MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 107-113 Pranobeks inozyny - działanie cytotoksyczne oraz wpływ na replikację ludzkich wirusów paragrypy (HPIV-2, HPIV-4), enterowirusów (CA16, EV71) i adenowirusów (HAdV-2, HAdV-5) w badaniu in vitro Inosine pranobex - cytotoxic activities and effect of on replication of human parainfluenza viruses (HPIV-2, HPIV-4), entroviruses (CA16, EV71) and adenoviruses (HAdV-2, HAdV-5) in vitro Anna Majewska 1, Witold Lasek 2, Grażyna Młynarczyk 1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 Zakład Immunologii Centrum Biostruktury, Warszawski Uniwersytet Medyczny Pranobeks inozyny wykazuje aktywność przeciwwirusową, posiada również potwierdzone w badaniach in vitro i in vivo działanie immunomodulujące. W przeprowadzonym badaniu oceniono wpływ pranobeksu inozyny na redukcję mian zakaźnych wirusów chorobotwórczych dla człowieka (HPIV-2, HPIV-4, CA16, EV71, HAdV-2, HAdV-5). Adenowirusy (HAdV-2, HAdV-5) wykazały najwyższą wrażliwość na przeciwwirusowe działanie pranobeksu inozyny. Słowa kluczowe: adenowirusy, aktywność przeciwwirusowa, enterowirusy, pranobeks inozyny, wirusy paragrypy ABSTRACT Introduction: There are no specific antivirals designed for many viral infections. Inosine pranobex (PI) is a purine nucleoside that is involved in a wide variety of intracellular biochemical processes. The mechanism of action in human body is still unclear but numerous studies have demonstrated that this drug inhibits viral replication and exhibit pleiotropic effect. We evaluated in vitro effect of inosine pranobex (PI) on replication of human viruses: parainfluenza viruses (HPIV-2, HPIV-4), entroviruses A (CA16, EV71) and adenoviruses C (HAdV-2, HAdV-5). Materials and Methods: In the present study, cytotoxic effect of inosine pranobex was assessed using A549 cell line exposed to different concentrations of compound (PI: 50-800
108 A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk Nr 2 µg/ml) for 48 hours. Cytotoxic effect of inosine pranobex was assessed visually using light, inverted microscopy Olympus CK2 under 400x magnification and by the MTT colorimetric assay. Antiviral effect was estimated according to the reduction of virus titer. The yield reduction assay (YRA), which evaluates the ability of the PI (50-800 µg/ml) to inhibit virus multiplication in cell cultures, was applied. The cytopathic effect of the virus was evaluated 48 h after infection of A549 cell cultures with viruses by means of light, inverted microscopy. The Reed Muench statistical method was used to determine the 50% end point (IC50) (yield reduction assay, YRA) in the presence of inosine pranobex with the controlled one. Results: There were no morphological changes, as assessed visually, in cell cultures treated with PI. MTT cytotoxicity assay confirmed microscopic observations. The viability of cells in the presence of the tested compounds was average 98, 36 %. After conducting the experiments and analyzing the results we noticed that higher concentrations of PI strongly inhibited multiplication of all viruses. PI weakly reduced the titer of infectious enteroviruses and HPIV-4 as compared with the control. Adenoviruses showed the highest sensitivity to the antiviral activity of PI, however, increasing concentrations of PI up to 800 µg /ml slightly enhanced the antiviral activity of 400 µg/ml PI. Conclusions: Our study demonstrated that inosine pranobex shows no cytotoxic activity on the A549 cell line. In conducted study was observed that adenoviruses (HAdV-2 and HAdV-5) and HPIV-2 have the highest sensitivity to the antiviral activity of inosine pranobex from all tested viral strains. Keywords: adenoviruses, antiviral activity, enteroviruses, inosine pranobex, parainfluenza viruses WSTĘP Pomimo faktu, że obecnie dostępnych jest około 60 leków przeciwwirusowych, blisko połowa z nich