Tytuł pracy: Autor: Promotor rozprawy: Recenzenci: Funkcje białek ELAC2 i SUV3 u ssaków i ryb Danio rerio. Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii UW Lien Brzeźniak Prof. dr hab. Piotr P. Stępień Prof. dr hab. Artur Jarmołowski Prof. dr hab. Jerzy Duszyński Wprowadzenie Referowana praca opisuje wyniki badań nad funkcją białek biorących udział w metabolizmie mitochondrialnych RNA. Ludzkie białko SUV3 stanowi od dawna przedmiot badań w Instytucie Genetyki i Biotechnologii. Z kolei białko ELAC2 stanowi nowy obiekt badań wybrany jako kandydat przy poszukiwaniu genu odpowiedzialnego za aktywność trnazy Z, niezbędnej dla procesu wycinania trna z pierwotnych transkryptów mitochondrialnych. Zarówno helikaza SUV3, jak potencjalna mitochondrialna trnaza Z, są niezbędne dla prawidłowej ekspresji genomu mitochondrialnego. Ludzki genom mitochondrialny to kolista dwuniciowa cząsteczka DNA długości 16,57 kpz. Zawarta w nim informacja jest niezbędna do syntezy 13 białek, 2 mt-rrna oraz 22 mt-trna. Mitochondrialny DNA jest transkrybowany z obu nici w postaci policistronowych cząsteczek o długości prawie dorównującej wielkości genomu. Powstałe w wyniku transkrypcji cząsteczki prekursorowego RNA muszą ulec odpowiedniej obróbce endonukleolitycznej, aby mogły powstać dojrzałe mrna, rrna i trna (Rys. 1). Rys. 1.5.1 Metabolizm RNA w mitochondriach. Czerwonym kolorem oznaczono ogony poli- i oligo-(a). Zgodnie z tzw. modelem interpunkcji trna, cząsteczki mt-trna wyznaczają miejsca
działania specyficznych endonukleaz: trnazy Z i Rnazy P. Do tej pory zidentyfikowano jedynie białko odpowiedzialne za aktywność Rnazy P, odcinające cząsteczkę trna po stronie 5'. Natomiast czynnik odpowiedzialny za cięcie po stronie 3' trna mitochondrialna trnaza Z nie został jeszcze scharakteryzowany. Potencjalnym kandydatem był produkt genu ELAC2. Gen ELAC2 został pierwotnie scharakteryzowany jako czynnik związany z zapadalnością na raka prostaty. Analiza sekwencji wskazywała na to, że ELAC2 może lokalizować się w mitochondriach, jednakże według istniejących danych eksperymentalnych ELAC2 znajdował się w jądrze komórkowym. Pokazano również, że w warunkach in vitro produkt genu ELAC2 ma aktywność trnazy Z białka odpowiedzialnego za obróbkę endonukleolityczną końca 3' trna. Do tej pory jednak nie wykazano in vivo, czy białko to bierze udział w obróbce transkryptów mitochondrialnych. Białko SUV3 jest helikazą RNA lokalizującą się w mitochondriach oraz jądrze komórkowym. Badania przeprowadzone w Instytucie Genetyki i Biotechnologii wykazały, że uczestniczy ono w procesie degradacji RNA w mitochondriach. SUV3 odgrywa podstawową rolę przy usuwaniu nie tylko funkcjonalnego RNA (jak mt-mrna i mt-rrna), ale również jest niezbędne do degradacji transkryptów niekodujących ubocznych produktów ekspresji ludzkiego genomu mitochondrialnego. Niewykluczone, że helikaza SUV3 jest również zaangażowana w inne procesy związane z metabolizmem RNA w mitochondriach człowieka. Ponadto, szereg danych wskazuje na to, że białko SUV3 pełni także funkcje niezwiązane z mitochondriami. W komórkach rakowych HeLa stwierdzono między innymi, że białko SUV3 jest obecne nie tylko w mitochondriach, ale także w jądrze komórkowym i ma działanie antyapoptotyczne. Dodatkowo, jego partnerami są białka zaangażowane w procesy utrzymujące stabilność chromatyny w jądrze komórkowym. Cel pracy Celem pracy było zbadanie funkcji dwóch białek: SUV3 i ELAC2, z zastosowaniem różnych modeli komórkowych oraz dwóch organizmów modelowych: myszy Mus musculus i ryby Danio rerio. Postanowiono: 1. Ustalić lokalizację wewnątrzkomórkową produktu genu ELAC2. 2. Wykazać udział białka ELAC2 jako trnazy Z w procesie wycinania trna z prekursorów mt-rna. 3. Określić udział białka SUV3 w obróbce ludzkich mt-trna.
4. Opisać fenotypy związane z brakiem aktywności białka SUV3 u myszy i ryby Danio rerio. Wyniki 1. Białko ELAC2 ma podwójną, jądrowo mitochondrialną lokalizację wewnątrzkomórkową. Wykorzystując techniki mikroskopii fluorescencyjnej, wykazano, że w ludzkich komórkach białko ELAC2 lokalizuje się w mitochondriach i w jądrze komórkowym. Eksperyment przeprowadzono z użyciem kilku różnych linii komórkowych i dla wszystkich otrzymano podobne wyniki. 2. Produkt genu ELAC2 jest trnazą Z biorącą udział w wycinaniu trna z mitochondrialnych pierwotnych transkryptów. Aby ustalić, czy produkt genu ELAC2 pełni funkcję ludzkiej mitochondrialnej trnazy Z, zbadano wpływ białka ELAC2 na proces wycinania sekwencji trna z pierwotnych transkryptów mitochondrialnych. W tym celu przeanalizowano efektywność obróbki prekursorów mt-rna w komórkach traktowanych sirna przeciwko ELAC2. Ustalono że w komórkach z wyciszoną ekspresją genu ELAC2 zahamowane jest cięcie prekursorów mt-trna po stronie 3'. Stanowi to dowód, że istotnie ELAC2 pełni w ludzkich mitochondriach funkcję trnazy Z odpowiedzialnej za wycinanie mt-trna. Poczynione w tej pracy obserwacje dotyczą obróbki wielu mt-trna, kodowanych na różnych obszarach genomu mitochondrialnego. Poza standardowymi substratami dla trnazy Z zbadano również inne potencjalne miejsca cięcia i stwierdzono, że białko ELAC2 nie uczestniczy w obróbce antysensownych transkryptów mitochondrialnych ani transkryptów nie zawierających struktury trna. Przeprowadzono również eksperyment, w którym dodatkowo, poza ELAC2, wyciszono ekspresję genu MRPP1, kodującego podjednostkę mtrnazy P, odpowiedzialnej za wycinanie trna po stronie 5'. Na podstawie tych badań ustalono, że niedawno odkryty enzym - mtrnaza P pozbawiona składnika RNA, podobnie jak jądrowa rybonukleoproteinowa RNaza P, jako pierwsza przecina cząsteczki mitochondrialnego prekursorowego RNA, a produkt ELAC2 działa w następnej kolejności. 3. Zaburzenie funkcji SUV3 powoduje spadek poziomu dojrzałych mitochondrialnych trna. Stwierdzono, że w komórkach, w których funkcja białka SUV3 została zaburzona poprzez nadekspresję zmutowanej, nieaktywnej formy genu SUV3, poziom mt-trna ulega znacznemu
obniżeniu. Dalsza analiza pozwoliła ustalić, że obniżenie to nie jest związane ze zwiększoną degradacją mt-trna. Nie zaobserwowano również zwiększonej akumulacji cząsteczek prekursorowych związanych z zaburzeniem procesu wycinania mt-trna. 4. Białko SUV3 jest niezbędne dla prawidłowego przebiegu rozwoju zarodkowego u myszy i u ryby Danio rerio. Wpływ białka SUV3 na działanie całego organizmu zbadano poprzez scharakteryzowanie skutków obniżonej bądź wadliwej ekspresji genu SUV3 u dwóch gatunków modelowych: Myszy domowej oraz Danio pręgowanego. Charakterystyka myszy SUV3(-/-) Dzięki współpracy z J. Klysikiem (Brown University, Providence,USA) Instytut Genetyki i Biotechnologii dysponuje skonstruowanym szczepem myszy C57BL/6, w których gen SUV3 został zmutowany. Mutacja w formie homozygotycznej