Fenotypowa i genotypowa charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych stosowanych w produktach leczniczych

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 47-56 Fenotypowa i genotypowa charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych stosowanych w produktach leczniczych Phenotypic and genotypic characterization of probiotic bacterial strains used in medicinal products Aldona Wiatrzyk, Maciej Polak, Urszula Czajka, Katarzyna Krysztopa-Grzybowska, Anna Lutyńska Zakład Badania Surowic i Szczepionek, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny W pracy ocenie poddano wybrane właściwości szczepów drobnoustrojów określanych jako probiotyki tj. tożsamość, ogólna liczba bakterii oraz wrażliwość na antybiotyki z zastosowaniem opracowanych i zoptymalizowanych procedur badań. Wyniki doświadczeń potwierdziły zgodność badanych właściwości bakterii z deklarowanymi parametrami podanymi na opakowaniu produktu probiotycznego oraz umożliwiły identyfikację ich wrażliwości na antybiotyki. Opracowane metody badań mogą zostać zastosowane do rutynowego monitorowania cech drobnoustrojów probiotycznych suplementów diety oraz środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego zawierających probiotyki. Słowa kluczowe: probiotyki, lekooporność, rep-pcr, aktywność ABSTRACT Introduction: The optimization of quality testing strategy of products containing probiotics might allow to general improvement of its safer use in humans. The goal of the study was the evaluation of quality expressed by identity, colony forming unit (CFU) and antibiotic sensitivity of probiotics used in medicinal products available in Poland using the appropriate and validated procedures. Methods: The medicinal products containing L. rhamnosus, L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus and B. animalis subsp. lactis, L. helveticus, and L. gasseri were tested for species identity performed with validated rep-pcr (BOXA1R) method. The antimicrobial susceptibility of working seeds and strains isolated to 26 antibiotics were tested by disk diffusion and E-test methods using relevant references as recommended by EUCAST. The numbers of probiotic strains, expressed as cfu count per package, was done using plating plunge method.

48 A. Wiatrzyk i inni Nr 1 Results: All strains tested, except B. lactis, were found to be resistant to trimethoprim- -sulphamethoxazole, nalidixic acid, metronidazole, and colistin. B. lactis was resistant to aminoglycosides. L. rhamnosus strains were found to be resistant to vancomycin, (MIC >256μg/ml) similarly to ATCC strains (L. rhamnosus GG 53103 and 244). The sensitivity to other antibiotics was strain specific. The rep-pcr method was found species and strain specific. All products tested fulfilled declared countent as measured by cfu count/package. Conclusions: Quality of medicinal products containing probiotics was found undoubted and confirmed. The optimized strategy of quality monitoring of probiotics used in medicinal products can be used in dietary supplements and foodstuffs intended for particular nutritional uses. Key words: probiotics, antimicrobial resistance, rep-pcr, activity WSTĘP W ostatnich latach w Polsce i na całym świecie wzrosło zainteresowanie substancjami biologicznie aktywnymi o potencjalnie korzystnym wpływie na organizm i zdrowie pacjenta lub konsumenta. Wśród szerokiej gamy tych substancji, obejmującej witaminy czy składniki mineralne, znajdują się wyselekcjonowane szczepy drobnoustrojów probiotycznych. Zgodnie z