zarejestrowana jest do leczenia zakażeń HIV. Pozostałe wykorzystywane są w terapii wirusowego zapalenia wątroby (HBV, HCV), zakażeń spowodowanych ludzkimi herpeswirusami i wirusami grypy. Nadal brakuje możliwości kontrolowania wielu istotnych klinicznie i epidemiologicznie zakażeń wirusowych (3). Infekcje wywołane przez enterowirusy, adenowirusy czy wirusy paragrypy to powszechnie występujące, zwykle łagodne, samoograniczające się zakażenia. U pacjentów z supresją układu odpornościowego mogą być jednak przyczyną poważnych komplikacji. Adenowirusy zakażają pierwotnie lub ulegają reaktywacji u 20-50% osób z immunosupresją, powodując zakażenia narządowe lub uogólnione (19). Enterowirusy, u osób należących do skrajnych grup wiekowych oraz z osłabioną odpornością są etiologicznie związane z neuroinfekcjami, zapaleniem mięśnia sercowego, zakażeniem górnych i dolnych dróg oddechowych (18). Wirusy paragrypy, w sytuacji osłabionych mechanizmów odporności organizmu powodują ostre zapalenie płuc, wymagające sztucznej wentylacji i w części przypadków (5-35%) skutkujące zgonem (2, 12). Żaden z dotychczas znanych preparatów przeciwwirusowych nie posiada rejestracji do leczenia zakażeń wymienionymi wirusami. W piśmiennictwie opisywane są wprawdzie przypadki zastosowania u pacjentów z upośle-
Nr 2 Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów 109 dzoną funkcją układu odpornościowego, pantropowo działających, jednak toksycznych dla człowieka: cidofowiru i rybawiryny, jednak bez terapeutycznego powodzenia w większości przypadków (12, 20, 21, 23). Pranobeks inozyny (PI; synonimy: isoprinosine, methisoprinol, inosinex, immunovir) jest kompleksem inozyny, p-acetamidobenzoesanu i diamidopropanolu lekiem należącym do grupy farmaceutyków przeciwwirusowych ogólnego zastosowania (11). PI oprócz aktywności przeciwwirusowej posiada potwierdzone zarówno w badaniach in vitro, jak i w próbach klinicznych, działanie immunomodulujące (5, 6, 14). Mechanizm działania PI nie został w pełni wyjaśniony. Prawdopodobnie związek ten bierze udział w hamowaniu syntezy wirusowego RNA. Stymuluje układ odpornościowy wpływając na dojrzewanie oraz aktywację limfocytów. W licznych badaniach (in vitro i in vivo) wykazano, że PI zwiększa wytwarzanie cytokin, takich jak interleukina 1 (IL-1) i interleukina 2 (IL-2), interleukina 12 (IL-12), TNF- α i interferonu γ (IFN-γ), hamuje wytwarzanie IL-10, nasila działanie cytotoksyczne komórek NK (natural killer) oraz pobudza chemotaksję i fagocytozę (1, 4, 5, 8, 14). Celem badania była ocena działania pranobeksu inozyny na replikację wirusów paragrypy (ludzki wirus paragrypy 2; HPIV-2, ludzki wirus paragrypy 4; HPIV-4), entrowirusów A (wirus Coxsackie A16; CA16 i enterowirus 71; EV71) oraz ludzkich adenowirusów C (ludzki adenowirus 2; HAdV-2 i ludzki adenowirus 5; HAdV-5) w warunkach in vitro. MATERIAŁ I METODY Pranobeks inozyny (Gedeon Richter, Polska) w dawce 5,0 mg zawieszono w 5,0 ml PBS (zbuforowany fizjologiczny roztwór soli, ph 6,9), filtrowano przy użyciu filtra miliporowego (Millex-FG Filter Unit, 0,2 µm). Przygotowano stężenia: 50-800 µg/ml, których działanie cytotoksyczne i przeciwwirusowe oceniano w badaniu. Jako rozpuszczalnika użyto podłoża hodowlanego (DMEM; Biological Industries, Israel). Oceniano wpływ PI na redukcję mian zakaźnych klinicznych szczepów wirusów (z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej) chorobotwórczych dla człowieka. W badaniu wykorzystano wirusy RNA: paragrypy (ludzki wirus paragrypy 2; HPIV-2, ludzki wirus paragrypy 4; HPIV-4), entrowirusy A (wirus Coxsackie A16; CA16, enterowirus 71; EV71) oraz ludzkie adenowirusy C: 2 (HAdV-2) i 5 (HAdV-5), należące do wirusów DNA. Wirusy namnażano w linii komórkowej A549 (komórki nowotworowe wywodzące się z nabłonka płuc człowieka, ATCC CCL -185 TM ). Komórki hodowano w pożywce zawierającej 10% surowicy płodowej cielęcej (Fetal bovine serum, FBS; Biological Industries, Israel) oraz 1% mieszaniny antybiotyków i antymikotyku w temperaturze 37 C, w atmosferze 5% CO 2. Do namnażania wirusów, oceny cytotoksyczności oraz działania przeciwwirusowego używano pożywki płynnej o zredukowanym do 2% stężeniu FBS. Badanie cytotoksyczności PI w hodowli A549 zostało przeprowadzone metodą jakościową przy użyciu mikroskopu optycznego odwróconego (OLYMPUS CK2), obraz powiększono 400x oraz metodą ilościową z wykorzystaniem testu redukcji soli tetrazolowej w mitochondriach komórek, MTT Cell Proliferation Assay (ATCC bioproducts, USA). Metoda jakościowa polegała na obserwacji morfologii komórek. Podstawą testu ilościo-
110 A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk Nr 2 wego było przekształcenie soli tetrazolowych MTT (bromku 3[4,5-dimetylo-2-ilo]-2,5- -difenylotetrazolu) do formazanu (15). W badaniu aktywności przeciwwirusowej komórki A549 (1x10 5 komórek/ml) zakażano w odrębnych eksperymentach każdym z wirusów w dawce 100 TCID 50/ml (Tissue Culture Infectious Dose). Po 60 min. inkubacji wirusów z komórkami osadzonymi w mikropłytkach (w objętości 0,2 ml w płytkach 96-studzienkowych płaskodennych, MEDLAB-PRODUCTS, Polska) niezwiązane z komórkami wirusy usunięto, dwukrotnie płucząc jałowym roztworem PBS. Następnie do komórek dodawano PI w stężeniach od 50 do 800 µg/ml w pożywce płynnej DMEM lub dodawano pożywkę bez dodatku PI (kontrola). Czas ekspozycji wynosił 48 godz. Następnie mikropłytki z hodowlami komórkowymi zamrażano i rozmrażano trzykrotnie (w celu uwolnienia wirusów z komórek), wirowano przez 10 minut (3000 rpm, temp. 4ºC). Supernatant wykorzystano do oceny miana wirusów według metody Reeda-Muencha (17). Miano zakaźne wyrażono w TCID 50/ml. Każde badanie wykonano w trzech powtórzeniach. Wyniki oceniano statystycznie z wykorzystaniem metody korelacji Pearsona (r-pearsona) do pomiaru zależności pomiędzy dawkami PI, a mianem wirusów. Wartość współczynnika korelacji w zakresie od 0,4-0,7 interpretowano jako zależność umiarkowaną, 0,7-0,9 zależność znaczącą, powyżej 0,9 jako bardzo silną zależność. Istotność współczynnika korelacji oceniano za pomocą dwustronnego testu istotności dla małych próbek (t-studenta) (7). WYNIKI Nie stwierdzono działania toksycznego pranobeksu inozyny w stężeniach od 50 do 800 µg/ml na hodowlę komórek A549 zarówno w badaniu mikroskopowym jak i metodą MTT. Żywotność komórek eksponowanych na PI wynosiła 96,70-99,90% (średnio 98,36%). Uzyskane wyniki z trzech serii eksperymentów poddano analizie statystycznej. Test Shapiro-Wilka wykazał rozkład normalny, a test Bartlett a brak istotności różnic wariancji (P<0,05). Ponieważ przeżywalność komórek była tak wysoka nie wyznaczano wartości CC 50 (CC - stężenie cytotoksyczne dla 50% komórek), nie obliczano również wartości SI indeksu selektywności (stosunek CC 50 do IC 50 ). Na rycinie 1. przedstawiono zakaźne miana badanych enterowirusów, wirusów paragrypy i adenowirusów redukowane pod wpływem działania różnych dawek pranobeksu inozyny. W prowadzonym badaniu zaobserwowano, że wyższe stężenia PI silniej redukują miano zakaźne badanych wirusów. Analizując współczynnik korelacji Pearsona wykazano znaczącą (P<0,05) zależność zakaźnego miana EV-71 i HPIV-4 od dawki PI w hodowlach A549. Podobnie, wysoki współczynnik korelacji (jednak nie istotny statystycznie) obliczono dla pozostałych wirusów RNA: CA-16 i HPIV-2. PI najsilniej redukował miana zakaźne HAdV-2 i HAdV-5 w stosunku do kontroli (średnio redukcja mian wyniosła odpowiednio 1,68log 10 i 1,86 log 10 TCID 50/ml ) jednak zwiększenie stężenia PI do 800 µg/ml nieznacznie wzmocniło przeciwwirusowe działanie 400 µg/ml PI. DYSKUSJA Wirusy Coxsackie A opisano po raz pierwszy pod koniec lat 40 XX w. Doniesienia o wirusach paragrypy oraz ludzkich adenowirusach pojawiły się w latach 50 zeszłego stulecia.
Nr 2 Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów 111 *P<0,05 dla EV-71 i HPIV-4, P>0,05 dla CA-16, HIPV-2, HAdV-2 i HAdV-5 Ryc. 1. Redukcja zakaźnych mian badanych enterowirusów, wirusów paragrypy i adenowirusów pod wpływem różnych dawek pranobeksu inozyny (PI) w hodowli komórek A549 in vitro. Kilkanaście lat później (1969 r.) wykryto enterowirusa 71. Pomimo, że patogeny te znane są od kilkudziesięciu lat i wiadomym jest, że zakażenia przez nie wywoływane występują powszechnie w populacji, a u pacjentów z obniżoną odpornością mogą być przyczyną poważnych komplikacji, nie ma możliwości swoistej profilaktyki ani leczenia przyczynowego tych zakażeń. Nisza istniejąca w tej dziedzinie, ze względu na realną potrzebę, budzi zainteresowanie wielu badaczy (9, 16, 23). Pranobeks inozyny wykazuje aktywność przeciwwirusową, posiada również potwierdzone działanie immunomodulujące (5, 6, 14). Jego skuteczność została opisana w randomizowanych i podwójnie zaślepionych badaniach klinicznych. Deroń analizując wyniki eksperymentów Ginsberga i wsp. potwierdza dobrą tolerancję leku w makroorganizmie. PI po osiągnięciu wysokiego stężenia w tkankach metabolizowany jest do kwasu moczowego i całkowicie eliminowany drogą nerek (4). W przeprowadzonym badaniu wykazano, że pranobeks inozyny nie wykazuje działania cytotoksycznego wobec komórek A549. PI w dawce 800 µg/ml również nie zmienia morfologii i nie zaburza aktywności biologicznej (w badaniu metodą MTT) komórek linii HEp-2 and HEL 299 (9). Oceniając wpływ pranobeksu na replikację wirusów paragrypy, entrowirusów i oraz adenowirusów wykazano, że PI po 48 godz. ekspozycji w zakażonych wirusami komórkach A549 zredukował zakaźne miano wszystkich wirusów w stosunku do kontroli. PI najsłabiej (o 1.00 log 10 TCID 50/ml ) zredukował zakaźne miano enterowirusów. W piśmiennictwie brak jest danych na temat skuteczności PI w hamowaniu namnażania ludzkich enterowirusów in vitro. Badano wprawdzie skuteczność leku w zakażeniach wywołanych przez rinowirusy, jednak nie została ona potwierdzona klinicznie (13, 22). Zgodnie z naszą wiedzą, brak jest
112 A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk Nr 2 także doniesień na temat przeciwwirusowej aktywności PI w hodowlach komórkowych zakażonych wirusami paragrypy. W prowadzonym eksperymencie zaobserwowano redukcję miana zakaźnego HPIV-2 o 1,30 log 10 TCID 50/ml i HPIV-4 o 1,19 log 10 TCID 50/ml. Wykazano również, że adenowirusy (HAdV-2, HAdV-5) cechują się najwyższą wrażliwością na przeciwwirusowe działanie pranobeksu inozyny spośród wszystkich wykorzystanych w badaniu szczepów wirusów. W prowadzonych wcześniej w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej WUM eksperymentach in vitro wykazano, że PI jeszcze silniej redukuje zakaźne miana adenowirusów w obecności interferonu-α (IFN-α). Jednoczesne dodanie do zakażonych adenowirusami komórek A549 2000 IU/mL IFN-α i PI skutkowało redukcją wartości IC 50 (medialne stężenie inhibitora hamujące w 50 % miano zakaźne) z 1965,4 µg/ml i 1467,8 µg/ml do 963,2 µg/ml i 694,8 µg/ml dla odpowiednio, HAdV-2 i HAdV-5 (9). Wzmocnienie działania pranobeksu inozyny w obecności INF-α wykazano również wobec referencyjnego szczepu HHV-1 McIntyre (10). Okazuje się także, że jednoczesne podanie IFN-α i PI powoduje poprawę kondycji neurologicznej pacjentów z podostrym stwardniającym zapaleniem mózgu (powikłanie po zakażeniu wirusem świnki) oraz wspomaga konwencjonalne metody leczenia miejscowych zakażeń wywołanych przez ludzkie wirusy brodawczaka (HPV) (1, 4, 11). Z powodu ograniczonej możliwości kontrolowania wielu zakażeń wirusowych wydaje się zasadne wykonanie kolejnych eksperymentów celem potwierdzenia skuteczności pranobeksu inozyny w hamowaniu replikacji ważnych klinicznie lub epidemiologicznie wirusów chorobotwórczych dla człowieka. PIŚMIENNICTWO 1. Campoli-Richards DM, Sorkin EM, Heel RC. Inosine pranobex. A preliminary review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy. Drugs 1986; 32: 383-424. 