FluoroSpheres Nr kat. K0110 Wydanie 6 Kulki kalibracyjne do codziennego monitorowania cytometru przepływowego. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 40 kalibracji. (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 1/9
Spis treści Strona Przeznaczenie... 3 Streszczenie i wyjaśnienia... 3 Zasada oznaczenia... 3 Odczynniki... 4 A. Materiały dostarczone... 4 B. Materiały wymagane, lecz nie dostarczone... 4 Środki ostroŝności... 4 Przechowywanie... 4 Procedura oznaczania oraz akwizycji danych... 4 Analiza danych, Krzywa kalibracyjna... 5 A. Definicje... 6 B. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŝających MFI w jednostkach liniowych... 6 C. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŝających MFI w numerach kanałów... 7 (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 2/9
Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Produkt FluoroSpheres jest przeznaczony do monitorowania wydajności cytometru przepływowego. Streszczenie i wyjaśnienia Zestaw zawiera tzw. ślepe kulki Blank Beads oraz kulki kalibracyjne Calibration Beads o średnicy 3,2 µm. Kulki kalibracyjne Calibration Beads są mieszaniną 5 rodzajów kulek posiadających róŝne właściwości fluorescencyjne oraz jednego rodzaju kulek nie posiadających właściwości fluorescencyjnych. Fluorescencyjne kulki zawierają połączenie wielu unikalnych fluorochromów, które mogą być wzbudzane światłem o dowolnej długości fali z zakresu od 365 do 650 nm. PoniewaŜ fluorochromy z kulek róŝnią się od fluorochromów zazwyczaj stosowanych w cytometrii przepływowej, róŝne są teŝ ich właściwości spektralne. Dlatego teŝ kulki nie mogą zostać uŝyte do ustalenia kompensacji fluorescencyjnej. Dzięki przypisanym konkretnym rodzajom kulek fluorescencyjnym wartości cząsteczek równowaŝnego fluorochromu (ang. Molecules of Equivalent Fluorochrome - MEF), stosowanie produktu FluoroSpheres pozwala na zamianę arbitralnych jednostek przeciętnego natęŝenia fluorescencji (ang. Mean Fluorescence Intensity - MFI) na bezwzględne jednostki słuŝące do zapewnienia jakości oraz raportowania danych cytometrii przepływowej. Zasada oznaczenia 1. Najpierw analizowane są ślepe kulki Blank Beads w celu ustalenia optymalnych ustawień aparatur dla wszystkich badanych kanałów. 2. Następnie analizowane są kulki kalibracyjne Calibration Beads. Dane zostają uŝyte do stworzenia krzywej kalibracyjnej, gdzie na jednej osi zostają umieszczone wartości MFI a na drugiej wartości MEF. Krzywa kalibracyjna oraz skojarzone parametry statystyczne są uŝywane do oceny liniowości działania aparatu. Ponadto dzięki krzywej kalibracyjnej moŝna równieŝ określić granicę detekcji oraz zakres dynamiczny aparatu. Kalibrację przy pomocy kulek FluoroSpheres moŝna przeprowadzić na jeden z dwóch sposobów: Stałe ustawienie aparatu. Przy wykorzystaniu tej metody wszystkie ustawienia urządzenia pozostają niezmienione z upływem czasu. Wartości MFI dla róŝnych pików są monitorowane a wyniki zostają wyświetlone jako data kalibracji a wartość MFI. Stała odpowiedź aparatu. Przy uŝyciu tej metody napięcie PMT jest regulowane tak, Ŝeby wartość MFI jednego z wysoce fluorescencyjnych pików była wyświetlana za kaŝdym razem w dokładnie tym samym kanale. Wynik zostają wyświetlone jako data kalibracji a napięcie PMT. (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 3/9
