Gen eukariotyczny Działanie i regulacja etapy posttranskrypcyjne 1
Definicja genu } Region DNA, który określa dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. } Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. } Definicja niedoskonała, trudno jednoznacznie zdefiniować gen. } Współczesne definicje centrum jest transkrypt
Klasyczne wyobrażenie genu fragment DNA, który koduje funkcjonalny mrna Wszystkie transkrypty mrna mają niekodujące fragmenty 5 i 3 końcowe
Geny eukariotyczne } Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie } Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony } Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów } Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne } Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu } Genom człowieka: ~23 000 genów kodujących białka } Proteom człowieka: co najmniej 500 000 form 4
Etapy ekspresji/poziomy regulacji } struktura chromatyny } transkrypcja } obróbka i kontrola jakości RNA } transport RNA } degradacja RNA } translacja } modyfikacje post-translacyjne } degradacja białka
Poziom RNA w komórce synteza degradacja dojrzewanie regulacja transkrypcji stabilność cząsteczek RNA Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Obróbka transkryptów poli i poliii } Wieloetapowe mechanizmy cięcia } rrna jedna jednostka transkrypcyjna, złożona obróbka } trna cięcie prekursora na końcu 3 (RNaza Z) i 5 (RNaza P) 7
Obróbka prekursora rrna 8 Zakrzewska-Płaczek et al., Nucleic Acids Res. 2010
Obróbka pre-trna } Dwie endonukleazy: RNaza P i trnaza Z 9
Obróbka mrna } Czapeczka na końcu 5 } Poliadenylacja końca 3 } Wycinanie intronów składanie (splicing) } Transport z jądra do cytoplazmy } Degradacja 10
Transkrypcja i obróbka są sprzężone Tradycyjny obraz ekspresji genu Współczesny obraz ekspresji genu DNA Pre-mRNA Transkrypcja Pol RNA II Cap Transkrypcja i obróbka Pol RNA II Obróbka mrna Cap AAAAAAAAAAAA Cap AAAAAAAAAAAA 11 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Sprzężenie transkrypcji i obróbki RNA } Na poszczególnych etapach tworzą się kompleksy różnych białek z polimerazą RNA } Inicjacja/synteza czapeczki } Elongacja/splicing } Terminacja/poliadenylacja } Kluczowym obszarem jest C-koniec polimerazy II (CTD) regulacja przez fosforylację 12
Transkrypcja i synteza czapeczki/splicing 13 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Czapeczka 5 } Synteza tuż po inicjacji transkrypcji } Istotna dla eksportu i translacji mrna } Chroni przed degradacją przez egzorybonukleazy Xrn 14
Terminacja i poliadenylacja 15
Terminacja i poliadenylacja 16
Kompleks cięcia i poliadenylacji Cleavage-Polyadenylation Specificity Factor (CPSF) Cleavage stimulation Factor (CstF) STOP CODON 30 100 73 160 AAUAAA Symplekin CA 50 77 64 G/U-rich Fip Poly(A) polymerase 68 25 Cleavage Factor II (CF II) Cleavage Factor I (CF I) 17 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Wydłużanie ogona polia Koniec gdy PAP utraci kontakt z CPSF Fip 30 100 73 160 PABP N AAUAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA PABP N PABP N PAP PABP N 18 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
5 3 Terminacja mechanizm torpedy Cleavage Factors RNA Pol II Transkrypcja 3 5 CTD Splicing Factors CPSF 73 3 mrna 7 mg 19 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne miejsce poliadenylacji } Mechanizm regulacyjny AAUAAA..G/U rich 3 UTR polya1 polya2 polya3 AUU AUU polya AUU polya Elementy regulatorowe AUU polya 20 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywna poliadenylacja } IgM } forma błonowa (limfocyty B wczesna faza dojrzewania) } forma rozpuszczalna (późna faza dojrzewania limfocyty w osoczu) 21 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Poliadenylacja } Kontroluje (zwiększa) stabilność mrna } Dotyczy większości mrna, wyjątkiem są mrna kodujące histony } mrna histonów stabilne w fazie S, pod koniec szybko degradowane synchroniczna regulacja 22 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Składanie (splicing) } Introny fragmenty pierwotnego transkryptu, które są wycinane i nie występują w dojrzałym transkrypcie } Większość genów wyższych eukariontów zawiera introny, w przeciętnym genie stanowią przeważającą większość sekwencji transkrybowanej } Alternatywne składanie różne kombinacje eksonów dają różne ostateczne transkrypty tego samego genu 23
Składanie mrna 24
Mechanizm składania 25
Składanie mrna } W składaniu uczestniczą kompleksy białek i snrna: snrnp 26
snrnp Sm ring E G D3 F B D2 D1 U6 ring 27 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne składanie } Wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne) } Składanie różnych kombinacji eksonów } Jeden gen wiele białek } Często tkankowo-specyficzne } Może powodować wstawienie przedwczesnego STOP mechanizm regulacji 28
Geny wyższych Eukaryota składają się głównie z intronów Exon Pre-mRNA Intron Splicing mrna Średni transkrypt: 27 000 nt/ 9 eksonów Eksony średnio stanowią 5% genu Średni ekson 145 nt Średni intron 3500 nt 29 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Jak znaleźć ekson? } Rzeczywiste sekwencje często odbiegają od sekwencji najwyższej zgodności (consensus) Miejsce styku 5 Miejsce rozgałęzienia A Miejsce styku 3 5 Ekson A 3 Ekson Miejsce styku 5 Miejsce styku 3 30 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Mechanizm definicji eksonu } U wyższych Eukaryota długie introny/krótkie eksony definicja eksonu : Kontakt poprzez ekson Intron U2 snrnp A U2AF65 35 YYRYY AG 70K Ekson wewn. GU U1 snrnp Intron 3 ss 5 ss } U niższych Eukaryota (np. S. pombe) krótkie introny/długie eksony definicja intronu 31 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Sekwencje cis wzmacniające/hamujące splicing + ESE ESS ESE ESE (Exonic Splicing Enhancer) ESS ESS (Exonic Splicing Silencer) + Aktywator składania Represor składania 32 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Czynniki trans GU U2 snrnp U2AF65 35 A YRYRYY AG RS RRM 70K U1 snrnp GU Słaby trakt polipirymidynowy 3 ss 5 ss } Białka SR aktywatory, wiążą ESE } Białka hnrnp represory, wiążą ESS 33 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Alternatywne składanie - przykłady } Bardzo wiele genów człowieka } ~75% genów (może nawet 90%) } 1 gen średnio 3 końcowe transkrypty } Rekordy } Neurexin 3 (człowiek) 2000 alternatywnych transkryptów } DSCAM (Drosophila) 40 000 form!!! } Amylaza śliniankowa i wątrobowa } Tachykininy: } neurotransmitery w narządach zmysłów } neuropeptyd P w układzie nerwowym } neuropeptyd K w tarczycy i jelicie } Determinacja płci Drosophila 34
Redagowanie (editing) } Zmiana konkretnego nukleotydu w RNA po transkrypcji } Częste w organellach roślin i niższych eukariontów } Np. apolipoproteina B człowieka Wątroba, białko 4563 aa Jelito, białko 2153 aa 35
Degradacja RNA } Stała (obrót RNA) } Głównie w cytoplazmie } Regulowana } Przez małe RNA (sirna, mirna) } Przez białka } Cytoplazma i jądro } Kontrola jakości } W jądrze (RNA niekodujące) } W jądrze i cytoplazmie (mrna) 36
Degradacja RNA } Czas życia mrna jest krótki (średnio 10-20 min. drożdże, kilka godzin ssaki) } Różne ścieżki degradacji } 3 -> 5 (egzosom) } } pierwszym etapem jest deadenylacja 5 -> 3 (Xrn) } pierwszym etapem usunięcie czapeczki, egzonukleaza 5 ->3 } Na stabilność wpływają sekwencję nie podlegające translacji (UTR) i polia } Może podlegać regulacji przez czynniki trans 37
Degradacja mrna W CYTOPLAZMIE: stały rozkład mrna Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Kontrola jakości RNA } Tylko w pełni obrobione (czapeczka, poliadenylacja, składanie) transkrypty są eksportowane z jądra } Transkrypty nieprawidłowo obrobione są degradowane } Degradacja transkryptów z przedwczesnym kodonem STOP (NMD nonsense mediated decay) wykrywane nieprawidłowe położenie STOP względem miejsc styku intron/ekson 39
Miejsce degradacji RNA W CYTOPLAZMIE: W JĄDRZE: stały rozkład mrna systemy kontroli ekspresji genów } } } degradacja nieprawidłowych pre-mrna/mrna, które nie zostały wyeksportowane do cytoplazmy degradacja wadliwych trna i rrna degradacja długich niekodujących RNA (CUT itp.) degradacja intermediatów szlaku RNAi
Mechanizmy kontroli jakości RNA } degradacja mrna zawierających przedwczesne kodony stop (NMD- nonsense mediated decay) } degradacja mrna z brakującymi kodonami stop (NSDnon-stop decay) } degradacja jądrowych mrna i pre-mrna, które: } nie uległy prawidłowemu dojrzewaniu (tj. składaniu, dojrzewaniu 3 końca) } nie zostały wyeksportowane do cytoplazmy } degradacja wadliwych stabilnych RNA (np. rrna) i ich prekursorów 41
Długie niekodujące RNA - lncrna } Niedawno odkryte funkcje często nieznane } funkcje regulatorowe, poprzez strukturę chromatyny np. gen FLO11 drożdży } Cryptic Unstable Transcripts } Transkrypcji podlegają długie obszary międzygenowe } Często z promotorów genów, tylko w przeciwnym kierunku } Szybko degradowane przez egzosom (3 ->5 exo) } Rola nieznana, możliwe zaangażowanie w wyciszanie transpozonów, modyfikacje histonów zależne od transkrypcji, regulację (związek z RNAi?) } W jądrze są jeszcze inne tajemnicze niestabilne transkrypty (NUT, PAST, XUT itp.) 42
Regulowana degradacja RNA Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright e McGraw-Hill Companies, Inc. 43
Ciałka P (P-bodies) } Struktury w cytoplazmie, w których zachodzi degradacja mrna } decapping } przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mrna } miejsce działania mirna Marx J (2005), Science 310: 764-5 44
Po zakończeniu obróbki } mrna jest transportowany do cytoplazmy } tam ulega translacji Cytoplazma 7 mg AUG UAA AAUAAA polya 5 UTR ORF -sekwencja kodująca 3 UTR 45 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Model pętli AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA PABP 1 PABP 1 PABP 1 eif-4e Cap binding protein } } } eif-4g 7 mg eif- 4A eif- 4B eif-3 5 UTR 40S 60S AUG Aktywne translacyjnie mrna tworzą pętlę Kluczowe jest białko eif-4g Kluczowe dla odróżniania prawidłowych mrna i kontroli jakości 46 Rys. dr Zbigniew Domiński, University of North Carolina at Chapel Hill
Translacja } Regulowany może być każdy etap translacji } Wybór kodonu AUG (nie ma sekwencji S-D, decydują oddziaływania z białkami wiążącymi 5 UTR) } Inicjacja } Elongacja } Terminacja } Np. zahamowanie translacji i indukcja GCN4 w odpowiedzi na głodzenie u drożdży 47
Białka też podlegają złożonym modyfikacjom } Fałdowanie wspomagane przez białka opiekuńcze } Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.) } Ubikwitynacja i degradacja } Naturalna } Degradacja źle sfałdowanych białek 48
Nowe role RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello 49
Interferencja RNA } Wyciszanie ekspresji genów przez krótkie dwuniciowe RNA homologiczne do sekwencji genu } Może działać na różnych etapach } PTGS posttranskrypcyjne wyciszanie genów } hamowanie translacji } degradacja RNA } TGS transkrypcyjne wyciszanie genów } wpływ na strukturę chromatyny } zmiana aktywności czynników transkrypcyjnych 50
sirna, mirna, strna... } } } sirna (short interfering RNA) pochodzą z dwuniciowych cząsteczek, głównie egzogenne (np. wirusy RNA) mirna (micro RNA) pochodzą z cząsteczek o strukturze szpilki do włosów, kodowane w genomie } strna (small temporally regulated RNA) mirna regulujące rozwój (odkryte u nicieni) smrna (small modulatory RNA) reguluje działanie genów w neuronach przez zmianę funkcji białka regulującego transkrypcję (represor aktywator) 51
sirna a mirna sirna egzogenny dsrna (np. wirusa) mirna endogenny dsrna 52
sirna - jak to działa? dsrna jest egzogenny Efekt degradacja mrna 53 Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002
mirna jak to działa? dsrna kodowany w genomie Efekt: degradacja mrna (pełna komplementarność) lub hamowanie translacji (częściowa kompl.) rozbicie struktury pętli 54
Ciałka P (P-bodies) } przechowywanie nieaktywnych translacyjnie mrna po mirna } degradacja } niekiedy możliwe odzyskanie nieaktywnych mrna Marx J (2005), Science 310: 764-5 55
mirna } Powszechny mechanizm regulacyjny } Co najmniej 1000 mirna kodowanych w genomie człowieka } Co najmniej 10 000 docelowych transkryptów 1/3 transkryptomu } Nie jest wymagana pełna komplementarność } Ogólna regulacja: dany mirna działa na wiele docelowych transkryptów } np. procesy rozwojowe } przerzuty nowotworów 56
Degradacja po cięciu przez RISC 57 Rys. dr Monika Zakrzewska-Płaczek, IGiB UW
Regulacyjne RNA działają też na transkrypcję Efekt zmiana struktury chromatyny 58
RNA też może modyfikowac ekspresję chromosomu 59 Wyciszanie jednej kopii chromosomu X u kobiet przez RNA XIST
Zastosowania } Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin } Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) 60
RNA a terapia genowa } sirna skierowane przeciwko: } wirusom (HIV, HCV) } zmutowanym genom (np. pląsawica Huntingtona) } onkogenom } obniżenie poziomu cholesterolu LDL u myszy przez sirna przeciwko apolipoproteinie B 61