2. Chemaly RF, Hanmod SS, Rathod DB i inni. The characteristics and outcomes of parainfluenza virus infections in 200 patients with leukemia or recipients of hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2012; 119: 2738-45. 3. De Clercq E. Antivirals: past, present and future. Biochem Pharmacol 2013; 15, 85(6): 727-44. 4. Deroń Z. Izopirnozyna - lek o działaniu przeciwwirusowym i immunomodulacyjnym. Wiad Lek 1984; 17: 1355-61. 5. Gołębiowska-Wawrzyniak M, Markiewicz K, Kozar A i inni. Immunologiczne i kliniczne badania nad przydatnością terapeutyczną inozyny pranobeks. Pol Merkur Lekarski 2005; 19: 379-82. 6. Gołębiowska-Wawrzyniak M, Markiewicz K, Kozar A i inni. The study on therapeutic efficacy of inosine pranobex in children. Pol J Food Nutr Sci 2004; 13, 54: 33 6. 7. Kośny M, Peternek P. Wielkość próby a istotność wnioskowania statystycznego. Didactics of mathematic 2011; 8: 71-80. 8. Lasek W, Jayst, M, Wolny R i inni. Immunomodulatory effects of inosine pranobex on cytokine production by human lymphocytes. Acta Pharm 2015; 65: 171-180. 9. Majewska A, Lasek W, Janyst M i inni. In vitro inhibition of HHV-1 replication by inosine pranobex and interferon- α. Acta. Pol. Pharm. Drug Res 2016; 2 (w druku). 10. Majewska A, Lasek W, Janyst M i inni. Anti-adenoviral effect of inosine pranobex and interferon-α in vitro. 25th Annual Meeting of the Society for Virology. Bochum, 18 21 March 2015. 11. Mohamed TA. Validated analytical method development of inosine pranobex in drug products by thin layer chromatography. SJAC 2014; 2: 59-66.
Nr 2 Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów 113 12. Moss RB, Steigbigel RT, Sanders RL, Fang F. Perspective: Emerging Challenges in the Treatment of Influenza and Parainfluenza in Transplant Patients. Adv Virol 2011, ID 910930, doi:10.1155/2011/910930. 13. Pachuta DM, Togo Y, Hornick RB i inni. Evaluation of isoprinosine in experimental human rhinovirus infection. Antimicrob Agents Chemother 1974; 5: 403-8. 14. Petrova M, Jelev D, Ivanova A, Krastev Z. Isoprinosine affects serum cytokine levels in healthy adults. J Interferon Cytokine Res 2010; 30 (4):223-8. 15. Pranczyk J, Jacewicz D, Wyrzykowski D, Chmurzynski L. Platinum(II) and Palladium(II) Complex Compounds as Anti-cancer Drugs. Methods of Cytotoxicity Determination. Curr Pharm Anal 2015; 10, 2-9. 16. Przybylski M, Borysowski J, Jakubowska-Zahorska R i inni. T4 bacteriophage-mediated inhibition of adsorption and replication of human adenovirus in vitro. Future Microbiol 2015; 4, 10, 453-60. 17. Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints, Am. J. Epidemiol 1938; 27(3): 493-7. 18. Rhoades RE, Tabor-Godwin JM, Tsueng G, Feuer R. Enterovirus Infections of the Central Nervous System Review. Virology 2011; 411: 288-305. 19. Rynans S, Dzieciątkowski T, Młynarczyk G. Adenovirus infection in immunocompromised patients. Postepy Hig Med Dosw 2013; 11:964-72. 20. Tan CW, Chan YF, Sim KM i inni. Inhibition of Enterovirus 71 (EV-71) infections by a novel antiviral peptide derived from EV-71 capsid protein VP1. PLoS ONE 2012; 7: e34589. doi:10.1371/ journal.pone.0034589. 21. Tan CW, Lai JKF, Sam I-C, ChanYF. Recent developments in antiviral agents against enterovirus 71 infection. J Biomed Sci 2014; 21:14 doi:10.1186/1423-0127-21-14. 22. Waldman RH, Ganguly R. Therapeutic efficacy of inosiplex (Isoprinosine) in rhinovirus infection. Ann N Y Acad Sci 1977: 4; 284:153-60. 23. Waye MMY, Sing CW. Anti-Viral Drugs for Human Adenoviruses. Pharmaceuticals 2010; 3(10): 3343-54. Otrzymano: 12 VI 2015 r. Adres Autora: 02-091 Warszawa, ul. Żwirki i Wigury 61, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny