MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 89-98

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 89-98 Opracowanie szybkiego testu PCR-RFLP do identyfikacji pałeczek Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 z epidemicznego szczepu tych drobnoustrojów izolowanych w Polsce od 2004 roku Development of molecular PCR-RFLP test for identification of the epidemic strain of Y. enterocolitica bioserotype 1B/O8 circulating in Poland since 2004 Tomasz Wołkowicz, Natalia Wolaniuk, Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński, Natalia Rokosz, Waldemar Rastawicki Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Od 2004 roku obserwowane jest w Polsce rozproszone ognisko zakażeń pałeczkami Y. enterocolitica należącymi do wysoce chorobotwórczego bioserotypu 1B/O8. Celem prowadzonych badań było opracowanie szybkiego, molekularnego testu do identyfikacji drobnoustrojów należących do tego epidemicznego szczepu. Zaproponowany schemat diagnostyczny obejmuje dwa etapy. Pierwszy z nich, test multipleks-pcr, pozwala na identyfikację pałeczek Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 poprzez detekcję czterech markerów genetycznych (ail, ysta, irp1, sekwencja 16S rdna). Drugi etap, test dupleks-pcr-rflp, pozwala wykryć wariant genu ysrr charakterystyczny dla epidemicznego szczepu. Zaproponowany test może stanowić przydatne narzędzie diagnostyczne w typowaniu izolatów epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 w diagnostyce klinicznej, weterynaryjnej, badaniu żywności jak również w dochodzeniu epidemiologicznym. Słowa kluczowe: Yersinia enterocolitica, bioserotyp 1B/O8, PCR-RFLP, molekularna diagnostyka ABSTRACT Introduction: Highly pathogenic Y. enterocolitica bioserotype 1B/O8 is considered to be an important etiological agent of yersiniosis in Poland. Infections caused by Y. enterocolitica 1B/O8 became an important public health problem in Poland, especially because of their high potential of virulence and the unknown source of the bacteria. Y. enterocolitica 1B/O8

90 T. Wołkowicz i inni Nr 2 isolates recovered in Poland are genetically highly related and constitute single epidemic sensu stricto strain. The aim of the present study was to develop a time- and money-effective molecular assay for rapid identification of pathogenic Y. enterocolitica 1B/O8 isolates belonging to the epidemic strain. Methods: In the first stage we performed a multiplex-pcr for four genetic markers: ail, ysta, irp1 and 16S rdna sequence. In the next stage we designed a duplex-pcr-rflp assay with BtsI endonuclease to detect / identify specific variant of an ysrr gene that is characteristic for epidemic strain of Y. enterocolitica 1B/O8 strain. The assay was tested against a panel of a consisted of a variety Yersinia enterocolitica and Y. pseudotuberculosis strains. Results: All the tested Y. enterocolitica 1B/O8 strains were positive for all the genetic markers in multiplex-pcr assay what distinguished them from other tested Yersinia strains. In duplex-pcr-rflp test all tested isolates of the epidemic strain were negative for ysrr digestion with BtsI endonuclease, while all tested reference strains of Y. enterocolitica 1B/ O8 were positive. Conclusions: The assay developed in this study was two-stage / two-step molecular test efficiently distinguishing wild-type and the epidemic Y. enterocolitica 1B/O8 strain. Such test can be a useful screening tool for clinical, veterinary and food diagnostics, as well as for the purposes of epidemiological investigation. Key words: Yersinia enterocolitica, bioserotype 1B/O8, PCR-RFLP, molecular diagnostic WSTĘP Wysoce chorobotwórcze pałeczki Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 stanowią w Polsce istotny etiologiczny czynnik jersiniozy - ostrej choroby zakaźnej. Drobnoustroje te, określane mianem szczepów amerykańskich izolowane są w Polsce od osób z jersiniozą od ponad 10 lat (7, 15, 16, 17). Po raz pierwszy w pełni wirulentny szczep Y. enterocolitica 1B/O8 został wyhodowany z węzła chłonnego krezki pacjentki z marskością wątroby w 2004 roku (11, 16, 23). Do końca lat 80. XX w. pałeczki bioserotypu 1B/O8 były izolowane od osób chorych głównie na terenie USA, gdzie występowały endemicznie. W następnych latach zostały one wyparte przez aktualnie dominujący na świecie bioserotyp 4/O3 (1, 2). W latach 90. pierwsze przypadki izolacji pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 od zwierząt oraz ludzi zaczęto odnotowywać w Japonii (21). W Europie pierwszy udokumentowany przypadek jersiniozy wywołany przez pałeczki Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 został opisany w 2003 roku w Niemczech (22). Dotychczas, według danych piśmiennictwa, największa liczba izolacji tych bakterii była odnotowana w Polsce, ale doniesienia o klinicznych szczepach z tej grupy pochodzą również z Niemiec (16, 20, 27). Unikatową cechą pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 izolowanych w Polsce jest wyjątkowo bliskie genetyczne pokrewieństwo powodujące, że izolaty te można zaliczyć do tego samego szczepu sensu stricto (11, 27). Zaobserwowana wysoka homogenność genetyczna wśród badanych izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 wskazuje na stabilne utrzymywanie się epidemicznego szczepu tych pałeczek na terenie Polski. Jednakże do tej pory nie udało się ustalić źródła zakażenia jak i dróg szerzenia się tych drobnoustrojów (12, 28).

Nr 2 Szybki test PCR-RFLP do identyfikacji Y. enterocolitica 1B/O8 91 Zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego, ponieważ drobnoustroje te zaliczane są do grupy wysoce chorobotwórczych przedstawicieli swojego gatunku (4, 5). Pałeczki z bioserotypu 1B/O8 charakteryzują się zwiększonym potencjałem chorobotwórczym, wynikającym z posiadania dodatkowych czynników wirulencji w porównaniu do innych chorobotwórczych przedstawicieli gatunku Y. enterocolitica, tj.: systemem pozyskiwania żelaza yersiniabaktyna (Ybt), a także systemem sekrecji białek Ysa (T3SS) i Yst1(T2SS) (1, 3, 13, 26). Obecność tych czynników wirulencji u pałeczek Yersinia powoduje zwiększenie ryzyka wystąpienia nasilonych objawów klinicznych w przebiegu jersiniozy u osoby zakażonej (4, 24). Bakteriologiczna diagnostyka zakażeń Y. enterocolitica opiera się głównie na określeniu właściwości fenotypowych drobnoustrojów, pozwalających określić ich biotyp oraz grupę serologiczną. Oznaczenie przynależności do odpowiedniego bioserotypu może być przydatne w określeniu potencjału chorobotwórczego danego izolatu. Coraz częściej w praktyce stosowane są również testy molekularne do identyfikacji określonych determinant chorobotwórczości tych patogenów (6, 25). Dokładna molekularna charakterystyka epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 występującego w Polsce wykazała, iż mimo przynależności do tego wysoce patogennego bioserotypu oraz obecności genetycznych markerów chorobotwórczości charakterystycznych dla tej grupy pałeczek Y. enterocolitica, nie posiada on zdolności do ekspresji systemu Ysa (19). Analiza sekwencji nukleotydowej locus YSAPI wykazała, że przyczyną inaktywacji systemu T3SS Ysa jest mutacja punktowa w genie regulatorowym ysrr skutkująca powstaniem przedwczesnego kodonu STOP (18). Dotychczasowe wyniki badań naszego zespołu (dane niepublikowane) pozwalają twierdzić, że mutacja ta występuje u każdego izolatu należącego do epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 występującego w Polsce. W celu potwierdzenia, czy badany izolat Y. enterocolitica 1B/O8 należy do epidemicznego szczepu konieczne było przeprowadzenie jego typowania metodą PFGE, która jest czasochłonna i kosztowna (11, 28). Z tego względu celem niniejszej pracy było opracowanie szybkiego testu diagnostycznego do identyfikacji izolatów należących do epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 występującego w Polsce. Punktem wyjścia do tych badań było wspomniane wyżej założenie, że mutacja generująca powstanie przedwczesnego kodonu stop w genie ysrr występuje powszechnie i jest specyficzna dla tych drobnoustrojów, izolowanych od osób z jersiniozą na terenie kraju. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Materiał do badań stanowiły izolaty Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 (n= 11) wyosobnione z materiału klinicznego od osób zamieszkałych w Polsce, szczepy z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH, szczepy referencyjne Y. enterocolitica 1B/O8 z kolekcji Referencyjnego Ośrodka WHO ds. Yersinia (Instytut Pasteura, Francja) (n=10) i kolekcji Instytutu Max von Pettenkofer w Monachium (n=1, szczep WA-314). Ponadto w badaniach posłużono się szczepami Y. enterocolitica reprezentującymi bioserotypy: 4/O3 (n=2), 2/O9 (n=2), 2/O5;27 (n=2), biotyp 1A (n=1) oraz szczepami z gatunku Y. pseudotuberculosis (n=2). Tabela 1.

