Farmacja rok I Zajęcia fakultatywne: Identyfikacja i określanie zwartości zanieczyszczeń nieorganicznych w preparatach farmaceutycznych Literatura ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ NIEORGANICZNYCH W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH 1. Farmakopea Polska IX, Urząd Rejestracji Produktów Leczniczych, Wyrobów Medycznych i Produktów Biobójczych. Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, 2011-14. 2. Leciejewicz-Ziemecka E. Ocena zanieczyszczeń w surowcach farmaceutycznych jako element wymagań farmakopealnych. Biul. Inst. Leków 2000, 44, 239-409. 3. Leciejewicz-Ziemecka E. Farmakopealne metody badania zanieczyszczeń. Biul. Inst. Leków 1999, 42, 196-214. 4. Leciejewicz-Ziemecka E. Farmakopealne metody badania zanieczyszczeń w wybranych grupach antybiotyków. Biul. Inst. Leków 1998, 43, 48-69. 5. Stańczak A., Wieniawski. Pozostałości rozpuszczalników organicznych w substancjach farmaceutycznych. Biul. Inst. Leków 1996, 40, 35-55. 6. Stańczak A. Pozostałości rozpuszczalników organicznych w substancjach farmaceutycznych. Biul. Inst. Leków 1999, 43, 177-200. 7. Wieniawski W. Poszukiwanie zanieczyszczeń w środkach farmaceutycznych. Biul. Inst. Leków 1996, 40, 21-31. I. Część teoretyczna Farmakopea Polska i Europejska (Ph.Eur.) definiują, że zanieczyszczenie to każdy składnik substancji do celów farmaceutycznych, o budowie chemicznej innej niż substancja właściwa. Definicja powyższa jest zgodna z ustaleniami przyjętymi przez ICH (Międzynarodowa Konferencja Harmonizacji Wymagań dla Leków International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use). Substancjami do celów farmaceutycznych są wszystkie organiczne lub nieorganiczne substancje, używane jako substancje czynne lub pomocnicze do wytwarzania produktów leczniczych stosowanych u ludzi i w weterynarii. Substancje te mogą być pozyskiwane ze źródeł naturalnych lub otrzymywane w procesach ekstrakcji z surowców, fermentacji lub syntezy. Podstawowym kryterium podziału zanieczyszczeń jest ich pochodzenie. Na tej podstawie wyróżnia się 2 grupy zanieczyszczeń: zanieczyszczenia produkcyjne niespecyficzne; źródłem tych zanieczyszczeń mogą być surowce i rozpuszczalniki stosowane w procesie syntezy danej substancji lub aparatura. zanieczyszczenia degradacyjne specyficzne; ich źródłem mogą być związki uboczne, tworzące się podczas syntezy lub też produkty rozkładu substancji czynnej, mogące powstawać w wyniku niewłaściwego lub długiego przechowywania. Czynnikami, które mogą przyspieszać rozkład są światło, temperatura i wilgotność względna powietrza. W wyniku działania tych czynników substancje czynne mogą ulegać m.in. reakcjom hydrolizy, utleniania, redukcji lub izomeryzacji. Monografie Farmakopei dla substancji do celów farmaceutycznych mają na celu zapewnić użytkownikom ich odpowiednią jakość, jakość w zakresie zanieczyszczeń kontrolowana jest przez zbiór badań podanych w monografii. Farmakopea zaleca wykonanie profilu zanieczyszczeń substancji. 1