definicją przyjętą przez Grupę Ekspercką Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), obowiązującą od 2002 r. terminem tym określa się mikroorganizmy, które spożyte w odpowiedniej dawce wywierają prozdrowotne korzyści, przy czym efekt ten powinien zostać udokumentowany wynikami badań (9). Należą do nich mikroorganizmy zaliczane do 11 gatunków bakterii, 3 gatunków drożdży i 1 gatunku pleśni (23). W Polsce, w zależności od wskazań, drobnoustroje probiotyczne stosowane są u ludzi w postaci produktów leczniczych, suplementów diety i dietetycznych środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego. Analizy jakościowe produktów probiotycznych w zakresie identyfikacji szczepu, deklarowanej liczby drobnoustrojów przypadających na dawkę oraz wyboru skutecznej dawki i częstotliwości dawkowania, przeprowadzone w innych krajach, niejednokrotnie wykazywały niezgodność z opisem deklarowanym na opakowaniu produktu (2, 5, 6, 8). W związku z dynamicznym rozwojem rynku probiotyków oraz doniesieniami naukowymi i medialnymi potwierdzającymi częsty brak spełniania wymogów jakościowych przez szereg komercyjnie dostępnych produktów, istnieje uzasadniona konieczność opracowania zwalidowanych metod i ich rutynowego zastosowania do monitorowania bezpieczeństwa tego typu produktów. Pomimo zaliczania tych drobnoustrojów jako GRAS (Generally Recognised as Safe) tj. jako powszechnie uznane za bezpieczne, opracowanie zoptymalizowanych procedur kontroli szczepów probiotycznych jest także uzasadnione coraz częściej opisywanymi w literaturze fachowej, przypadkami zakażeń, których przyczyną są szczepy probiotyczne po spożyciu komercyjnie dostępnych produktów probiotycznych różnych kategorii (11,12, 14, 25). Badania przeprowadzone w okresie 5 lat przez Gouriet a F. i wsp. (4) wskazują, że wśród gatunków z rodzaju Lactobacillus wyizolowanych z krwi pacjentów, L. rhamno-

Nr 1 Charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych 49 sus najczęściej wywoływał bakteriemię. Pomimo, że FAO/WHO z 2002r. (9) przedstawia schemat badań jakim powinny podlegać szczepy probiotyczne, niewielu wytwórców może przedstawić wiarygodne dane potwierdzające odpowiedni poziom bezpieczeństwa wyrażony m.in. wynikami badań patogenności, zjadliwości dla zwierząt i ludzi, szczególnie dla osób z upośledzoną odpornością. W wielu przypadkach nie respektowano nawet podstawowych zaleceń WHO/FAO dotyczących identyfikowania szczepu probiotycznego z zastosowaniem metod molekularnych zgodnie z aktualnym stanem wiedzy. Właściwa identyfikacja szczepu metodami genetycznymi, stanowi podstawę wykonania badań rozwojowych: in vitro lub in vivo u zwierząt oraz klinicznych u ludzi w celu udokumentowania prozdrowotnych właściwości konkretnego szczepu oraz weryfikacji wskazań na potrzeby rejestracji (15). W Polsce liczba produktów leczniczych, dla których zgodnie z wymaganiami instytucji odpowiedzialnych za rejestrację potwierdzono skuteczność i bezpieczeństwo, jest niewielka w stosunku do liczby produktów probiotycznych innych kategorii stosowanych u ludzi. Zostały one opracowane i wprowadzone do obrotu, stosunkowo dawno, kiedy dostępność metod genetycznych nie była powszechna. Metody konwencjonalnej mikrobiologii ze względu na wysoki stopień wewnątrzgatunkowej zmienności fenotypowej probiotyków są niewystarczające do rzetelnej identyfikacji szczepów probiotycznych. Stosowanie metod o niskiej rozdzielczości, w tym nieodpowiednio wybranych metod genotypowych stanowi podstawową przyczynę błędów w oznakowaniu tych szczepów. Problemy