92 T. Wołkowicz i inni Nr 2 Izolacja DNA. Preparaty genomowego DNA badanych izolatów uzyskiwano zgodnie z opisaną wcześniej procedurą (10). Badanie metodą multipleks-pcr. Do wykrywania obecności markerów genetycznych: ysta, ail, irp1, 16S rdna zastosowano multipleks-pcr (12, 28). Sekwencje nukleotydowe starterów oraz oczekiwaną wielkość produktów PCR podano w Tabeli 1. Reakcję PCR przeprowadzano w końcowej objętości 25 μl. Mieszanina reakcyjna zawierała: jałową wodę dejonizowaną; 2,5 μl 10 x buforu (10X DreamTaq Green Buffer, Thermo Scientific); 0,5 μl 10 mm mieszaniny dntp (Sigma-Aldrich); 0,75 μl 10mM każdego ze starterów (w przypadku starterów 16S rrna użyto ilości 0,25 μl 10mM każdego ze starterów); 0,75 U polimerazy DNA (DreamTaq, Thermo Scientific) i 2 μl matrycy DNA. Reakcję amplifikacji prowadzono w termocyklerze Mastercycler (Eppendorf) w następujących warunkach: 94 C przez 5 min., następnie 35 cykli: 94 C przez 45 s, 58 C przez 45 s i 72 C przez 45s. Produkty amplifikacji rozdzielano w 2% żelu agarozowym (MP Biomedicals). Dupleks PCR-RFLP. W celu rozróżnienia szczepów należących do epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 występującego w Polsce od innych szczepów tego bioserotypu zaprojektowano układ diagnostyczny typu dupleks PCR-PFLP. W pierwszym etapie amplifikowano fragment genu irp2 (startery irp-2f i irp2-r) oraz gen ysrr (startery ysrr-f i ysrr-r). Reakcję PCR przeprowadzano w końcowej objętości 25 μl. Mieszanina reakcyjna zawierała: jałową wodę dejonizowaną; 2,5 μl 10 x buforu (10X DreamTaq Green Buffer, Thermo Scientific); 0,5 μl 10 mm mieszaniny dntp (Sigma-Aldrich); 0,6 μl 10mM każdego ze starterów; 0,75 U polimerazy DNA (DreamTaq, Thermo Scientific) i 2 μl preparatu genomowego DNA. Reakcję amplifikacji prowadzono w termocyklerze Mastercycler (Eppendorf) w następujących warunkach: 94 C przez 5 min., następnie 35 cykli: 94 C przez 45 s, 57 C przez 45 s i 72 C przez 45 s. W drugim etapie, produkty PCR trawiono enzymem BtsI. Mieszanina reakcyjna w objętości końcowej 15µl zawierała: wodę dejonizowaną; 1,5µl CutSmart Buffer (New England Biolabs); 10µl produktu PCR i 4U enzymu BtsI (New England Biolabs). Reakcję enzymatyczną prowadzono w temperaturze 55 C przez 2h. Produkty trawienia rozdzielano w 2% żelu agarozowym (MP Biomedicals) stosując marker wielkości Perfect 100bp DNA Ladder (EURx). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Zaproponowany schemat diagnostyczny do identyfikacji pałeczek Y. enterocolitica 1B/O8 należących do szczepu epidemicznego występującego na terenie kraju składa się z dwóch etapów. Pierwszy z nich obejmuje test multipleks-pcr, w którym analizowana jest obecność w badanym izolacie trzech genów: ysta, ail, irp1 oraz sekwencji 16S rdna. Sekwencje nukleotydowe: ail, ysta kodujące odpowiednio adhezynę Ail i termostabilną enterotoksynę YstA stanowią determinanty wirulencji charakterystyczne dla chorobotwórczych pałeczek Y. enterocolitica należących zarówno do szczepów europejskich o niskim potencjale chorobotwórczym (bioserotypy: 4/O3, 2/O9, 2/O5,27) oraz do wysoce chorobotwórczych szczepów amerykańskich (głównie bioserotyp 1B/O8) (1, 12). Obecność zaś genu irp1, biorącego udział w biosyntezie jersiniabaktyny wskazuje na przynależność izolatu do wysoce chorobotwórczych pałeczek tego gatunku. Otrzymanie w powyższym teście

