Pure Appl. Chem. 2009, 81, 2081. 603

50. X. Zhao, K. Cheng, D. Liu, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009, 82, 815. 51. R.W. Thring, E. Chornet, R. Overend, Biomass 1990, 23, 289. 52. P. Manara, A. Zabaniotou, C. Vanderghem, A. Richel, Catal. Today 2014, 223, 25. 53. Y.-H.P. Zhang, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008, 35, 367. 54. M.G. Papatheofanous, E. Billa, D.P. Koullas, B. Monties, E.G. Koukios, Ind. Crops Prod. 1998, 7, 249. 55. J.Y. Zhu, X.J. Pan, Bioresour. Technol. 2010, 101, 4992. 56. J.Y. Zhu, G.S. Wang, X.J. Pan, R. Gleisner, Chem. Eng. Sci. 2009, 64, 474. 57. http://www.lignol.ca, dostęp 6 listopada 2014 r. 58. http://www.cimv.fr, dostęp 6 listopada 2014 r. 59. http://www.chempolis.com, dostęp 6 listopada 2014 r. 60. P. Wasserscheid, W. Keim, Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 37773. 61. J.G. Huddleston, A.E. Visser, W.M. Reichert, H.D. Willauer, G.A. Broker, R.D. Rogers, Green Chem. 2001, 3, 156. 62. J.L. Anderson, J. Ding, T. Welton, D.W. Armstrong, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14247. 63. M. Zavrel, D. Bross, M. Funke, J. Büchs, A.C. Spiess, Bioresour. Technol. 2009, 100, 2580. 64. Y-H.P. Zhang, L.R. Lynd, Biotechnol. Bioeng. 2006, 94, 888. 65. S.D. Zhu, Y.X. Wu, Q.M. Chen, N. Yu, C.W. Wang, S.W. Jin, Green Chem. 2006, 8, 325. 66. A.P. Dadi, C.A. Schall, S. Varanasi, Biotechnol. Bioeng. 2006, 95, 904. 67. C.H. Kuo, C.K. Lee, Bioresour. Technol. 2009, 100, 866. 68. H. Zao, L.J. Cecil, A.B. Gary, Q.X. Shu, O. Olarongbe, N.P. Vernecia, J. Biotechnol. 2009, 139, 47. 69. Y.Q. Pu, N. Jiang, A.J. Ragauskas, J. Wood Chem. Technol. 2007, 27, 23. 70. R.D. Rogers, K.R. Seddon, Science 2003, 302, 792. 71. C. Li, D. Tanjore, W. He, J. Wong, J.L. Gardner, K.L. Sale, B.A. Simmons, S. Singh, Biotechnol. Biofuels 2013, 6, 154. 72. A.A. Socha, R. Parthasarathi, J. Shi, S. Pattathil, D. Whyte, M. Bergeron, A. George, K. Tran, V. Stavila, S. Venkatachalam, M.G. Hahn, B.A. Simmons, S. Singh, PNAS 2014, 111, 3587. 73. B. Bals, C. Rogers, M. Jin, V. Balan, B. Dale, Biotechnol. Biofuels 2010, 3, 1. 74. E. Varga, K. Reczey, G. Zacchi, Appl. Biochem. Biotechnol. 2004, 113, 509. 75. E. Ruiz, C. Cara, M. Ballesteros, P. Manzanares, I. Ballesteros, E. Castro, Appl. Biochem. Biotechnol. 2006, 129, 631. 76. A. Kurabi, A. Berlin, N. Gilkes, D. Kilburn, R. Bura, J. Robinson i in., Appl. Biochem. Biotechnol. 2005, 121, 219. 77. J.D. Wright, Chem. Eng. Prog. 1998, 84, 62. 78. M.T. Holtzapple, A.E. Humphrey, J.D. Taylor, Biotechnol. Bioeng. 1989, 33, 207. 79. M.E. Himmel, J.O. Baker, R.P. Overend, Enzymatic conversion of biomass for fuels production, American Chemical Society, Washington 1994. 80. A.T.W.M. Hendriks, G. Zeeman, Bioresour. Technol. 2009, 100, 10. 81. W. Wang, T. Yuan, K. Wang, B. Cui, Y. Dai, Process Biochem. 2012, 47, 2552. 82. N. Mosier, R. Hendrickson, N. Ho, M. Sedlak, M.R. Ladisch, Bioresour. Technol. 2005, 96, 1986. 83. L.V.A. Gurgel, M.T.B. Pimenta, A.A. da Silva Curvelo, Ind. Crops Prod. 2014, 57, 141. 84. P. Alvira, E. Tomás-Pejό, M. Ballesteros, M.J. Negro, Bioresour. Technol. 2010, 101, 4851. 85. T.H. Kim, Y.Y. Lee, Appl. Biochem. Biotechnol. 