identyfikacji wynikają także z wysokiej heterogenności drobnoustrojów probiotycznych, wpływającej na dynamiczną zmieniającą się klasyfikację taksonomiczną, co wynika z szerokiego zakresu zawartości zasad G+C u poszczególnych gatunków (np. aż 33-55% dla przedstawicieli Lactobacillus) (22). Dane z piśmiennictwa wskazują, że wiarygodną identyfikację drobnoustrojów probiotycznych na poziomie gatunku oraz szczepu, dobraną odpowiednio w zależności od genetycznej zmienności danego taksonu, można uzyskać stosując sekwencjonowanie genów szlaku metabolizmu podstawowego, hybrydyzację, elektroforezę w zmiennym polu pulsacyjnym (PFGE- Pulsed Field Gel Electrophoresis), AFLP (Amplified Fragment Lengh Polymorphism) oraz warianty łańcuchowej reakcji polimerazowej (PCR- Polymerase Chain Reaction) np. (rep)-pcr), które mogą być wysoko przydatne do identyfikacji różnych grup taksonomicznych drobnoustrojów probiotycznych na poziomie gatunku lub szczepu (17). Celem pracy była weryfikacja podstawowych parametrów jakościowych dostępnych na rynku produktów leczniczych zawierających probiotyki tj. tożsamości, ogólnej liczby drobnoustrojów probiotycznych oraz wrażliwości na antybiotyki z zastosowaniem opracowanych i zoptymalizowanych procedur badań. MATERIAŁ I METODY Szczepy i warunki hodowli. Materiał do badań stanowiły bakterie probiotyczne wyizolowane z produktów leczniczych i z serii siewnych wchodzących w skład produktów leczniczych: Lakcid i Lakcid forte (L. rhamnosus Pen, Oxy, E/N), Lakcid L (L. rhamnosus 573/L/1, 573/L/2, 573/L/3), Trilac (L. acidophilus La-5, L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lb-Y-27, Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12), Lacidofil (L. helveticus R0052, L. rhamnosus R00110), EcoVag (L. rhamnosus DSM 14870, L. gaserii DSM 14869) oraz ww. produkty lecznicze. Jako referencyjne materiały odniesienia zastosowano szczepy: B. ani-

50 A. Wiatrzyk i inni Nr 1 malis subsp. lactis DSM 10140, L. paracasei subsp. paracasei DSM 5622, L. casei DSM 20011, L. acidophilus PCM 2510, L. plantarum PCM 2675, L. delbrueckii subsp. lactis PCM 2583, L. delbrueckii subsp bulgaricus DSM 20081, L. gasseri PCM 2500, L. helveticus DSM 20075, L. rhamnosus GG ATCC 53103, L. rhamnosus ATCC 244, L. rhamnosus PCM 492. Liofilizaty po rozpuszczeniu w jałowym roztworze chlorku sodu wysiewano na podłoże De Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Oxoid). Płytki inkubowano w warunkach beztlenowych, w temp. 37 C. Ogólna liczba bakterii probiotycznych w produktach. Liczbę bakterii probiotycznych (CFU - colony forming unit) oznaczono metodą posiewu wgłębnego na podłożu MRS. W tym celu, wykonano szereg 10-krotnych rozcieńczeń badanych produktów w podłożu bulion MRS. Z wybranych rozcieńczeń (10-7 10-9 ) przenoszono 1 ml zawiesiny na płytki Petriego i pokrywano 12-15 ml upłynnionego agaru MRS o temperaturze około 45 C. Użyto po 2 płytki na każde rozcieńczenie i inkubowano w temperaturze 37 C przez 72 godziny w warunkach beztlenowych. Wynik przeliczono na liczbę CFU w kapsułce, ampułce lub fiolce, w zależności od sposobu konfekcjonowania preparatu. Tożsamość bakterii probiotycznych. Rep-PCR. Izolację bakteryjnego DNA ze szczepów badanych oraz produktów leczniczych przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA). Amplifikację wykonano zgodnie z procedurą opisaną przez Coudeyas i wsp. (3) z niewielkimi modyfikacjami: do przygotowania mieszaniny reakcyjnej użyto: 50 ng DNA, 1 PCR buforu, 1,5 U AccuTaq-LA DNA polimerazy (Sigma), 200 μm dntp (Promega), 1,5 μm