Profil zanieczyszczeń jest to wykaz wszystkich zanieczyszczeń wraz z określeniem ilości każdego z nich. Profil zanieczyszczeń jest związany z zastosowaną metodą syntezy. Ścisłe określenie profilu zanieczyszczeń pociąga za sobą konieczność otrzymywania danego surowca sprecyzowaną metodą syntezy chemicznej. W Farmakopei wprowadzono pojęcie poziomu jako granicznej zawartości każdego z zanieczyszczeń. Przy ustalaniu dopuszczalnych granic zanieczyszczeń w surowcu powinny być uwzględnione następujące czynniki: toksyczności samej substancji leczniczej, zawierającej typowy profil zanieczyszczeń lub toksyczność samego zanieczyszczenia, droga podania substancji, dawka dzienna substancji leczniczej, jej ilość i częstość stosowania, populacja, która będzie stosowała lek, np. dzieci, osoby starsze, farmakologia zanieczyszczeń, źródło pochodzenia leku produkt syntetyczny, naturalny, otrzymywany drogą biotechnologii, czas trwania terapii, ekonomiczny, obejmujący zdolność procesu wytwórczego i cenę leku. Obecność zanieczyszczeń organicznych substancji czynnej jest wykazywana i, o ile to możliwe, identyfikowana i kwalifikowana zgodnie z przyjętymi zasadami. Próg oceny zanieczyszczenia jako kwalifikowanego jest wyrażony jako procentowa zawartość zanieczyszczenia w surowcu lub jako ilość zanieczyszczenia przyjętego dziennie. Ma to praktyczne uzasadnienie z uwagi na dużą rozpiętość dawek substancji leczniczych. Poziom graniczny uzależniony jest od maksymalnej dawki dobowej, jaka może być podana pacjentowi, przy czym uwzględniono 2 kategorie dawki 2 g lub mniej i powyżej 2 g. Zatem dla substancji przyjmowanej w dawce dobowej poniżej 2 g konieczne jest: przy poziomie zanieczyszczeń powyżej 0,05% - oznaczenie ilościowe zanieczyszczenia, przy poziomie 0,10% - ustalenie jego budowy, przy poziomie 0,15% - ocena działania biologicznego danego zanieczyszczenia. Jeżeli z obliczeń wynika, ze pacjent pobiera z lekiem ponad 1 mg/dobę danego zanieczyszczenia, wówczas wymagane jest nie tylko ustalenie budowy, ale także ocena działania biologicznego. Tabela. Wykazywanie, identyfikacja i kwalifikacja zanieczyszczeń organicznych w substancjach czynnych Maksymalna dawka dobowa Próg wykazywania Próg identyfikacji Próg kwalifikacji 2g /dobę * > 0,05% > 0,10% lub dobowe pobranie > 1,0 mg; wybrać wartość niższą > 0,15% lub dobowe pobranie > 1,0 mg; wybrać wartość niższą > 2g /dobę * > 0,03% > 0,05% > 0,05% Nie dotyczy ** > 0,10% > 0,20% > 0,50% *- stosowanie u ludzi lub u ludzi i w weterynarii **- stosowanie wyłącznie w weterynarii 2
Odrębny problem stanowią badania jakości mikrobiologicznej, obejmującej jałowość, czystość mikrobiologiczną leku oraz endotoksyny bakteryjne. W Farmakopei Polskiej zamieszczono wskazówki dotyczące określania zanieczyszczeń niespecyficznych, które obejmują m.in.: popiół całkowity, popiół siarczanowy, arsen, wapń, magnez, żelazo, potas, glin, azotany, chlorki, fluorki, fosforany, siarczany, metale ciężkie, oznaczenia metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej: ołów w cukrach, metale ciężkie w substancjach roślinnych i olejach tłustych, nikiel w poliolach, nikiel w uwodornionych olejach roślinnych, identyfikację i kontrolę pozostałości rozpuszczalników. Wskazówki dotyczące zanieczyszczeń dla danej substancji są zawarte w odpowiednich monografiach szczegółowych. Do oceny wyników stosuje się porównanie z roztworami wzorcowymi lub porównawczymi. Roztwory wzorcowe lub porównawcze zawierają dopuszczalną, ściśle określoną ilość danego zanieczyszczenia. II. Część praktyczna II.A. ANALIZA JAKOŚCIOWA ZANIECZYSZCZEŃ NIEORGANICZNYCH W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH (wg Farmakopei Polskiej) Przed przystąpieniem do analizy zanieczyszczeń należy przygotować roztwory wzorcowe przez rozcieńczenie podstawowych roztworów wzorcowych. Podstawowe roztwory wzorcowe przygotowano w następujący sposób: 1. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów chlorkowych (100µg Cl/ml; 100ppm Cl): 0,0165g bezwodnego chlorku sodu przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 100ml, rozpuszczono w niewielkiej ilości wody i uzupełniono wodą do kreski. 2. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów siarczanowych (VI) (1mg SO 4 /ml): 0,1810g siarczanu potasu rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml i uzupełniono wodą do kreski. 3. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów fosforanowych (V) (200µg PO 4 /ml; 200ppm PO 4 ): 0,0286g diwodorofosforanu potasu rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml i uzupełniono wodą do kreski. 4. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów amonowych (1mg NH 4 /ml): 0,2965g chlorku amonu rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml, i uzupełniono wodą do kreski. 5. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów magnezu (250µg Mg/ml): 0,2533g siarczanu (VI) magnezu (MgSO 4 7H 2 O) rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml i uzupełniono wodą do kreski. 6. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów potasu (100 µg K/ml; 100ppm K): 0,0223g siarczanu (VI) potasu rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml i uzupełniono wodą do kreski. 7. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów żelaza (II) (100µg Fe/ml; 100ppm Fe): 0,7020g siarczanu (VI) żelazowo (II) amonowego rozpuszczono w mieszaninie 4ml stężonego kwasu siarkowego (VI) i 20ml wody w kolbie miarowej o pojemności 100ml, uzupełniono wodą do kreski. 8. Podstawowy roztwór wzorcowy jonów ołowiu (II) (1mg Pb/ml): 0,1600g azotanu (V) ołowiu (II) rozpuszczono w kolbie miarowej o pojemności 100ml i uzupełniono wodą do kreski. Wykonanie oznaczenia: 3
W celu określenia obecności zanieczyszczeń w substancjach należy do wykalibrowanych probówek miarowych o pojemności 10ml odważyć po 0,05 g badanych preparatów i rozpuścić 5ml wody i analizować odpowiednio na zawartość zanieczyszczeń: azotanami, chlorkami, siarczanami (VI), fosforanami, solami amonowymi, jonami baru, magnezu, wapnia, potasu, żelaza (II) lub żelaza (III) i metalami ciężkimi. Określanie zanieczyszczeń azotanami (V) (jonami NO 3 ) 1. 1ml roztworu badanej próby przenieść do probówki, 2 krople stężonego kwasu solnego i ostrożnie nawarstwić 1ml roztworu difenyloaminy w kwasie siarkowym (VI) tak, aby obie warstwy częściowo się zmieszały; próbę pozostawić na 5 minut, 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 1ml wody jeżeli badany roztwór nie wykazuje zmian w porównaniu z 1ml próby porównawczej, do której dodano takie same ilości odczynników nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji azotanami (V) Określanie zanieczyszczeń chlorkami (jonami Cl ) 1. 4ml roztworu badanej próby przenieść do wykalibrowanej probówki i sprawdzić odczyn roztworu, 2. roztwór wykazujący odczyn zasadowy zobojętnić dodając kilka kropli kwasu azotowego o stężeniu 2mol/l, roztwór kwasowy dodając roztwór amoniaku o stężeniu 2mol/l, uzupełnić wodą do objętości 10ml, 3. dodać 0,25ml kwasu azotowego (V) o stężeniu 30% i 0,25ml roztworu azotanu (V) srebra o stężeniu 0,1mol/l; próbę pozostawić na 5 minut,* 4. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników jak w punkcie 3 do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 1ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,001 mg jonów chlorkowych; 1µg Cl/ml; 1ppm Cl jeżeli badany roztwór po 5 minutach nie wykazuje opalizacji intensywniejszej niż 1ml roztworu wzorcowego, do którego dodano takie same ilości odczynników nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji chlorkami. Cl + Ag + AgCl Określanie zanieczyszczeń siarczanami (VI) (jonami SO 4 2 ) 1. 4ml roztworu badanej próby przenieść do wykalibrowanej probówki i sprawdzić odczyn roztworu, 2. roztwór wykazujący odczyn zasadowy należy zobojętnić dodając kilka kropli kwasu solnego stężeniu 2mol/l, roztwór kwasowy dodając roztwór amoniaku o stężeniu 2mol/l, uzupełnić wodą do objętości 5ml, 3. do roztworu dodać 0,25ml kwasu solnego o stężeniu 10% i 0,5ml roztworu chlorku baru o stężeniu 10%; próbę pozostawić na 15 minut, * 4. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 0,5ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,005mg jonów siarczanowych; 5µg SO 4 /ml; 5ppm SO 4 jeżeli badany roztwór nie wykazuje zmętnienia intensywniejszego niż próba porównawcza nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji siarczanami (VI). SO 4 2 + Ba 2+ BaSO 4 Określanie zanieczyszczeń fosforanami (V) (jonami PO 4 3- ) 1. 5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki, dodać 1ml odczynnika sulfomolibdenianowego, wytrząsnąć 4
2. dodać 1 kroplę roztworu chlorku cyny (II) o stężeniu 0,25mol/l; próbę pozostawić na 10min. * 3. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 2,5ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,005mg jonów fosforanowych; 5µg PO 4 /ml; 5ppm PO 4 jeżeli zabarwienie roztworu badanego nie jest intensywniejsze niż zabarwienie próby porównawczej nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji fosforanami (V). *oznaczenie polega na reakcji jonów fosforanowych z molibdenianem amonu (NH 4 ) 2 MoO 4 w środowisku kwaśnym, w wyniku której powstaje fosforomolibdenian amonowy (NH 4 ) 3 P(Mo 3 O 10 ) 4. Kwas ten ulega redukcji pod wpływem chlorku cyny (II) tworząc związek kompleksowy - błękit molibdenowy o przybliżonym wzorze (NH 4 ) 3 P(Mo 3 O 7 ) o niebieskim zabarwieniu. Określanie zanieczyszczeń solami amonu (jonami NH 4 + ) 1. 1ml roztworu badanej próby przenieść do probówki i dodać 1ml roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 15%. 2. u wylotu probówki umieścić zwilżony papierek lakmusowy, probówkę na 5 minut umieścić w bloku grzewczym 3. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 1ml wody nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji solami amonowymi, jeżeli barwa papierka nie wykazuje zmiany większej niż barwa papierka umieszczonego w probówce zawierającej próbę porównawczą. 1. 5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki, dodać 5 kropli odczynnika Nesslera i zamieszać; próbę pozostawić na 5 min* 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 1ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,01mg jonów amonowych; 10µg NH 4 /ml; 10ppm NH 4 nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji solami amonowymi, jeżeli badany roztwór nie wykazuje zmian z próbą porównawczą. 2NH 4 + + 2[HgI 4 ] 2 + 4OH [OHg 2 NH 2 ]I + 7I + 3H 2 O Metoda III: 1. w probówce z korkiem umieścić 10 mg drobno sproszkowanej substancji badanej i rozpuścić lub zawiesić w 1ml wody destylowanej 2. dodać 0,1g tlenku magnezu 3. u wylotu probówki umieścić zwilżony wodą papierek srebrowo-manganowy i szczelnie zamknąć korkiem 4. probówkę ogrzewać w bloku grzewczym przez 30 min. w temperaturze 40 C 5. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 1ml roztworu wzorcowego jonów amonowych przygotowanego w metodzie II Określanie zanieczyszczeń jonami baru (Ba 2+ ) 1. 1ml roztworu badanej próby przenieść do probówki oraz dodać 0,5ml kwasu siarkowego (VI) o stężeniu 2mol/l, próbę pozostawić na 5 min* 5