Nr 2 Szybki test PCR-RFLP do identyfikacji Y. enterocolitica 1B/O8 93 Tabela 1. Oznakowanie, sekwencja starterów oraz oczekiwana wielkość produktów amplifikacji obszaru DNA badanych szczepów Y. enterocolitica. Wielkość Gen lub Produkt Sekwencja startera (forward) Sekwencja startera (reverse) produktu marker ekspresji genu PCR (pz) Piśmiennictwo 16S rdna - 5 GAGGATGACCAGCCACACTGG 5 CATCACGTGCTGGCAACAAAGG 842 (11) ysta Enterotoksyna YstA 5 AATGCTGTCTTCATTTGGAGC 5 GCAACATACATCACAGCAATC 163 (14) ail Adhezyna Ail 5 CCTGAAGTACCGTTATGAAC 5 TTGACGTCTTACTTGCACTG 251 (9) irp1 syntetaza HMWP 5 GTACAGACCGCCTGCTCCAGTT 5 TGTAACCTACCTGCCTGTCGTC 412 (9) irp2 syntetaza HMWP2 5 CTCCGCAGAACAGGTAGCCGA 5 CGACATACTCAATCTGTCCGG 500 (11) ysrr Regulator YsrR 5 ATGACACAAACGAAAACGCTCAAT 5 TTATAGAGAAATTTCATGAGCAT 711 -

94 T. Wołkowicz i inni Nr 2 Tabela 2. Zestawienie stosowanych w badaniu szczepów oraz wyniki amplifikacji genów ysta, ail, irp1, 16SrRNA, irp2 oraz ysrr w reakcji PCR oraz wyniki reakcji trawienia restrykcyjnego amplifikowanych fragmentów genów irp2 i ysrr enzymem BtsI. Nazwa szczepu Źródło Rok izolacji Gatunek / bioserotyp ysta ail irp1 DM0110 ZB NIZP-PZH 2005 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0150 ZB NIZP-PZH 2004 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0149 ZB NIZP-PZH 2005 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0147 ZB NIZP-PZH 2006 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0111 ZB NIZP-PZH 2007 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM086 ZB NIZP-PZH 2008 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0204 ZB NIZP-PZH 2009 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0340 ZB NIZP-PZH 2010 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0357 ZB NIZP-PZH 2011 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0367 ZB NIZP-PZH 2012 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0370 ZB NIZP-PZH 2013 Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + - DM0194 ZB NIZP-PZH 2008 Y. enterocolitica 2/O9 + + - + - - - - 96P ZB NIZP-PZH* b.d. Y. enterocolitica 2/O9 + + - + - - - - DM0002 ZB NIZP-PZH b.d. Y. enterocolitica 4/O3 + + - + - - - - 108P ZB NIZP-PZH* b.d. Y. enterocolitica 4/O3 + + - + - - - - O5,27 ZB NIZP-PZH* b.d. Y. enterocolitica 2/O5, 27 + + - + - - - - 36/11 ZB NIZP-PZH b.d. Y. enterocolitica 1A - - - + - - - - Y31 ZB NIZP-PZH b.d. Y. pseudotuberculosis b.d. b.d. b.d. b.d. + + - - Y77 ZB NIZP-PZH b.d. Y. pseudotuberculosis b.d. b.d. b.d. b.d. + + - - WA-314 MPI b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 1105 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20175 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20189 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20167 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 17451 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20176 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 13804 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20232 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20178 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + 20169 IP b.d. Y. enterocolitica 1B/O8 + + + + + + + + IP Instytut Pastera, Paryż, Francja MPI Max Von Pettenkofer Institut, Monachium, Niemcy ZB NIZP-PZH - Zakład Bakteriologii NIZP-PZH * - w kolekcji Zakładu Bakteriologii od 2001 roku, przekazane z MPI. b.d. brak danych 16S rrna irp2 irp2 + BtsI ysrr ysrr + BtsI