okazała się letalna na wczesnym postimplantacyjnym etapie rozwoju zarodkowego: po ok. 7 dniach od zapłodnienia (E 7.5). Za pomocą techniki RT-PCR ustalono, że w części zarodków rzeczywiście nie następuje ekspresja pełnej długości mrna genu SUV3. Analiza morfologiczna i histologiczna pozwoliła ustalić, że około 7 dni po zapłodnieniu rozwój zarodków SUV3(-/-) ulega znacznemu spowolnieniu, które kończy się śmiercią zarodka. Jednocześnie analiza markerów molekularnych pozwoliła stwierdzić, że gastrulacja w zarodkach homozygotycznych przebiega normalnie, jedynie z opóźnieniem odpowiadającym ocenie histologicznej. Charakterystyka larw Danio rerio z wyciszoną ekspresją genu SUV3. Przejściowe obniżenie ekspresji drsuv3 (ortologa ludzkiego hsuv3 u Danio rerio) uzyskano z pomocą Morpholino technologii opartej na analogu kwasu rybonukleinowego o sekwencji antysensownej do mrna wyciszanego genu. Zaobserwowany fenotyp charakteryzował się zmniejszoną ruchliwością, zatrzymaniem lub spowolnieniem krążenia krwi u 72h larw, obrzękiem serca oraz dysmorfią trzewioczaszki u 3 dniowych larw w porównaniu do larw kontrolnych traktowanych wodą (95% spośród 74 jaj traktowanych morpholino). Analiza ekspresji różnych genów - markerów rozwojowych Danio rerio wykazała, że opóźnienie i pierwsze zmiany morfologiczne pojawiają się na etapie gastrulacji.
Podsumowanie Wyniki przedstawione w niniejszej pracy stanowią pierwszy bezpośredni dowód na to, że za wycinanie mitochondrialnych trna po stronie 3' odpowiada u człowieka białko kodowane przez gen ELAC2. Nigdy wcześniej nie przedstawiono także danych o jednoczesnej, podwójnej jądrowomitochondrialnej lokalizacji białka ELAC2 w komórce ludzkiej. W badaniach nad funkcją białka SUV3 wykorzystano model komórkowy, a także dwa modele zwierzęce: transgeniczny szczep myszy oraz organizm modelowy w badaniach rozwoju zarodkowego ryby Danio rerio. Na podstawie otrzymanych badań można stwierdzić, że SUV3 jest niezbędny do życia już na etapie wczesnego rozwoju zarodkowego, co jest związane najprawdopodobniej z wyższym zapotrzebowaniem energetycznym podczas gastrulacji. Wyniki przeprowadzonych eksperymentów świadczą o tym, że szczególnie wrażliwe na zaburzenia poziomu SUV3 są komórki i tkanki podlegające aktywnemu procesowi różnicowania, w szczególności komórki prekursorowe dla tkanki mięśniowej, nerwowej oraz skóry. Otrzymane obserwacje są zgodne z istniejącymi danymi literaturowymi i wydają się potwierdzać antyapoptotyczną rolę białka SUV3. Część wyników przedstawionych w pracy doktorskiej weszło w skład następujących publikacji: 1. Szczesny RJ, Borowski LS, Brzezniak LK, Dmochowska A, Gewartowski K, Bartnik E, Stepien PP. Human mitochondrial RNA turnover caught in flagranti: involvement of hsuv3p helicase in RNA surveillance. 2010 Nucleic Acids Res 38(1):279-98. 2. Brzezniak LK, Bijata M, Szczesny RJ,Stepien PP. Involvement of human ELAC2 gene product in 3' end processing of mitochondrial trnas. 2011 RNA Biology (zaakceptowane do druku)