2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 1ml wody; stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami baru. Ba 2+ + SO 4 2 BaSO 4 1. 2,5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki oraz dodać 1ml wody gipsowej (nasyconego roztworu siarczanu (VI) wapnia) i 0,1ml stężonego kwasu solnego; próbę pozostawić na 5 min.* 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 2,5ml wody stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami baru. Ba 2+ + CaSO 4 BaSO 4 + Ca 2+ Określanie zanieczyszczeń jonami magnezu (Mg 2+ ) 1. 2,5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki oraz dodać 4-6 kropli 8 hydroksychinoliny i 0,5ml amoniaku o stężeniu 2mol/l; próbę pozostawić na 5 min. * 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do mieszaniny 0,5ml roztworu wzorcowego i 2ml wody wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 1ml podstawowego roztworu wzorcowego siarczanu (VI) magnezu do kolby miarowej o pojemności 100ml, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,0025mg jonów magnezu; 2,5µg Mg/ml; 2,5ppm Mg stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami magnezu Mg 2+ + 2C 9 H 6 NOH (C 9 H 6 NO) 2 Mg + 2H + 1. 5ml roztworu badanego przenieść do probówki z korkiem, dodać 0,05g tetraboranu disodu 2. jeśli to konieczne, doprowadzić roztwór do ph = 9 używając w przypadku ph silnie zasadowego kwasu solnego o stężeniu 2mol/l, lub w przypadku roztworu kwaśnego lub obojetnego wodorotlenku sodu o stężeniu 2mol/l 3. wytrząsać 2-krotnie po 1 min z 2,5ml roztworu 8-hydroksychinoliny w chloroformie 4. probówkę odstawić do rozdzielenia faz, a następnie po rozdzieleniu faz odrzucić warstwę organiczną 5. do warstwy wodnej dodać 0,2ml n-butyloaminy i 1 kroplę trietanoloaminy 6. doprowadzić roztwór (jeśli to konieczne) do ph = 11 7. dodać 2ml roztworu 8-hydroksychinoliny w chloroformie, wytrząsać 1 min i pozostawić do rozdzielenia warstw 8. użyć dolnej warstwy do porównania* 9. przygotować wzorzec w ten sam sposób, używając mieszaniny 0,5ml roztworu wzorcowego magnezu i 4,5ml wody wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 4ml podstawowego roztworu wzorcowego siarczanu (VI) magnezu do kolby miarowej o pojemności 100ml; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,01mg jonów magnezu; 10µg Mg/ml; 10ppm Mg zabarwienie roztworu przygotowanego z substancji badanej nie może być intensywniejsze niż zabarwienie próby porównawczej. Mg 2+ + 2C 9 H 6 NOH (C 9 H 6 NO) 2 Mg + 2H + 6
Określanie zanieczyszczeń jonami wapnia (Ca 2+ ) 1. 5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki, dodać 0,5ml amoniaku o stężeniu 2mol/l i 1ml roztworu szczawianu amonowego o stężeniu 4%; próbę pozostawić na 10 minut* 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml wody. stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami wapnia Ca 2+ + C 2 O 4 2 CaC 2 O 4 Określanie zanieczyszczeń jonami potasu (K + ) 1. 1ml roztworu badanej próby przenieść do probówki z korkiem, dodać 1ml etanolu, 3 krople roztworu heksanitroilokobaltanu sodu, roztwór wytrząsać ok. 1 min. próbę pozostawić na 5 minut* 2. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 1ml wody; stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami potasu 2K + + Na + + [Co(NO 2 ) 6 ] 3 K 2 Na[Co(NO 2 ) 6 ] 1. 