Badanie funkcji genu
Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP
1. Inaktywacja (mutacja) genu poprzez homologiczną rekombinację jest podstawą analizy jego funkcji Kopia genu, który chcemy wyłączyć czyli odpowiedni fragment DNA sklonowany w wektorze w E. coli Przebudowanie sklonowanego genu w E. coli konstrukt do mutagenezy przebudowana kopia genu dostarczona na wektorze
Mysz- z knockoutem genowym?????? Problemy: Diploidalny genom Myszy nie da się wyhodować na płytce z selekcją na antybiotyk I wiele innych...
1. Infekcja wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego wektor
2) Mikroiniekcja in vitro DNA do jednego z przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed pierwszym jej podziałem
3) Zastosowanie zarodkowych komórek macierzystych ES (embrionic stem) totipotencjalnych tzn. takich które nie są przypisane do żadnego szlaku rozwojowego i mogą dać początek każdemu typowi zróżnicowanych komórek. Takie komórki poddaje się modyfikacji in vitro (w kontrolowanych warunkach). Genetycznie zmienione (po homologicznej rekombinacji in vitro) komórki ES wprowadza się do zarodka myszy 1. Etap: pozyskanie komórek ES i hodowla in vitro komórki węzła zarodkowego są zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek
2. Etap: przygotowanie konstruktu do mutagenezy w E. coli na bazie kopii docelowego genu sklonowanego w wektorze Tylko pewien procent wprowadzonych konstruktów włącza się, w wyniku homologicznej rekombinacji w komórkach zarodkowych, we właściwej pozycji genomowej. Dlatego konstrukt do mutegenezy wyposaża się w dodatkowe elementy genetyczne neo, gen kodujący enzym, który inaktywuje antybiotyk neomycynę oraz jego pochodne, np. G418, który jest toksyczny dla komórek ssaczych; tk, gen kodujący kinazę tymidynową enzym, który fosforyluje analogi nukleozydów np. gancyklowir. Polimeraza DNA może wbudować taki analog nukleotydu do nowosyntetyzowanej nici DNA co prowadzi do zaburzenia procesu replikacji DNA. Dlatego komórki zawierające gen tk, giną po podaniu gancyklowiru (są wrażliwe na gancyklowir).
3. Etap: wprowadzenie konstruktu do mutagenezy do komórek zarodkowych hodowanych in vitro i selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro selekcja komórek z insercją konstruktu w docelowym genie in vitro
4. Etap: iniekcja wyselekcjonowanych in vitro komórek zarodkowych z nokautem genowym i uzyskanie potomstwa z nokautem genowym we wszystkich komórkach ciała Uzyskujemy celowe uszkodzenie (knock-out) genu i uzyskanie tzw. myszy transgenicznych z nokautem genowym, dzięki któremu możliwe staje się zbadanie funkcji takiego genu
Cre/lox System Cre rekombinza miejscowo specyficzna, która działa na miejsce loxp (34 pz). Dlaczego wycinanie DNA za pomocą Cre/loxP jest takie użyteczne w komórkach eukariotycznych? loxp pochodzi z bakteriofaga P1, a zatem nie występuje np. w roślinach czy u zwierząt. Dzięki temu sekwencje loxp mogą być sztucznie wstawiane do zwierząt i roślin w celu precyzyjnego wycinania określonych sekwencji DNA, bez obawy że przy okazji wytniemy jakąś istotną część genomu.
Jak za pomocą systemu cre/loxp otrzymać mysz, z zablokowaną ekspresją określonego genu, w określonej tkance/narządzie
Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2. nadekspresja genu 3. potranskrypcyjne wyciszanie genu (antysensowne RNA oraz RNAi) FENOTYP
2. Nadekpresja genu - celem jest ustalenie czy znacząco zwiększona ekspresja badanego genu ma wpływ na fenotyp organizmu np. myszy transgenicznej. Transgeniczna mysz do której komórek wprowadza się cdna badanego genu sklonowany w wektorze pod kontrolą silnego promotora, który powoduje ekspresję cdna np. w określonych tkankach.
3. Potranksrypcyjne wyciszanie genu antysensowne RNA (arna) interferencja RNA (RNAi)
Antysensowne RNA ss mrna może tworzyć struktury dsrna za pomocą drugiej nici komplementarnej do nici sensownej. Ta druga nić nazywa się antysensownym RNA - arna. Utworzenie dsrna może zahamować ekspresję genu Pomidor Flavr Savr to przykład transgenicznej rośliny z zablokowanym przez arna enzymem poligalakturonazy, która rozkłada pektyny powodując mięknięcie pomidorów
Interferencja RNA (RNAi) 1990 Napoli i wsp. przeprowadzili doświadczenie którego celem było uzyskanie odmiany petunii z kwiatami o bardziej intensywnej purpurowej barwie. W tym celu do komórek roślinnych wprowadzono dodatkowe kopie genu (cdna) syntazy chalonowej odpowiedzialne za syntezę fioletowego barwnika kwiatów W wyniku doświadczenia zamiast ciemniejszych kwiatów uzyskano odmiany pstrokate lub zupełnie białe. Wprowadzenie dodatkowego genu nie prowadziło do wydajniejszej syntezy barwnika, ale spowodowało zahamowanie wytwarzania barwnika kwiatu Pomiar w komórce roślinnej petunii poziomu mrna genu, którego dodatkową kopię dodano wykazał, że jego poziom znacząco spadł, a obserwowane zjawisko miało tendencję do rozprzestrzeniania się po całym organizmie rośliny. Zjawisko to nazwano kosupresją (cosuppression), ponieważ zahamowanie ekspresji dotyczyło zarówno normalny gen kodujący purpurową barwę, jak również jego wprowadzonych dodatkowych kopii
W 1998 r. Fire i wsp. scharakteryzowali na poziomie molekularnym potranskrypcyjny mechanizm regulujący poziom mrna u C. elegans. Zjawisko nazwane interferencją RNA (RNA interference RNAi), polegało na wyciszaniu ekspresji przez dwuniciowy RNA którego jedna nić była komplementarna do fragmentu mrna wyciszanego genu. Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genu może odbywać się na zasadzie: a) degradacji mrna b) blokowanie translacji mrna
A) Degradacja mrna w przypadku degradacji mrna pośrednikami interferencji są małe dwuniciowe RNA tzw. interferujące RNA (sirna, z ang. small interfering RNA, długości 21-23 pz). Jedna z nici sirna jest komplementarna do transkryptu wyciszanego genu Skąd się biorą w komórce takie cząsteczki RNA? Powstają w wyniku trawienie z większych cząsteczek dsrna, które może być dla komórki np. sygnałem nienormalności, może pojawić się np. w wyniku infekcji wirusem RNA czy nadmierną ilością kopii genu W konsekwencji degradacji mrna odpowiedni gen jest wyciszany, bo w komórce nie powstaje białko kodowane przez ten gen Mechanizm sirna powstał najprawdopodobniej jako mechanizm obronny przed dwuniciowymi wirusami RNA (dsrna).
Jak to działa? dsrna jest dla komórki czymś niezwykłym i sygnałem nienormalności. W komórkach występuje rybonukleaza Dicer, który rozpoznaje dsrna i tnie go małe fragmenty 21-23 pz sirna. Następnie powstaje tzw. kompleks wyciszającego zwany RISC (RNAinduced silencing complex). Kompleks RISC ulega aktywacji wtedy kiedy sirna rozdzieli się na pojedyncze nici, wiąże się do mrna za pomocą antysensownego RNA. W skład kompleksu RISC wchodzi rybonukleaza Slicer, która tnie związane mrna powodując wyciszenie ekspresji genu.
RNAi jest powszechne u Eukariota (oprócz drożdży S. cerevisiae), występuje u pierwotniaków, jamochłonów, muszki owocowej, ryb, płazów, grzybów, myszy, człowieka, u różnych gatunków roślin niższych i wyższych. Zjawisko RNAi jest niezwykle specyficzne: dostarczenie do komórki (cytoplazmy) dwuniciowych cząsteczek RNA odpowiadających np. eksonom konkretnego genu powinno wywołać skuteczne obniżenie poziomu mrna specyficznego genu (poprzez degradację transkryptu). Zastosowania 1. Precyzyjne i ukierunkowane blokowanie ekspresji genów 2. Terapia genowa: np. nowotworów wstrzykiwanie sirna komplementarnego do znanych protoonkogenów
Otrzymywanie sirna do wyciszania genów 1. Iv vivo W wektorze umieszcza się odpowiednio spreparowane DNA:do nici sensownego RNA wprowadza się krótkie odcinki antysensowne, które celowo zanieczyszczają sensowną nić RNA. W wyniku ekspresji w komórkach docelowych nić sensowna i antysensowna będą mogły utworzyć odcinki dwuniciowego RNA, które po przekształceniu w sirna spowodują zahamowanie ekspresji konkretnego genu.
2. Otrzymywania sirna in vitro synteza chemiczna transkrypcja n vitro małych RNA (sirna) transkrypcja in vitro długich RNA, które będą wprowadzane do komórki i na które zadziała Dicer
Potranskrypcyjne wyciszanie genu może odbywać się na zasadzie: a) degradacji mrna b) blokowania translacji mrna W przypadku mechanizmu interferencji z translacją mrna, mediatorami są tzw. mikro- RNA (mirna), kodowane przez genom, jak normalne geny. Prekursorem są długie cząsteczki mirna, które powstają poprzez transkrypcję z DNA komórkowego na RNA przez polimerazę RNA II i tworzą struktury typu szpilki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do sirna. Następnie wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mrna. W odróżnieniu od sirna, mirna nie muszą być w 100% identyczne w sekwencji do docelowego mrna. mirna są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów np. podczas rozwoju Ocenia się, że mirna biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów