Lekowrażliwość szczepów Lactobacillus rhamnosus wyizolowanych z produktów probiotycznych

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 195-206 Lekowrażliwość szczepów Lactobacillus rhamnosus wyizolowanych z produktów probiotycznych Susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from probiotic products to antimicrobial agents Aldona Wiatrzyk; Maciej Polak; Katarzyna Krysztopa-Grzybowska; Urszula Czajka, Anna Lutyńska Zakład Badania Surowic i Szczepionek, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego - Państwowy Zakład Higieny Probiotyki posiadające status GRAS (Generaly Recognized as Safe - powszechnie uznane za bezpieczne), podane w odpowiedniej dawce są zdolne do wywołania swoistych dla danego szczepu korzystnych efektów zdrowotnych u ludzi i zwierząt. Stale wzrasta liczba produktów probiotycznych dostępnych na rynku, zaliczanych szczególnie do kategorii żywności, których jakość nie jest rutynowo monitorowana. Wśród najczęściej stosowanych probiotycznych bakterii znajdują się szczepy należące do gatunku. Przeprowadzone badania 7 wybranych produktów probiotycznych potwierdziły prawidłową identyfikację na poziomie gatunku i szczepu, deklarowaną na opakowaniu oraz możliwość zastosowania celowanej antybiotykoterapii w przypadkach zakażeń uogólnionych w sześciu na siedem badanych produktów. Słowa kluczowe: probiotyk, Lactobacillus rhamnosus, wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki, bezpieczeństwo żywności ABSTRACT Introduction: Probiotics Generally Recognized as Safe (GRAS), when given in relevant dose, are able to induce strain-specific beneficial effects for health of humans or animals. Methods: strains originating from four medicinal products, 2 dietary foods for special medical purposes and dietary supplement, were tested for susceptibility to antibiotics and chemotherapeutics following and L.rhamnosus GG strain identity confirmation with use of PCR, rep-pcr and AFLP methods. Results and Conclusions: working seeds of medicinal products and isolates originating from dietary foods for special medical purposes or dietary supplement were found

196 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 correctly classified on the levels of species or GG strain identities. Antibiotics and chemotherapeutics susceptibility profiles of strains allowed for choice of treatment options in six out of seven products under study. Key words: probiotic, lactobacilli, sensitivity to antibiotics and chemotherapeutics, food safety WSTĘP Bakterie fermentacji mlekowej, potocznie nazywane bakteriami kwasu mlekowego (LAB - lactic acid bacteria), stanowią integralną część mikroflory układu pokarmowego oraz niektórych odcinków układu oddechowego i błony śluzowej układu moczowo- -płciowego człowieka i zwierząt. Wyniki licznych badań potwierdzają, że bakterie probiotyczne hamują wzrost mikroorganizmów chorobotwórczych przez wytwarzanie związków o działaniu antybakteryjnym (19). Badania kliniczne wskazują, że podane w odpowiedniej dawce, określone probiotyczne szczepy bakterii są w stanie skracać czas trwania biegunek infekcyjnych, zmniejszać częstość ich występowania lub łagodzić przebieg biegunek poantybiotykowych lub biegunek podróżnych, a także zmniejszać objawy nietolerancji laktozy (12,17). Istnieją dane o ich korzystnym wpływie na działanie układu immunologicznego, w tym zapobieganiu atopii (18). Pewne gatunki probiotyków wytwarzają także enzymy hamujące karcynogenezę (11,24). Wyżej wymienione właściwości probiotyków stanowią jedynie wybrane przykłady spośród wielu opisanych w literaturze potencjalnych korzyści prozdrowotnego działania LAB. Ze względu na swoje prozdrowotne właściwości, szczepy probiotyczne stosowane są od dawna jako substancje czynne w produktach leczniczych, suplementach diety, dietetycznych środkach spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego lub jako dodatki do żywności. Zastosowanie szczepu probiotycznego w składzie produktów leczniczych lub należących do kategorii żywności u ludzi wymaga spełnienia szczególnych warunków, określonych przez Grupę Ekspercką Organizacji Stanów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Światową Organizację Zdrowia (WHO). Według tych zaleceń, szczep probiotyczny powinien zostać wyizolowany od człowieka, właściwie zidentyfikowany z użyciem odpowiednich fenotypowych i genotypowych metod oraz scharakteryzowany pod względem właściwości funkcjonalnych oraz bezpieczeństwa w testach in vitro i badaniach wykonywanych z udziałem zwierząt. Bezpieczeństwo danego szczepu probiotycznego powinno zostać potwierdzone u ludzi w klinicznych badaniach fazy I i II, z uwzględnieniem metody podwójnie ślepej próby, randomizacji i grupy przyjmującej placebo (8,15). W fazie II klinicznych badań, obok oceny częstości występowania działań niepożądanych, powinna zostać określona także skuteczność probiotyku. Zalecany schemat badań zapewnia, że producent wprowadzając na rynek produkt probiotyczny, zastosował szczep o niskiej patogenności dla człowieka, który może zostać zaliczony do tzw. szczepów uznawanych za bezpieczne (Generally Recognised as Safe GRAS).