5ml roztworu badanej próby przenieść do probówki 2. dodać 1ml roztworu tetrafenyloboranu sodu (0,68%); próbę pozostawić na 5 minut* 3. wykonać próbę porównawczą dodając taką samą ilość odczynnika do 5ml roztworu wzorcowego potasu wykonanie roztworu wzorcowego: rozcieńczyć 10-krotnie roztwór podstawowy jonów potasu odmierzyć 10ml podstawowego roztworu jonów potasu do kolby miarowej o pojemności 100ml i uzupełnić wodą do kreski; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,01mg jonów potasu; 10µg K/ml; 10ppm K zabarwienie roztworu przygotowanego z substancji badanej nie może być intensywniejsze niż zabarwienie próby porównawczej K + + [B(C 6 H 5 ) 4 ] K[B(C 6 H 5 ) 4 ] Określanie zanieczyszczeń solami żelaza (jonami Fe 2+ i Fe 3+ ) 1. 4ml roztworu badanej próby przenieść do probówki, dodać 0,5ml stężonego kwasu solnego 2. w przypadku strącenia się osadu przesączyć do wykalibrowanej probówki i uzupełnić wodą do objętości 5ml 3. do roztworu dodać 2 krople nadtlenku wodoru o stężeniu 3%, roztwór wymieszać i odczekać 1 min 4. następnie dodać 1ml roztworu tiocyjanianu amonowego o stężeniu 10% i roztwór wymieszać; próbę pozostawić na 5 min. * 5. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 0,5ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml i uzupełnić wodą do kreski; 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,0005mg jonów żelaza; 0,5µg Fe/ml; 0,5ppm Fe stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami żelaza 7
*Podczas oznaczenia zachodzą reakcje: 2Fe 2+ + H 2 O 2 + 2H + 2Fe 3+ + 2H 2 O Fe 3+ + 6SCN Fe(SCN) 6 3 1. 5ml roztworu badanej próby przenieść do wykalibrowanej probówki 2. dodać 1 ml roztworu kwasu cytrynowego (100g/l) i 1 kroplę kwasu tioglikolowego, wymieszać 3. doprowadzić do odczynu zasadowego za pomocą 10% roztworu amoniaku (dodawać kroplami)* 4. uzupełnić wodą do 10ml; próbę pozostawić na 5 min. 5. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu wzorcowego wykonanie roztworu wzorcowego: odmierzyć 1ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby miarowej o pojemności 100ml i uzupełnić wodą do kreski; 1 ml roztworu wzorcowego zawiera 0,001mg jonów żelaza; 1µg Fe/ml; 1ppm Fe jeżeli różowe zabarwienie roztworu badanego nie jest intensywniejsze niż zabarwienie roztworu porównawczego nie stwierdza się zanieczyszczenia substancji jonami żelaza *jony żelaza tworzą z kwasem tioglikolowym w środowisku zasadowym fioletowe kompleksy Określanie zanieczyszczeń metalami ciężkimi (w przeliczeniu na Pb 2+ ) 1. do 5ml roztworu badanego dodać po 0,8 ml roztworu buforowego o ph = 3,5; wymieszać 2. dodać 0,5ml roztworu AKT, natychmiast wymieszać; obserwować roztwory po 2 min. * 3. wykonać próbę porównawczą dodając takie same ilości odczynników do 5ml roztworu porównawczego wykonać roztwór porównawczy zmieszać 5ml roztworu wzorcowego ołowiu [1µg Pb/ml] i 1ml roztworu substancji badanej; wykonanie roztworu wzorcowego ołowiu: odmierzyć 0,1ml podstawowego roztworu wzorcowego ołowiu do kolby miarowej o pojemności 100ml i uzupełnić wodą do kreski, 1ml roztworu wzorcowego zawiera 0,001mg jonów ołowiu; 1µg Pb/ml; 1ppm Pb 4. wykonać ślepą próbę dodając takie same ilości odczynników do mieszaniny 5ml wody i 1ml wodnego roztworu substancji badanej roztwór porównawczy wykazuje jasnobrunatne zabarwienie w porównaniu ze ślepą próbą; jeżeli brunatne zabarwienie roztworu badanego nie jest intensywniejsze niż zabarwienie roztworu porównawczego nie stwierdza się zanieczyszczenia metalami ciężkimi Pb 2+ + S 2 PbS 8