startera BOXA1R oraz 2 mm MgCl 2. Próbki poddano amplifikacji w następujących warunkach temperaturowych: wstępna denaturacja: 94 C/5 min, a następnie 35 cykli złożonych z denaturacji: 94 C/30 s, przyłączania starterów: 50 C/1 min, wydłużania starterów: 72 C/4 min oraz ich końcowego wydłużania: 72 C/7 min. Otrzymane produkty rozdzielano w 1,5% żelu agarozowym, a uzyskane wyniki analizowano przy użyciu programu BioNumerics (metoda klasteryzacji UPGMA, współczynnik korelacji Pearson a). Tożsamość produktów probiotycznych określano przez porównanie profili amplifikacji rep-pcr prób odniesienia, otrzymanych z mieszaniny DNA wszystkich szczepów wchodzących w skład danego preparatu z profilami charakterystycznymi dla badanego produktu leczniczego, uzyskanymi z DNA wyizolowanego z hodowli tego produktu na podłożu MRS. Przyjęto, że preparat spełnia wymagania tożsamości jeżeli porównywane profile wykazują minimum 90% podobieństwa. Lekowrażliwość. Wrażliwość bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki oznaczono metodą dyfuzyjno-krążkową oraz przez wyznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) przy użyciu pasków nasączonych gradientem stężeń antybiotyku (E-testy, Oxoid) na podłożu MRS. W badaniach użyto następujących krążków: penicylina (P 10 IU), ampicylina (AM 10 μg), amoksycylina (AMC 25 μg), piperacylina (PRL100 μg), cefuroksym (CXM 30 μg), cefotaksym (CTX 30 μg), ceftazydym (CAZ 30 μg), imipenem (IPM 10 μg), meropenem (MEM 10 μg), gentamycyna (GM 10 μg), neomycyna (N 30 μg), netylmycyna (NET 30 μg), tobramycyna (NN 10 μg), streptomycyna (S 10 μg), erytromycyna (E 15 μg), wankomycyna (VA 30 μg), doksycyklina (D 30 μg), trimetoprim-sulfametaksazol (SXT 1,25+23,75 μg), kwas nalidyksowy (NA 30 μg), klindamycyna (CC 2), kolistyna (CT 50 μg), metronidazol (MET 5 μg), teikoplanina (TEC 30 μg), cefradyna (CE 30 μg), cefepim (FEP 30 μg), kloksacylina (OB 5 μg) oraz następujące E-testy: amoksycylina(0,015-256 μg/ml), cefotaksym (0,002-32μg/ml), gentamycyna (0,015-256 μg/ml), metronidazol (0,015-256

Nr 1 Charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych 51 μg/ml), erytromycyna (0,015-256 μg/ml), wankomycyna (0,015-256 μg/ml), tetracyklina (0,015-256 μg/ml). Ze szczepów drugiego pasażu na podłożu MRS ożywionych ze stanu głębokiego zamrożenia (temp. -70 C) po 48-72 godz. inkubacji sporządzono zawiesinę w 0,9% NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Posiew i nakładanie krążków wykonano zgodnie z zaleceniami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (24). Strefy zahamowania wzrostu mierzono po 48 godz. inkubacji bakterii na podłożu MRS w temp. 37 C, w atmosferze beztlenowej. Doświadczenia wykonano w dwóch powtórzeniach. W celu kontroli poprawności wykonywanych badań stosowano szczepy referencyjne: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212. Wartości MIC oceniano zgodnie z zaleceniami EFSA (19). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wykonane badania pozwoliły na wykazanie zgodności otrzymanych wyników tożsamości i ogólnej ilości bakterii probiotycznych z wartościami deklarowanymi na opakowaniu produktu oraz profili wrażliwości na antybiotyki szczepów probiotycznych wyizolowanych z produktów z profilami odpowiednich serii siewnych. Zastosowana metoda badania tożsamości polegała na określeniu genetycznego profilu badanego szczepu, którego swoistość oraz powtarzalność różnicowania gatunkowego oraz wewnątrzgatunkowego została potwierdzona w badaniach walidacyjnych. Technika rep-pcr z zastosowaniem startera BOXA1R, pozwoliła uzyskać profile składające się z 6-19 produktów amplifikacji o wielkości 0,25-10 kpz. Szczepy probiotyczne wyizolowane z serii siewnych wykazywały identyczne profile amplifikacji z profilami uzyskanymi ze szczepów wyizolowanych z produktów probiotycznych. Otrzymane profile były gatunkowo i szczepowo - swoiste dla wszystkich badanych izolatów (Ryc. 1). Z kolei w przypadku preparatów zawierających kilka gatunków bakterii, profile genotypowania zawierały gatunkowo-swoiste produkty amplifikacji obecne w profilach charakteryzujących odpowiadające im szczepy siewne. W przypadku produktów leczniczych Lakcid i Lakcid L, 3 szczepy L. rhamnosus stanowiące substancje czynne (odpowiednio 573L/1, 573L/2 i 573L/3 oraz PEN, OXY i E/N) wykazywały wysoki stopień podobieństwa genetycznego, ponieważ stanowią izolaty pochodne wyselekcjonowane w wyniku pasażowania pojedynczego szczepu. Ogólna liczba drobnoustrojów probiotycznych w preparacie, wyrażana zawartością cfu/ dawkę, stanowi kluczowy element skuteczności tych produktów i powinna być nie niższa niż 5-10 x 10 9 CFU w celu wywołania korzystnego efektu (10). Wszystkie badane produkty wykazywały deklarowaną liczbę drobnoustrojów, zgodnie ze specyfikacją wytwórcy: Lakcid -2,65x10 9 CFU/ampułkę, Lakcid forte - 12,1x10 9 CFU/ fiolkę i 12,9x10 9 CFU/saszetkę, Lakcid L - 12,54x10 12 CFU/fiolkę, Lacidofil - 4,1x10 9 CFU/ kapsułkę, Trilac 3,4x10 9 CFU/kapsułkę oraz EcoVag - 14,25x10 8 CFU/kapsułkę. Oporność bakterii probiotycznych na antybiotyki, stanowi cechę, która jest pożądana jeżeli nie jest kodowana przez ruchome elementy genetyczne (16), przy czym zgodnie z aktualnymi postulatami w zakresie poprawy bezpieczeństwa produktów probiotycznych powinna gwarantować możliwości terapeutyczne w przypadku nieoczekiwanego wywoła-

52 A. Wiatrzyk i inni Nr 1 Ryc. 1. Dendrogram profili amplifikacji DNA metodą rep-pcr szczepów probiotycznych oraz odpowiadających im produktów leczniczych. Szczepy referencyjne zostały oznaczone symbolem *. nia zakażenia (21). Ocena wrażliwości na antybiotyki stanowiąc szczepowo swoistą cechę, posiada kluczowe znaczenie przy wyborze terapii w przypadku zdarzeń niepożądanych, kiedy szczep probiotyczny staje się przyczyną uogólnionego zakażenia. Obecnie postuluje się, aby do zaleceń wyboru szczepów probiotycznych do stosowania u ludzi, wprowadzić zasadę konieczności stosowania jedynie takich szczepów, które wykazują wrażliwość na nie mniej niż 3 powszechnie stosowane antybiotyki mającą na celu umożliwienie wybranej opcji terapeutycznej w przypadku wywołania zakażeń inwazyjnych (21). W pracy wykazano, że wszystkie serie siewne L. rhamnosus badanych produktów leczniczych były oporne na wankomycynę (MIC>256µg/ml) podobnie jak szczepy referencyjne z ATCC (L. rhamnosus GG 53103 i 244) (Tabela I). Oporność L. rhamnosus na wankomycynę jest cechą gatunkową odróżniającą je od wrażliwych L. acidophilus i nie jest to oporność typu plazmidowego (14, 19). Odróżnienie oporności wrodzonej od nabytej jest bardzo ważne, ze względu na to, że ruchome elementy genetyczne ogrywają główną rolę w przenoszeniu genów oporności wśród bakterii (13). Znaczna liczba pałeczek należąca do Lactobacillus jest naturalnie oporna na kwas nalidyksowy, trimetoprim-sulfametoksazol, metronidazol (7). Wszystkie szczepy probiotyczne wyizolowane z badanych produktów