Odczynniki A. Materiały dostarczone Fiolka 1 Fiolka 2 1,7 ml W 0,02% azydku sodu, 0,01% NP40 1.7 ml Zawiera ślepe kulki Blank Beads oraz 5 rodzajów kulek posiadających róŝne ilości fluorochromów wyraŝone w wartościach MEF odpowiednio dla FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 oraz APC. W przypadku wartości MEF swoistych dla danej partii, prosimy o zapoznanie się z dołączonym Arkuszem wartości analitycznych. W 0,02% azydku sodu, 0,01% NP40. B. Materiały wymagane, lecz nie dostarczone Ogólny sprzęt laboratoryjny wymagany przy procedurach cytometrii przepływowej. Papier graficzny półlogarytmiczny i podwójnie logarytmiczny dla 5 cykli. Kalkulator. Oprogramowanie dla analizy danych cytometrii przepływowej. Programy typu arkusz kalkulacyjny, jak np. Excel firmy Microsoft. Programy te są opcjonalne. Środki ostroŝności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN 3 ), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. Przechowywanie Przechowywać zestaw w temperaturze 2-8 C. Nie uŝywać po dacie waŝności podanej na etykiecie fiolek. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. Jeśli wystąpią nieoczekiwane wyniki, których nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, Ŝe przyczyną moŝe być problem z niniejszym zestawem, naleŝy niezwłocznie skontaktować się z działem Pomocy technicznej. Procedura oznaczania oraz akwizycji danych 1. Mocno zmieszaj kulki przy pomocy mieszadła lub ręcznie - potrząsając. 2. Do kaŝdej z dwóch probówek dodaj 0,5 ml odpowiedniego buforu rozcieńczającego, np. roztworu soli fizjologicznej zbuforowanego fosforanem, o ph 7,2. Dodaj jedną kroplę z Fiolki 1, z kulkami ślepymi Blank Beads, do pierwszej probówki oraz jedną kroplę z Fiolki 2, z kulkami kalibracyjnymi Calibration Beads, do drugiej probówki. Wymieszaj przy pomocy mieszadła, aby uzyskać jednorodną zawiesinę kulek. 3. Przed akwizycją danych, wybierana jest amplifikacja logarytmiczna dla badanych detektorów fluorescencji a kompensacja fluorescencji dla wszystkich parametrów jest ustawiana na zero. (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 4/9
4. UŜyj z cytometrem przepływowym probówki z kulkami Blank Beads. 5. Wyreguluj napięcia PMT, Ŝeby umoŝliwić pojawienie się piku kulek Blank Beads w pierwszej dekadzie histogramu. 6. Stosując rozproszenie przednie (FSC) przeciwko rozproszeniu bocznemu (SSC), ustaw aktywną bramkę na singletach kulek (patrz Rysunek 1). 7. Uzyskaj minimalnie 5 000 bramkowanych zdarzeń pochodzących od kulek Blank Beads. 8. UŜyj z cytometrem przepływowym probówki z kulkami Calibration Beads i uzyskaj dane dla co najmniej 5 000 bramkowanych zdarzeń. 9. W badanym kanale fluorescencji powinno być widocznych sześć róŝnych pików natęŝeń fluorescencji (patrz Rysunek 2). Analiza danych, Krzywa kalibracyjna Analiza wyników jest ograniczona do bramkowanych singletów kulek wolnych od resztek, w sposób określony na wykresie punktowym rozproszenia przedniego (FSC) na rozproszenie boczne (SSC) (patrz Rysunek 1). Do określenia kaŝdego z 6 rodzajów kulek Calibration Beads stosuje się indywidualne markery lub obszary (patrz Rysunek 2). Obszarów uŝywa się do określenia MFI kaŝdego rodzaju kulek. Rysunek 1. Rozproszenie przednie (FSC) na rozproszenie boczne (SSC) kulek Blank Beads. Bramka została ustawiona pod kątem zbierania singletów pochodzących od kulek. (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 5/9
855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts 427 213 0 100 101 102 103 104 FL1-H Rysunek 2. Histogram rodzajów kulek FluoroSpheres. A. Definicje Log offset Przesunięcie logarytmiczne reprezentuje wartość fluorescencji w kanale 0. Kanał 0 jest zazwyczaj reprezentowany w oprogramowaniu producenta przy pomocy wartości arbitrarnych, np. 1 w przypadku większości programów firmy Becton Dickinson oraz 0,1 w przypadku programów firmy Coulter. AvgRes% Procent średnich resztek (ŚredResz%) jest niewaŝoną miarą liniowości odpowiedzi urządzenia. Jest wyliczane przez określenie średniego bezwzględnego procentu, o który linia regresji róŝni się od punktów rzeczywistych. r 2 Współczynnik determinacji (r 2 ) jest waŝoną miarą liniowości. Najbardziej przydatny jest przy analizowaniu danych logarytmicznych. Próg detekcji ChociaŜ ślepe kulki Blank Beads nie posiadają wewnątrz fluorochromów, nadal