Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 6. Łukasz Berlicki

Metody chromatograficzne w chemii i biotechnologii, wykład 6 Łukasz Berlicki

Techniki elektromigracyjne Elektroforeza technika analityczna polegająca na rozdzielaniu mieszanin związków przez wymuszenie wędrówki w polu elektrycznym. A (+) K (-)

Techniki elektromigracyjne Typy elektroforezy: planarna (żelowa) kapilarna

Techniki elektromigracyjne Podstawowe wymagania: Medium przewodzące (bufor) Pole elektryczne Podstawowa zasada: dodatnio naładowane cząsteczki przemieszczają się w kierunku katody (-) Ujemnie naładowane cząsteczki do anody (+) Dwa typy: Roztwór w kapilarze Matryca nieprzewodząca (agaroza, poliakrylamid)

Techniki elektroforezy kapilarnej: Kapilarna elektroforeza strefowa Żelowa elektroforeza kapilarna Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne Izotachoforeza kapilarna Micelarna chromatografia elektrokinetyczna Elektrochromatografia kapilarna

Zalety: Szerokie zastosowanie Wysoka szybkość i sprawność rozdziału Stosowanie bardzo małych próbek (kilka nl) Niewielkie zużycie odczynników Trwałe kapilary Bez użycia pomp, przy niskim ciśnieniu i temperaturze pokojowej Wady: Gorsza wykrywalność substancji w porównaniu do HPLC (10-100 razy).

kapilara detektor anoda katoda próbka + + - bufor bufor Zasilanie 3 20 kv

Kapilary Długość 20-100 cm Średnica wewnętrzna 20 200 mm Wykonane z kwarcu Z zewnątrz pokryte poliimidem Na kapilarach o większych średnicach może wydzielać się ciepło Kapilary mogą być wypełnione żelem (Żelowa elektroforeza kapilarna)

Prędkość przepływu jest proporcjonalna do ładunku i odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki.

Siły powinny się równoważyć

Siły powinny się równoważyć F = q * E F = 6Phrv q ładunek E natężenie pola elektrycznego h lepkość r średnica cząsteczki v ep prędkość elektroforetyczna

Prędkość elektroforetyczna v ep = q E 6π η r q ładunek E natężenie pola elektrycznego h lepkość r średnica cząsteczki v ep prędkość elektroforetyczna

Ruchliwość elektroforetyczna μ ep = v ep E = q ładunek E natężenie pola elektrycznego h lepkość r średnica cząsteczki v ep prędkość elektroforetyczna m ep ruchliwość elektroforetyczna q 6π η r

Przepływ elektroosmotyczny (EOF) Jest to migracja buforu w kierunku katody Jest spowodowany tworzeniem się dwuwarstwy na ścianie kapilary Grupy silanolowe są zdeprotonowane w ph > 4

Przepływ elektroosmotczny (EOF) Kapilarę przemywa się roztworem NaOH przed użytkowaniem.

Przepływ elektroosmotczny (EOF) Kationy dwuwarstwy po przyłożeniu pola elektrycznego są przyciągana do katody (-) i ciągną rozpuszczalnik razem z nimi. EOF jest proporcjonalny do natężenia pola elektrycznego, EOF jest praktycznie jednakowy w całym przekroju kapilary (małe rozmycie pików), Często EOF nie jest powtarzalny, EOF w elektroforezie żelowej jest bliski zeru.

EOF może być większy niż przepływ elektroforetyczny i wszystkie anality kierują się w stronę katody (-) Kolejność: kationy, neutralne, aniony. Otrzymujemy elektroforegram.

Kontrola EOF: Zmiana ph (niskie ph, niski EOF) Powlekanie ścian kapilary Glikol etylenowy dodawany do buforu Warstwa polimerowa pokrywająca wnętrze kapilary Reakcja z trimetylochlorosilanem (niski EOF) Reakcja z pochodnymi sulfonowymi - większy EOF

Przepływ elektroosmotczny (EOF) Efektywność rozdziału i rozdzielczość zależą zarówno od przepływu elektroforetycznego jak i elektroosmotycznego Obserwowane mobilność jest sumą obu efektów m app = m ep + m EOF Typowo, EOF dominuje i wszystkie cząsteczki przemieszczają się w kierunku katody (-)

Ogrzewanie się kapilary Wynika z przemieszczania się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym Gradient temperatury powoduje powstawanie konwekcji w elektrolicie Konwekcja powoduje poszerzanie się pików Dodatkowo podwyższona temperatur może powodować rozkład niektórych cząsteczek Zmniejszanie grzania się kapilary: Zmniejszenie napięcia Użycie kapilar o mniejszej średnicy (większy stosunek powierzchni do objętości)

Dozowanie próbki: Próbka powinna mieć objętość kilku nl Sposoby: Ciśnieniowe Syfonowe elektrokinetyczne

Detektory: UV-Vis Fluorescencji Przewodnictwa elektrochemiczny

Żelowa elektroforeza kapilarna Żelowa elektroforeza kapilarna Kapilara jest wypełniona żelem Stosuje się głównie dla makrocząsteczek (cząsteczek, które znacznie różnią się rozmiarem) Lepszy rozdział w krótszym czasie w porównaniu do elektroforezy żelowej planarnej Najczęściej stosuje się poliakrylamid

Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne Technika analityczna pozwalająca na rozdział związków różniących się punktem izoelektrycznym Elektroforezę wykonuje się w kapilarze z zablokowanym przepływem elektroosmotycznym i zawierającej bufor z gradientem ph

Izotachoforeza kapilarna Izotachoforeza kapilarna iso taka sama tacho prędkość phoresis migracja Frakcje poruszają się przez kapilarę z tą samą prędkością Efekt samozatężania

Izotachoforeza kapilarna Próbkę nakłada się pomiędzy bufor wiodący i zakańczający W buforze wiodącym aniony mają większą ruchliwość niż w próbce W buforze zakańczającym mają mniejsza ruchliwość niż w próbce.

Izotachoforeza kapilarna Efekt samozatężania Izotechoforegram ma postać schodkową

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna Anality są rozdzielane ze względu na podział pomiędzy micele i bufor Jest to rodzaj chromatografii gdzie fazą stacjonarną są micele.

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna Typowo do utworzenia miceli stosuje się siarczan dodecylu (SDS) Rozdział wykonuje się w warunkach zasadowych, gdzie przepływ elektroosmotyczny jest wysoki; Ponieważ prędkość elektroforetyczna jest o przeciwnym zwrocie do prędkości elektroosmotycznej to micele poruszają się wolno w kierunku katody(-)

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna

Micelarna chromatografia elektrokinetyczna marker EOF Neutralny analit nie oddziałujący z micelami Taka sama prędkość jak EOF Wyznacza t 0 metanol Marker miceli Analit w pełni oddziałujący z micelami Taka sama prędkość jak micele Wyznacza t mc Sudan III (pigment)

Elektrochromatografia kapilarna Kolumny podobne do tych w mikro-hplc Faza ruchoma jest przemieszczana za pomocą pola elektrycznego podobnie jak w CE Rozdział substancji jest wynikiem kombinacji oddziaływania z fazą stacjonarną i migracji elektroforetycznej Może być wykonane na aparacie do CE z kolumna mikro-hplc

Podsumowanie Elektroforeza kapilarna daje duże możliwości rozdziału substancji. Jest wiele technik elektromigracyjnych.