Nr 2 Szybki test PCR-RFLP do identyfikacji Y. enterocolitica 1B/O8 95 wyłącznie produktu PCR odpowiadającego sekwencji kodującej 16S rrna wskazywać może na przynależność badanego szczepu Y. enterocolitica do biotypu 1A, który to biotyp obejmuje w większości szczepy uznawane za niechorobotwórcze dla ludzi (1, 4). Wyniki badań przeprowadzonych na kolekcji szczepów Y. enterocolitica należących do różnych bioserotypów przedstawiono w tabeli 2. W drugim etapie zaproponowanego schematu diagnostycznego w układzie dupleks PCR amplifikacji poddawano fragment genu irp2, który również związany jest z biosyntezą jersiniabaktyny. Amplifikowany fragment genu irp2 miał długość 500 nt. Jednocześnie w tej samej mieszaninie reakcyjnej amplifikacji ulegał też fragment genu ysrr o długości 711 nt, a następnie produkty PCR poddawano trawieniu endonukleazą BtsI. W dzikiej wersji genu ysrr, spotykanej u szczepów wzorcowych Y. enterocolitica 1B/O8 izolowanych poza krajem, występuje miejsce rozpoznawane przez enzym BtsI, który w wyniku trawienia produktu PCR generuje dwa fragmenty DNA o długości 268 oraz 445 nt. Natomiast w zmutowanym genie ysrr, charakterystycznym dla szczepu epidemicznego tych pałeczek w Polsce, sekwencja rozpoznawana przez enzym BtsI nie występuje. Równocześnie w opracowanym przez nas teście trawieniu ulega fragment genu irp2 zawierający natywne miejsce cięcia swoiste dla BstI, efektem czego jest powstanie dwóch fragmentów DNA o długości 314 i 188 nt widocznych na rycinie 1. W tym wypadku gen irp2 służy jako naturalna kontrola wewnętrzna testu, potwierdzająca prawidłowe dla reakcji trawienia enzymem BtsI warunki i skład mieszaniny. Profile prążków charakterystyczne dla szczepu epidemicznego oraz dla szczepu referencyjnego WA-314 przedstawiono na rycinie 1. Wyniki reakcji dupleks-pcr-rflp, przeprowadzonej z użyciem szczepów z kolekcji pałeczek Yersinia, przedstawiono w tabeli 2. Na uwagę zasługuje fakt, że produkty amplifikacji obydwu genów były uzyskiwane w przypadku wszystkich badanych szczepów Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8. Badane szczepy Y. pseudotuberculosis wykazywały obecność genu irp2, przy jednoczesnym braku produktu amplifikacji genu ysrr. Dodatni wynik analizy restrykcyjnej amplifikowanych fragmentów genu irp2 stwierdzono, zarówno u szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 jak i Y. pseudotuberculosis. Z kolei amplifikowany fragment genu ysrr ulegał trawieniu enzymem BtsI jedynie w przypadku szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 pochodzących z kolekcji Instytutu Pasteura oraz szczepu WA-314. Wynik ten pokazuje, że opracowany test wyraźnie różnicuje izolaty szczepu epidemicznego, których produkt PCR genu ysrr nie ulegał trawieniu enzymem BtsI i jego wielkość pozostawała niezmieniona, co widać na elektroforegramie przedstawionym na rycinie 1. Ze względu na wciąż notowane przypadki zakażeń pałeczkami Y. enterocolitica 1B/O8 w Polsce, zaproponowany molekularny test diagnostyczny może być przydatny do identyfikacji izolatów epidemicznego szczepu tych drobnoustrojów, a tym samym do monitorowania ognisk zakażeń tymi drobnoustrojami w Polsce. Trzeba mieć na uwadze fakt, iż głównym rezerwuarem pałeczek Y. enterocolitica, zarówno chorobotwórczych, jak i niepatogennych jest trzoda chlewna. Tak więc, test ten może okazać się przydatny w weterynarii, w badaniach dotyczących obecności pałeczek epidemicznego szczepu Y. enterocolitica 1B/O8 u zwierząt i w żywności, zwłaszcza w mięsie wieprzowym. Bardzo wysoki stopień wzajemnego podobieństwa wszystkich izolatów Y. enterocolitica 1B/O8 izolowanych na terenie Polski oraz brak ich zmienności na przestrzeni ponad dziesięciu lat sugeruje występowanie jednego źródła tych patogenów (7, 12, 27). Jednak mimo ponad 10. lat trwania rozproszonego ogniska tych zakażeń, jego źródło w dalszym

96 T. Wołkowicz i inni Nr 2 Rycina 1. Wynik testu dupleks-pcr-rflp dla szczepu DM0110 (ścieżki 1-2) oraz WA314 (ścieżki 3-4). Opis ścieżek: M marker wielkości Perfect 100bp DNA Ladder (EURx); 1 i 3 amplifikat trawiony enzymem BtsI; 2 i 4 amplifikat nie trawiony enzymem BtsI. ciągu nie jest znane. Zastosowanie powyższego testu w diagnostyce weterynaryjnej oraz diagnostyce żywności może pomóc w zdefiniowaniu źródła zakażeń. Badania były finansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przeznaczonych na realizację projektu badawczego nr N N401 076039. PIŚMIENNICTWO 1. Bottone EJ. Yersinia enterocolitica: the charisma continues. Clinic Microbiol Rev 1997; 10: 257-76. 2. Bottone EJ. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect 1999; 1: 323-3. 3. Carniel E. The Yersinia high-pathogenicity island: an iron-uptake island. Microbes Infect 2001; 3: 561 9. 4. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). Monitoring and identification of human enteropathogenic Yersinia spp. - Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards. EFSA J 2007; 595: 1-30. 5. EFSA. Scientific Report of EFSA. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2009. EFSA J 2011; 9(3): 2090 [378 pp.].

Nr 2 Szybki test PCR-RFLP do identyfikacji Y. enterocolitica 1B/O8 97 6. Falcão JP, Falcão DP, Pitondo-Silva A, Malaspina AC, Brocchi M. Molecular typing and virulence markers of Yersinia enterocolitica strains from human, animal and food origins isolated between 1968 and 2000 in Brazil. J Med Microbiol 2006; 55:1539-48. 7. Furman S, Napiórkowska A, Sadkowska-Todys M. Jersinioza w Polsce w 2009 roku. Przegl Epidemiol 2011; 65: 235-8. 8. Gierczyński R. Ocena przydatności wybranych markerów wirulencji do identyfikowania chorobotwórczych szczepów pałeczek Yersinia enterocolitica. Cz. III. Chromosomalne markery wirulencji. Med Dośw Mikrobiol 2000; 52: 25-34. 9. Gierczyński R, Jagielski M, Rastawicki W. Molecular virulence attributes and occurence of pyvbearing strains among human clinical isolates of Yersinia enterocolitica in Poland. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002; 21: 158-9 10. Gierczyński R, Szych J, Cieślik A, Rastawicki W, Jagielski M. The occurrence of the first two CTX-M-3 and TEM-1 producing isolates of Salmonella enterica serovar Oranienburg in Poland. Int J Antimicrob Agents 2003; 21: 497-9. 11. Gierczyński R, Szych J, Rastawicki W, Wardak S, Jagielski M. Molecular characterization of human clinical isolates of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O8 in Poland: emergence and dissemination of three highly related clones. J Clin Microbiol 2009; 47: 1225-8. 12. Gierczyński R. Genetyczna struktura populacji I determinanty chorobotwórczości pałeczek Yersinia enterocolitica izolowanych materiału klinicznego od ludzi w Polsce w latach 1996 2008. Rozprawa na stopień doktora habilitowanego nauk medycznych w zakresie biologii medycznej. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny, Warszawa 2010. 13. Haller JC, Carlson S, Pederson KJ, Pierson DE.A chromosomally encoded type III secretion pathway in Yersinia enterocolitica is important in virulence. Mol Microbiol 2000; 3: 1436-46. 14. Ibrahim A, Liesack W, Stackebrandt E. Polymerase chain reaction-gene probe detection system specific for pathogenic strains of Yersinia enterocolitica. J Clinic Microbiol 1992; 30: 1942-7. 15. Napiórkowska A, Bobel D, Sadkowska-Todys M. Jersinioza w Polsce w 2007 roku. Przegl Epidemiol 2009; 63: 221-4. 16. Rastawicki W, Szych J, Gierczyński R, Rokosz N. A dramatic increase of Yersinia enterocolitica serogroup O:8 infections in Poland. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28: 535-37. 17. Rastawicki W, Szych J, Rokosz N, Zacharczuk K, Gierczyński R. Seasonality of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O:8 infections in Poland. Epidemiol Infect. 2012. 6: 1-4. 18. Rastawicki W, Szych J, Rokosz N, Zacharczuk K, Wołkowicz T, Gierczyński R. Emergence of high-pathogenicity Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O8 infections in Poland. W: Materiały Zjazdowe Yersinia 11: The 11th International Symposium on Yersinia. Suzhou, China, 24-28 June 2013, 74. 19. Rokosz-Chudziak N, Rastawicki W, Zacharczuk K, Gierczyński R. Elektroforetyczna i immunologiczna analiza natywnych białek wydzielniczych wytwarzanych in vitro w warunkach indukcji Ysa (Yersinia secretion apparatus) przez izolaty Yersinia enterocolitica 1B/O8 wyosobnione w Polsce. Med Dośw Mikrobiol. 2013; 65: 245-54. 20. Rosner BM, Stark K, Werber D. Epidemiology of reported Yersinia enterocolitica infections in Germany, 2001-2008. BMC Public Health 2010; 10: 337. 21. Sakai T, Nakayama A, Hashida M, Yamamoto Y, Takebe H, Imai S. Outbreak of food poisoning by Yersinia enterocolitica serotype O8 in Nara prefecture: the first case report in Japan. Jpn J Infect Dis 2005; 58: 257-8. 22. Schubert S, Bockemühl J, Brendler U, Heesemann J. First isolation of virulent Yersinia enterocolitica O8, biotype 1B in Germany. Eur J Clin Microbiol Infect 2003; 22: 66-8. 23. Szych J, Rastawicki W, Gierczyński R, Krygier R, Mądroszczyk A, Cieślik A. First isolation of virulent Yersinia enterocolitica O8 biotype 1B in Poland. Post Mikrobiol 2004; 43; (Supl 1): 159. 24. Szych J. Jersinioza nowe zagrożenie mało znaną chorobą. Nowa Klinika 2011; 18: 4045-50.

98 T. Wołkowicz i inni Nr 2 25. Thoerner P, Bin Kingombe CI, Bögli-Stuber K, Bissig-Choisat B, Wassenaar TM, Frey J, Jemmi T. PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 1810-6. 26. Young GM. The Ysa type 3 secretion system of Yersinia enterocolitica biovar 1B.Adv Exp Med Biol 2007; 603: 286-97. 27. Zacharczuk K. Molekularna charakterystyka pałeczek Yersinia enterocolitica 1B/O8 wyizolowanych od ludzi w Polsce w 2009 roku. Rozprawa doktorska, NIZP-PZH. 2013. Warszawa. 28. Zacharczuk K. Analiza profilu genetycznych markerów chorobotwórczości pałeczek Yersinia enterocolitica bioserotypu 1B/O8 wyizolowanych z materiału klinicznego w Polsce w 2009 r. Med Dośw Mikrobiol 2013; 65: 233-243. Otrzymano: 16 V 2014 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH, e-mail: twolkowicz@pzh.gov.pl, tel. 22 54 21 263,