wytwarzają one pewien sygnał. Sygnał ten reprezentuje szum tła i tym samym poziom detekcji urządzenia. MEF Ang. Molecules of Equivalent Fluorochrome (czyli cząsteczki równowaŝnego fluorochromu), co jest wartością fluorochromu na jedną kulkę. Log dekady Log (logarytm) dekady jest skalibrowanym zakresem pełnoskalowym lub zakresem dynamicznym kalibrowanego parametru fluorescencji. Cytometry przepływowe są zazwyczaj wyposaŝone we wzmacniacze o zakresie dynamicznym 3,5 lub 4 log dekady, w zaleŝności od producenta. Zmniejszona wydajność cytometru przepływowego będzie mieć wpływ na log dekady. B. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŝających MFI w jednostkach liniowych Tworzenie krzywej kalibracyjnej: (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 6/9
1. Określ MFI dla kaŝdego z 6 rodzajów kulek FluoroSpheres Calibration Beads. 2. Umieść na wykresie log MFI oraz odpowiadający log MEF dla róŝnych pików. Wylicz linię prostą o najlepszym dopasowaniu według następującego wzoru: log (MEF) = a x log (MFI) + b gdzie a to nachylenie natomiast b jest miejscem przecięcia z osią Y, zwane równieŝ przesunięciem logarytmicznym lub wartością kanału zero. 3. Wylicz skojarzone parametry statystyczne SredResz% oraz r 2 krzywej kalibracyjnej. 4. Zakres dynamiczy wzmacniacza jest wyraŝany w log dekady. Log decady moŝe zostać wyliczony z linii regresji przez odjęcie log (MEF min ) od log (MEF max ). Log (MEF min ) i log (MEF max ) są pochodnymi odpowiednio najniŝszej i najwyŝszej wartości MFI. W bieŝącym przypadku MFI dla MEF min oraz MEF max wynoszą odpowiednio 10 0 i 10 4. MEF (skala logarytmiczna) Próg detekcji (MEF kulki 1) 1 (ślepa) Przesunięcie logarytmiczne (wartość kanału zero) MFI (wartości liniowe) Rysunek 3. Krzywa kalibracyjna (linia regresji) oparta na kulkach FluoroSpheres. Przykład wyliczenia: log dekady = log (MEF max ) - log (MEF min ) log dekady = log (188 735) - log (30,8) log dekady = 5,28 1,49 log dekady = 3,79 Liczba kanałów na dekadę: PoniewaŜ liczba kanałów wynosi 1024, liczba kanałów na dekadę wynosi: 1024/3,79 = 270 C. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŝających MFI w numerach kanałów Tworzenie krzywej kalibracyjnej: 1. Określ MFI dla kaŝdego z 6 rodzajów kulek FluoroSpheres Calibration Beads. 2. Umieść na wykresie MFI oraz logarytm (MEF) i wylicz linię prostą o najlepszym dopasowaniu według następującego wzoru: log (MEF) = a x MFI + b gdzie a to nachylenia natomiast b to miejsce przecięcia z osią Y. 3. Wylicz skojarzone parametry statystyczne SredResz% oraz r 2 krzywej kalibracyjnej. (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 7/9
4. Zakres dynamiczy wzmacniacza jest wyraŝany w log dekady. Log decady moŝe zostać wyliczony z linii regresji przez odjęcie log (MEF min ) od log (MEF max ). Log (MEF min ) i log (MEF max ) są pochodnymi odpowiednio najniŝszej i najwyŝszej wartości MFI. W bieŝącym przypadku MFI dla MEF min oraz MEF max wynoszą odpowiednio 0 i 1023. MEF (skala logarytmiczna) Próg detekcji (MEF kulki 1) 1 (ślepa) Przesunięcie logarytmiczne (wartość kanału zero) Rysunek 4. Krzywa kalibracyjna (linia regresji) oparta na kulkach FluoroSpheres. Przykład wyliczenia: log dekady = log (MEF max ) - log (MEF min ) log dekady = log (188 735) - log (30,8) log dekady = 5,28 1,49 log dekady = 3,79 Liczba kanałów na dekadę: MFI (numer kanału) PoniewaŜ liczba kanałów wynosi 1024, liczba kanałów na dekadę wynosi: 1024/3,79 = 270 (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 8/9
Objaśnienia symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Sprawdzić w instrukcji stosowania Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań Numer serii Producent Wyprodukowano przez: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (108651-004) SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 9/9