2005, 96, 2007. 86. Z. Wu, Y.Y. Lee, Appl. Biochem. Biotechnol. 1997, 63-65, 21. 87. J.S. Kim, H. Kim, J.S. Lee, J.P. Lee, S.C. Park, Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 148, 15. 88. J. Xu, J.J. Cheng, R.R. Sharma-Shivappa, J.C. Burns, Bioresour. Technol. 2010, 101, 2900. 89. Y. Zheng, Z. Pan, R. Zhang, Int. J. Agric. Biol. Eng. 2009, 2, 51. 90. H. Alizadeh, F. Teymouri, T.I. Gilbert, B.E. Dale, Appl. Biochem. Biotechnol. 2005, 121-124, 1133. 91. L. Tao i in., Bioresour. Technol. 2011, 102, 11105. 92. C. Li, G. Cheng, V. Balan, M.S. Kent, M. Ong, S.P.S. Chundawat, L. da Costa Sousa, Y.B. Melnichenko, B.E. Dale, B.A. Simmons, S. Singh, Bioresour. Technol. 2011, 102, 6928. 93. S. Harun, V. Balan, M.S. Takriff, O. Hassan, J. Jahim, B.E. Dale, Biotechnol. Biofuels 2013, 6, 40. 94. Q. Shao, C. Cheng, R.G. Ong, L. Zhu, C. Zhao, Bioresour. Technol. 2013, 142, 26. 95. L.E. Gollapalli, B.E. Dale, D.M. Rivers, Appl. Biochem. Biotechnol. 2002, 100, 23. 96. P. Kumar, D.M. Barrett, M.J. Delwiche, P. Stroeve, Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 48, 37. 97. C.E. Wyman, B.E. Dale, R.T. Elander, M. Holtzapple, M.R. Ladisch, Y.Y. Lee, Bioresour. Technol. 2005, 96, 1959. 98. C.E. Wyman, B.E. Dale, R.T. Elander, M. Holtzapple, M.R. Ladisch, Y.Y. Lee, Bioresour. Technol. 2005, 96, 2026. 99. T. Eggeman, R.T. Elander, Bioresour. Technol. 2005, 96, 1. 100. N. Mosier, C.E. Wyman, B.D. Dale, R.T. Elander, Y.Y. Lee, M. Holtzapple, C.M. Ladisch, Bioresour. Technol. 2005, 96, 673. 101. E.Y. Vlasenko, H. Ding, J.M. Labavitch, S.P. Shoemaker, Bioresour. Technol. 1997, 59, 109. 102. B. Bals, L. Teachworth, B. Dale, V. Balan, Appl. Biochem. Biotechnol. 2007, 143, 187. 103. T.H. Kim, F. Taylor, K.B. Hicks, Bioresour. Technol. 2008, 99, 5694. 104. T.H. Kim, Y.Y. Lee, Appl. Biochem. Biotechnol. 2007, 137-140, 81. 105. S. Saka, K. Ehara, S. Sakaguchi, K. Yoshida, The 2nd Joint Intern. Conf. Sustainable Energy and Environment (SEE 2006), Bangkok, 1 23 listopada 2006 r. 106. P. Muzafera, P. Mateja, H. Maja, N. Zoran, K. Zeljko, J. Supercrit. Fluids 2007, 43, 74. 107. http://www.biofuelsjournal.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 108. http://www.kcc.state.ks.us, dostęp 18 listopada 2014 r. 109. http://www.ineos.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 110. http://poetdsm.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 111. http://biofuels.dupont.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 112. http://bfreinc.com, dostęp 20 listopada 2014 r. 113. http://proethanol2g.org, dostęp 20 listopada 2014 r. 114. http://www.iogen.ca, dostęp 20 listopada 2014 r. 115. http://www.granbio.com.br, dostęp 22 listopada 2014 r. 116. http://www.sekab.com, dostęp 22 listopada 2014 r. 117. http://www.biogasol.com, dostęp 22 listopada 2014 r. 118. http://weyland.no, dostęp 23 listopada 2014 r. 119. http://www.biolyfe.eu, dostęp 18 listopada 2014 r. 120. http://www.ascension-publishing.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 121. http://www.inbicon.com, dostęp 18 listopada 2014 r. 122. http://www.imp.gda.pl, dostęp 19 listopada 2014 r. 604 94/4(2015)