Nr 1 Charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych 53 leczniczych były oporne na kwas nalidyksowy (chinolon), większość z nich (z wyjątkiem rodzaju Bifidobacterium) -na kolistynę i trimetoprim-sulfametoksazol oraz metronidazol. Tab. I. Minimalne stężenie (MIC) leków przeciwbakteryjnych hamujące wzrost szczepów probiotycznych Szczep Minimalne stężenie hamujące [µg/ml] AML CTX GM MET E VA TE L. rhamnosus Pen 128 32 32 * >256 0,25 >256 16 L. rhamnosus Oxy 0,5 16 16 * >256 0,25 >256 >256 * L. rhamnosus E/N 0,5 8 64 * >256 >256 * >256 0,25 Lakcid L. rhamnosus 573L/1 0,5 8 32 * >256 0,25 >256 0,5 L. rhamnosus 573L/2 0,5 4 8 * >256 0,25 >256 1 L. rhamnosus 573L/3 1 16 16 * >256 0,12 >256 0,5 L. acidophilus La-5 0,012 0,5 128 * >256 0,12 2 0,5 L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lb-Y27 0,03 <0,002 8 * >256 0,06 1 1 B. animalis subsp. lactis Bb-12 0,03 0,25 >256 * 1 0,06 1 32 * L. helveticus R0052 0,06 0,5 64 * >256 0,25 2 1 L. rhamnosus R0011 4 32 32 * >256 1 >256 >256 * L. gasseri DSM 14869 0,5 1 128 >256 0,25 4 2 L. rhamnosus DSM 14870 0,5 1 8 >256 0,06 >256 1 L. rhamnosus GG ATCC 53103 1 8 32 * >256 0,25 >256 0,5 L. rhamnosus ATCC 244 0.5 8 32 * >256 5 >256 0,5 AMLamoksycylina, CTX cefotaksym,gm gentamycyna, MET metronidazol, E erytromycyna, VA wankomycyna, TE tetracyklina. Polami zacieniowanymi zaznaczono oporność na zastosowane leki. *zaznaczono oporność na leki w oparciu o wartości MIC wyznaczone przez EFSA. Mieszaniny szczepów stanowiące substancje czynne preparatów Lakcid oraz Lakcid forte wykazywały oporność na wszystkie zastosowane leki, przy czym pojedyncze jej szczepy charakteryzowały się zróżnicowaną wrażliwością (Tabela II). Wrażliwość na antybiotyki w pozostałych produktach leczniczych była różna w zależności od szczepu. Szczepy stanowiące substancję czynną produktu Trilac charakteryzowały się opornością na antybiotyki z grupy aminoglikozydów, kolistynę oraz zastosowane chemioterapeutyki (SXT, MET, NA). W produkcie leczniczym Lakcid L bakterie wykazywały oporność na glikopeptydy, cefalosporynę IV generacji, kolistynę, na niektóre aminoglikozydy (GM, NN, S) oraz użyte chemioterapeutyki (SXT, MET, NA). Szczepy występujące w preparatach Lacidofil i EcoVag były oporne na antybiotyki z grupy aminoglikozydów, glikopeptydów oraz klindamycynę, kolistynę, chemioterapeutyki SXT, MET, NA. Ponadto, w produkcie leczniczym Lacidofil, jeden ze szczepów (L. rhamnosus R0011) wykazywał oporność na cefalosporyny. Analizując dane w dostępnym piśmiennictwie można zauważyć, że większość szczepów należących do rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium wykazuje przede wszystkim dużą wrażliwość na antybiotyki ß-laktamowe (z wyjątkiem niektórych cefalosporyn), a znaczną oporność na aminoglikozydy i kwas nalidyksowy (1, 7, 16, 20). Podsumowując,

54 A. Wiatrzyk i inni Nr 1 Tab. II Wrażliwość szczepów probiotycznych na antybiotyki i chemioterapeutyki Szczep Średnica strefy zahamowania wzrostu [mm] Pe AM AML PRL CXM CTX CAZ IPM MEM GM N NET NN S E VA D SXT NA CC CT MET TEC CE FEP OB L. rhamnosus Pen 6 6 6 10 6 6 6 6 6 16 15 24 6 6 37 6 20 6 6 19 6 6 6 6 6 6 L. rhamnosus Oxy 40 40 40 40 34 30 16 23 15 17 22 28 6 6 40 6 6 6 6 36 6 6 6 12 12 26 L. rhamnosus E/N 40 40 40 40 31 29 19 21 16 6 6 10 6 10 6 6 40 6 6 6 6 6 6 10 6 24 Lakcid 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 L. rhamnosus 573L/1 30 28 30 40 33 22 15 21 15 10 15 18 6 10 33 6 40 6 6 21 6 6 6 10 6 20 L. rhamnosus 573L/2 43 33 40 45 25 26 16 21 16 20 22 26 13 6 38 6 40 6 6 27 6 6 6 10 6 23 L. rhamnosus 573L/3 30 29 35 38 30 22 14 21 18 16 17 22 10 10 34 6 38 6 6 26 6 6 6 10 6 20 Lakcid L 30 31 33 38 27 22 15 21 12 12 14 19 6 6 34 6 40 6 6 22 6 6 6 6 6 22 L. acidophilus La-5 40 40 40 40 40 40 34 40 40 6 6 14 6 13 40 37 40 6 6 13 6 6 28 40 16 40 L. delbrueckii subsp. bulgaricus Lb-Y27 40 40 40 40 40 40 40 40 40 20 10 28 10 16 40 35 40 6 6 40 12 12 34 40 40 40 B. animalis subsp. lactis Bb-12 40 40 40 40 40 40 40 40 40 6 6 6 6 6 40 36 16 36 6 40 6 20 40 40 40 26 Trilac 40 40 40 40 40 40 30 37 40 6 6 12 6 13 40 28 40 6 6 16 6 6 29 35 29 30 L. helveticus R0052 40 40 40 40 40 40 30 40 40 6 10 12 40 13 39 28 39 6 6 14 6 6 25 28 38 34 L. rhamnosus R0011 26 20 27 40 6 10 6 11 6 10 13 18 6 6 34 6 6 6 6 30 6 6 6 6 6 6 Lacidofil 26 21 27 36 10 10 6 15 12 6 10 10 6 6 37 6 13 6 6 11 6 6 6 6 6 6 L. gasseri DSM 14869 40 35 40 38 40 40 25 35 27 6 6 10 6 10 31 22 37 6 6 6 6 6 21 20 36 22 L. rhamnosus DSM 14870 40 30 37 40 30 26 15 23 15 14 18 22 6 6 35 6 40 6 6 20 6 6 6 6 10 22 EcoVag 36 36 34 40 30 30 18 22 20 6 6 10 6 6 33 6 40 6 6 6 6 6 6 12 11 24 L. rhamnosus GG ATCC 53103 35 32 34 40 29 29 18 20 23 10 11 15 6 6 32 6 38 6 6 18 6 6 6 6 6 10 L. rhamnosus ATCC 244 42 34 40 42 27 28 17 20 18 10 10 18 6 6 32 6 40 6 6 18 6 6 6 6 6 10 Pe penicylina, AM ampicylina, AMC amoksycylina, PRL piperacylina, CXM cefuroksym, CTX cefotaksym, CAZ ceftazydym, IPM imipenem, MEM meropenem, GM gentamycyna, N neomycyna, NET netylmycyna, NN tobramycyna, S streptomycyna, E erytromycyna, VA wankomycyna, D doksycyklina, SXT trimetoprim-sulfametaksazol, NA kwas nalidyksowy, CC klindamycyna, CT kolistyna, MET metronidazol, TEC teikoplanina, CE cefradyna, FEP cefepim, OB kloksacylina. Polami zacieniowanymi oznaczono oporność na zastosowane leki.

Nr 1 Charakterystyka probiotycznych szczepów bakteryjnych 55 mieszaniny szczepów w produkcie leczniczym Lakcid/Lakcid forte były oporne na 100% użytych w pracy antybiotyków, w produkcie Trilac, Lacidofil, Lakcid L, EcoVag oporność oszacowano odpowiednio na 27%, 66%, 39% i 54%. Wykonane badania potwierdzają, że wrażliwość na antybiotyki jest cechą szczepowo swoistą i powinna być oznaczana w celu kontroli jakości produktu, monitorowania jednorodności cech fenotypowych oraz w przypadkach konieczności włączenia leczenia. Wyniki przeprowadzonych badań, potwierdziły, że probiotyczne produkty lecznicze, pomimo, że zostały opracowane szereg lat temu, spełniają podstawowe wymagania jakościowe, co w przypadku tożsamości stanowi kluczowy element prawidłowości definicji probiotyku i bezpieczeństwa jego stosowania określonej przez FAO/WHO, a zgodnie z zaleceniami dyrektywy Unii Europejskiej od 2007 r jest podstawą deklarowanych wskazań. Dodatkowo potwierdzona tożsamość pozwala na przeprowadzenie właściwej interpretacji wykonywanych antybiogramów (16). Opracowane molekularne procedury identyfikacji drobnoustrojów probiotycznych mogą zostać zastosowane do potwierdzania tożsamości szczepów wchodzących w skład suplementów diety oraz dietetycznych środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego podlegających wymaganiom stawianym tego typu produktom. Dodatkowo mogą one zostać zaadoptowane przez wytwórców na różnych etapach badań rozwojowych, badań klinicznych oraz procesów wytwarzania na etapach zwalniania macierzystych i roboczych serii siewnych do dalszych etapów procesu wytwarzania oraz zwalniania do obrotu produktu końcowego. PIŚMIENNICTWO 1. Argyri AA, Zoumpopoulou G, Karatzas KA, Tsakalidou E i inni. Selection of potential probiotic lactic acid bacteria from fermented olives by in vitro tests. Food Microbiol 2013; 33: 282-91. 2. Coeuret V, Gueguen M, Vernoux JP. Numbers and strains of lactobacilli in some probiotic products. Int J Food Microbiol 2004; 15; 97: 147-56. 3. Coudeyras S, Marchandin H, Fajon C, Forestier C. Taxonomic and Strain-Specific Identification of the Probiotic Strain Lactobacillus rhamnosus 35 within the Lactobacillus casei Group. Appl Environ Microbiol 2008; 74: 2679-89. 4. Gouriet F, Million M, M. Henri, Fournier PE i inni. Lactobacillus rhamnosus bacteremia: an emerging clinical entity. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 2469-80. 5. Hamilton-Miller JMT, Shah S, Winkler JT. Public healthissues arising from microbiological and labeling quality of foods and supplements containing probiotic microorganisms. Public Health Nutr 1999; 2: 223-9. 6. Hoa NT, Baccigalupi L, Huxham A, Smertenko A i inni. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 2000; 66: 5241-7. 7. Hummel AS, Hertel C, Holzapfel WH, Franz CM. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol 2007; 73: 730-9. 8. Huys G, Vancanneyt M, D Haene K, Vankerckhoven V i inni. Accuracy of species identity of commercial bacterial cultures intended for probiotic or nutritional use. Res Microbiol 2006; 157: 803-10. 9. Join FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002: 1-11. 10. Kligler B, Hanaway P, Cohrssen A. Probiotics in children. Pediatr Clin North Am 2007; 54: 949-67.

56 A. Wiatrzyk i inni Nr 1 11. Kochan P. Bezpieczeństwo probiotyków w zastosowaniach klinicznych. Post Mikrobiol 2008; 47: 435-9. 12. Kochan P, Chmielarczyk A, Szymaniak L, Brykczynski M i inni. Lactobacillus rhamnosus administration causes sepsis in a cardiosurgical patient-is the time right to revise probiotic safety guidelines? Clin Microbiol Infect 2011; 17: 1589-92. 13. Korhonen JM, Van Hoek AH, Saarela M, Huys G i inni. Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus rhamnosus. Benef Microbes 2010; 1: 75-80. 14. Land MH, Rouster-Stevens K, Woods CR, Cannon ML i inni. Lactobacillus sepsis associated with probiotic therapy. Pediatrics 2005; 115: 178-81. 15. Lutyńska A, Augustnnowicz E, Wiatrzyk A. Problemy stosowania suplementów diety zawierających probiotyki. Probl Hig Epidemiol 2012; 93: 493-8. 16. Mathur S, Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review. Int J Food Microbiol 2005; 105: 281-95. 17. Mohania D, Nagpal R, Manoj K, Bhardwaj A i inni. Molecular approaches for identification and characterization of lactic acid bacteria. J Dig Dis 2008; 9: 190-8. 18. Moubareck C, Gavini F, Vaugien L, Butel MJ i inni. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 38-44. 19. Muszyński Z, Mirska I, Matuska K. Pałeczki z rodzaju Lactobacillus czynnik zakażeń oportunistycznych u dzieci. Przegl Epidemiol 2007; 61: 79-84. 20. Nawaz M, Wang J, Zhou A, Ma C i inni. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products. Curr Microbiol 2011; 62: 1081-9. 21. Sanders ME, Akkermans LM, Haller D, Hammerman C i inni. Safety assessment of probiotics for human use. Gut Microbes. 2010; 1: 164-85. 22. Schleifer KH, Stackebrandt E. Molecular systematics of prokaryotes. Annu Rev Microbiol 1983; 37: 143-87. 23. Steinka I. Wybrane aspekty stosowania probiotyków. Ann Acad Med Gedan 2011; 41: 97-108. 24. www.eucast.org 25. Vesterlund S, Vankerckhoven V, Saxelin M, Goossens H i inni. Safety assessment of Lactobacillus strains: presence of putative risk factors in faecal, blood and probiotic isolates. Int J Food Microbiol 2007; 116: 325-31. Otrzymano: 06.03.2013 Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Badania Surowic i Szczepionek NIZP-PZH, tel. 22 54 21 213, fax 22 54 21 311, e-mail: alutynska@pzh.gov.pl