Nr 3-4 Lekowrażliwość izolowanych z probiotyków 197 W badaniach nad bezpieczeństwem probiotyków, szczególnej uwagi wymaga określenie wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki oraz chemioterapeutyki, najlepiej z lokalizacją genów oporności (9,16,22,23). Niepokojące dane dotyczące słabej jakości probiotyków dostępnych na rynku oraz niedostatecznej kontroli probiotyków znajdujących się w obrocie, skłaniają do przeprowadzenia pilotażowych badań z zakresu bezpieczeństwa ich stosowania (15). Zdarzające się przypadki ogólnoustrojowych zakażeń po spożyciu niektórych probiotyków u ludzi wskazują na zasadność badań nad lekowrażliwością szczepów probiotycznych w celu ułatwienia wyboru właściwej antybiotykoterapii (14,20). Celem pracy było potwierdzenie tożsamości gatunkowej szczepów zastosowanych w składzie wybranych produktów probiotycznych oraz oznaczenie ich wrażliwości na najczęściej stosowane antybiotyki i chemioterapeutyki. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne/produkty probiotyczne. Materiał do badań stanowiło 11 szczepów : (i) 8 serii siewnych otrzymanych od wytwórców 4 produktów leczniczych 1PL, 2PL, 3PL, 4PL oraz (ii) wyizolowanych z 2 dietetycznych środków spożywczych specjalnego przeznaczenia medycznego (5DŚSSPM, 6DŚSSPM) i suplementu diety (7SD). Nazwy handlowe badanych produktów oraz oznakowanie szczepów zostały zakodowane. Charakterystykę produktów probiotycznych, stanowiących źródło analizowanych szczepów L rhamnosus pod względem składu i wskazań przedstawiono w Tabeli I. Ocenie poddano także prawidłowość oznakowania zastosowanych szczepów oraz deklarowanych wskazań. Izolacja bakterii. Zawartość opakowania bezpośredniego DŚSSPM lub SD po rozpuszczeniu i rozcieńczeniu w jałowym roztworze chlorku sodu, wysiewano na podłoże stałe de Man-Rogosa-Sharpe (MRS agar, Oxoid). Z hodowli inkubowanej w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych (GENbox anaer, BioMerieux), izolowano czyste kultury bakterii, które następnie przechowywano w temperaturze -70 C w podłożu z glicerolem. Tożsamość. Przed oznaczeniem lekowrażliwości tożsamość badanych szczepów potwierdzono metodą PCR, przy użyciu starterów specyficznych dla gatunku (21) oraz szczepu GG (2). W reakcji PCR wykorzystano JumpStart REDTaq ReadyMix (Sigma) oraz po 0,5 μm każdego ze starterów. Warunki amplifikacji obejmowały: wstępną denaturację w 95 C/3 min, 35 cykli złożonych z 95 C/30 s, 55 C/30 s, 72 C/30 s oraz końcowe wydłużanie w 72 C/5 min. Kontrolę dodatnią stanowiły szczepy referencyjne: GG ATCC 53103 i PCM 492. Genotypowanie. Podobieństwo genetyczne badanych szczepów zostało określone metodami rep-pcr (repetitive sequence based PCR) oraz AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Badanie rep-pcr wykonano zgodnie z procedurą opisaną przez Coudeyas i wsp. (4) z modyfikacjami własnymi. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: 1,5 U polimerazy (AccuTaq LA DNA Polymerase, Sigma), 200 µm dntp (Promega), po 1µM starterów BOXA1R lub REP1R-I/REP2-I oraz odpowiednio, po 2,5 mm bądź 4 mm MgCl 2. Produkty rep-pcr rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym (Sub-Cell GT Cell, Bio-Rad). Badanie AFLP przeprowadzono według zmodyfikowanej procedury opisanej przez Gzyl i wsp. (10). Do trawienia genomowego DNA wykorzystano po 5U odpowiednich enzymów

198 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 Tabela I. Charakterystyka badanych produktów probiotycznych Lp/kategoria Oznakowanie gatunku i szczepu Wskazania 1PL 2PL 3PL 4PL 5DŚSSPM 6DŚSSPM 7SD 1/1PL 2/1PL 3/1PL 1/2PL 2/2PL 3/2PL 1/3PL L. helveticus 2/3PL 1/4PL L. gasseri 2/4PL Lactobacillus rhamnosus 1/5DŚSSPM Lactobacillus rhamnosus 1/6DŚSSPM Lactobacillus rhamnosus 1/7SD Saccharomyces boulardii 2/7SD - poantybiotykowe zapalenie jelit ze szczególnym uwzględnieniem leczenia wspomagającego rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy; jako leczenie głównie przy nawracającym rzekomobłoniastym zapaleniu okrężnicy - zapobieganie biegunce podróżnych - leczenie wspomagające w czasie i po antybiotykoterapii - leczenie wspomagające w biegunkach wirusowych u dzieci - leczenie wspomagające w zaburzeniu czynnościowym jelit spowodowanym brakiem prawidłowej flory bakteryjnej - zapobieganie biegunkom podróżnych - zaburzenia jelitowe wywołane kuracją antybiotykową - nawracające rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy - zapobieganie biegunce podróżnych - leczenie wspomagające po leczeniu antybiotykami - utrzymanie lub przywrócenie prawidłowej flory bakteryjnej pochwy kobiet w wieku 18 lat i starszych - zmniejszenie ryzyka wystąpienia powikłań związanych z antybiotykoterapią - wspomaganie odporności - skrócenie czasu trwania biegunki infekcyjnej - przywrócenie równowagi mikroflory jelitowej - zmniejszenie ryzyka odwodnienia - wyrównanie zaburzeń równowagi wodno-elektrolitowej - skrócenie czasu trwania biegunki - przywrócenie równowagi mikroflory jelitowej - zmniejszenie biegunki poantybiotykowej, ostrej biegunki infekcyjnej oraz biegunek podróżnych PL produkt leczniczy, DŚSSPM - dietetyczny środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego, SD suplement diety restrykcyjnych (New England Biolabs Inc.) w układach HindIII/TaqI oraz MfeI/BglII. Do otrzymanych fragmentów DNA przy użyciu T4 ligazy DNA dołączono swoiste sekwencje adaptorów. W skład mieszaniny reakcyjnej PCR wchodziło: 1 µl DNA poddanego restrykcji i ligacji, 1,5 U polimerazy (AccuTaq LA DNA Polymerase, Sigma), 2,65 mm MgCl 2,

Nr 3-4 Lekowrażliwość izolowanych z probiotyków 199 300 lub 400 µm dntp (Promega), odpowiednio dla układu MfeI/BglII i HindIII/TaqI oraz odpowiednio 0,25/0,5 µm starterów BglII+2/MfeI+2 (5 -Cy5-GAG TAC ACT GTC GAT CTA N-3 /5 -GAG AGC TCT TGG AAT TGC C-3 ) lub 0,15/0,75 µm starterów HindIII+2/ TaqI+4 (5 -Cy5-GAC TGC GTA CCA GCT TAN-3 /5 -GAT GAG TCC TGA GCG AA-3 ). Warunki termiczne reakcji PCR dla układu HindIII/TaqI obejmowały: 1 cykl składający się z 94 C/60 s, 65 C/30 s, 72 C/60 s; 8 cykli z 94 C/30 s, temperaturą przyłączania starterów zmniejszającą się o 1 C na cykl (zaczynając od 64 C)/30 s, 72 C/60 s; 27 cykli z 94 C/30 s, 56 C/30 s i 72 C/60 s. Reakcja PCR dla układu MfeI/BglII przebiegała w następujących warukach: 94 C/3 min; 30 cykli z 94 C/60 s, 54 C/60 s, 72 C/90 s; 72 C/10 min. Produkty AFLP rozdzielano w żelu poliakrylamidowym przy użyciu ALFexpress II DNA Sequencer (Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Wyniki genotypowania zostały poddane analizie z użyciem oprogramowania BioNumerics (Applied Maths) z zastosowaniem metody klasteryzacji UPGMA i współczynnika korelacji Pearson a. W obu metodach, AFLP i rep-pcr, profile genotypowania uzyskane z zastosowaniem różnych układów starterów poddano jednoczesnej analizie z użyciem z funkcji composite data set. Lekowrażliwość.Badane szczepy, przechowywane w stanie głębokiego zamrożenia, rozmrażano, posiewano na podłoże agarowe MRS, które następnie inkubowano w temp. 37 C przez 48-72 h. Do oznaczenia lekowrażliwości zostały użyte bakterie kolejnego pasażu. Z wyhodowanych szczepów zostały sporządzone zawiesiny w 0,9% NaCl o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Posiewy i nakładanie krążków na płytki z agarem MRS o grubości 4 mm ± 0,5 mm wykonano zgodnie z zaleceniami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) (7). Do badań użyto 26 krążków z antybiotykami lub chemioterapeutykami (Oxoid i BioMerieux) tj.: penicylina (Pe 10 IU), ampicylina (AM 10 μg), amoksycylina (AMC 25 μg), piperacylina (PRL100 μg), cefuroksym (CXM 30 μg), cefotaksym (CTX 30 μg), ceftazydym (CAZ 30 μg), imipenem (IPM 10 μg), meropenem (MEM 10 μg), gentamycyna (GM 10 μg), neomycyna (N 30 μg), netylmycyna (NET 30 μg), tobramycyna (NN 10 μg), streptomycyna (S 10 μg), erytromycyna (E 15 μg), wankomycyna (VA 30 μg), doksycyklina (D 30 μg), trimetoprim-sulfametaksazol (SXT 1,25+23,75 μg), kwas nalidyksowy (NA 30 μg), klindamycyna (CC 2), kolistyna (CT 50 μg), metronidazol (MET 5 μg), teikoplanina (TEC 30 μg), cefradyna (CE 30 μg), cefepim (FEP 30 μg) oraz kloksacylina (OB 5 μg). Odczyt stref zahamowania wzrostu bakterii w mm wykonano po 48 h inkubacji płytek w temp. 37 C w atmosferze beztlenowej. W celu kontroli poprawności wykonywanych oznaczeń zastosowano 4 referencyjne szczepy o znanych profilach lekowrażliwości: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212. W celu pełnej oceny lekowrażliwości bakterii, stanowiących mieszaninę gatunków bakterii probiotycznych w określonej dawce, wykonano oznaczenie lekowrażliwości szczepów L. helveticus 2/3PL i L. gasseri 2/4PL, które obok, wchodziły w skład produktów 3PL i 4PL. Minimalne stężenie hamujące. Minimalne stężenie hamujące (MIC) wzrost badanych szczepów oceniono metodą dyfuzyjną przy użyciu pasków (E-testów M.I.C. Evaluator, Oxoid) ze stopniowo obniżającymi się stężeniami antybiotyków: gentamycyny (0,015-256 μg/ml), erytromycyny (0,015-256 μg/ml) i tetracykliny (0,015-256 μg/ml). Przygotowanie inokulum, warunki hodowli oraz szczepy referencyjne były identyczne

200 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 jak w opisanej powyżej metodzie dyfuzyjno-krążkowej i dotyczyły wszystkich produktów z wyłączeniem produktu 7SD. Klasyfikacja lekowrażliwości została przeprowadzona na podstawie wartości granicznych MIC podanych przez EFSA. WYNIKI Tożsamość. Przy użyciu reakcji PCR z zastosowaniem gatunkowo oraz szczepowo swoistych starterów potwierdzono tożsamość badanych szczepów jako, odpowiednio L. rhamnosus oraz GG. Ocena oznakowania szczepów oraz wskazań. Oznakowanie zastosowanych gatunków oraz szczepów zostało prawidłowo przedstawione na opakowaniu. Zalecane wskazania były zgodne z właściwościami probiotycznymi zastosowanych szczepów i dotyczyły stabilizacji dysfunkcji przewodu pokarmowego. Genotypowanie. Analiza profili DNA, otrzymanych z użyciem metod rep-pcr i AFLP, potwierdziła przynależność badanych szczepów do gatunku (Ryc. 2). W obu metodach, na podstawie analiz podobieństwa genetycznego, badane szczepy zostały zaklasyfikowane do 3 grup. Wysokie podobieństwo genetyczne (około 96%) występowało wśród szczepów 1/1PL, 2/1PL, 3/1PL, 2/2PL, 3/2PL i 1/3PL. Do drugiej grupy zaliczono szczep 1/2PL o wysokim genetycznym podobieństwie ze szczepem kontrolnym PCM 492. Najbardziej oddaloną genetycznie grupą od pozostałych szczepów stanowiły szczepy GG, wyizolowane z 5DŚSSPM, 6DŚSSPM, 7SD oraz szczep 1/4PL. Całkowite podobieństwo genetyczne z zastosowaniem metod AFLP i rep-pcr oszacowane wśród analizowanych szczepów GG wyniosło odpowiednio 75% i 87%. Lekowrażliwość. Szczepy probiotyczne wchodzące w skład badanych produktów wykazywały szczepowo swoiste zróżnicowanie pod względem lekowrażliwości. Różnice w lekowrażliwości poszczególnych szczepów i sumarycznym profilu lekowrażliwości produktów przedstawiono w tabeli II. Sumaryczny profil lekowrażliwości produktu leczniczego 1PL, zawierającego w składzie 3 różne szczepy wykazujące zróżnicowaną lekowrażliwość na badane penicyliny, karbapenemy, makrolidy i tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, gentamycynę, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów, wykazywał całkowitą oporność na wszystkie badane leki. W przypadku pozostałych produktów wykazano sumaryczną lekowrażliwość na: - penicyliny, karbapenemy, makrolidy, tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów w przypadku produktu 2PL, - penicyliny z wyjątkiem kloksacyliny oraz makrolidy w przypadku produktu 3PL, - penicyliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, karbapenemy, tetracykliny oraz klindamycynę z makrolidów w przypadku produktu 4PL, - penicyliny, makrolidy i tetracykliny, cefuroksym, cefotaksym i ceftazydym z cefalosporyn, imipenem z karbapenemów, neomycynę i netylmycynę z aminoglikozydów w przypadku produktu 5DŚSSPM. Produkty 6DŚSSPM i 7SD charakteryzowały się podobną sumaryczną wrażliwością na badane leki do 5DŚSSPM, przy czym 6DŚSSPM był dodatkowo wrażliwy na meropenem, z kolei 7SD w porównaniu do 6DŚSSPM był wrażliwy na gentamycynę.

Nr 3-4 Lekowrażliwość izolowanych z probiotyków 201 Ryc. 1. Podobieństwo genetyczne szczepów na podstawie wyników typowania metodami rep-pcr (A) i AFLP (B). Gwiazdkami zostały oznaczone szczepy kontrolne.

202 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 Tabela II Różnice sumarycznego profilu lekowrażliwości produktów probiotycznych oraz lekowrażliwości poszczególnych szczepów wchodzących w ich skład Strefa zahamowania wzrostu [mm] lub wartość MIC [µg/ml]* Badany produkt lub badany szczep penicyliny cefalosporyny karbapenemy aminoglikozydy makrolidy tetra-cykliny polipeptydy Pe AM AML PRL OB CXM CTX CAZ CE FEP IPM MEM GM N NET NN S E CC D TE VA TEC - - - - - - - - - - - - 16 - - - - 1 - - 8 - - L. helveticus - - - - - - - - - - - 16 - - - 1-4 - - 1PL 1/1PL 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 32* 15 24 6 6 0,25* 6 20 16* 6 6 2/1PL 40 40 40 40 26 34 30 16 12 12 13 15 16* 22 28 6 6 0,25* 36 6 >256* 6 6 3/1PL 40 40 40 40 24 31 29 19 10 6 21 16 64* 6 10 6 6 >256* 6 40 0,25* 6 6 2PL 1/2PL 30 28 30 40 20 33 22 15 10 6 21 15 32* 15 18 6 10 0,25* 21 40 0,5* 6 6 2/2PL 43 33 40 45 23 25 26 16 10 6 21 16 16* 22 26 13 6 0,12* 27 40 0,5* 6 6 3/2PL 30 29 35 38 20 30 22 14 10 6 21 18 8* 17 22 10 10 0,25* 26 38 1* 6 6 3PL 1/3PL 26 20 27 40 6 6 10 6 6 6 11 6 32* 13 18 6 6 1* 30 6 >256* 6 6 L. helveticus 2/3PL 40 40 40 40 34 40 40 30 28 38 40 40 64* 10 12 40 13 0,25* 14 39 1* 28 25 4PL 1/4PL 40 30 37 40 22 30 26 15 6 10 23 15 8* 18 22 6 6 0,06* 20 40 1* 6 6 L. gasseri 2/4PL 40 35 40 38 22 40 40 25 20 36 35 27 128* 6 10 6 6 0,25* 6 37 2* 22 21 5DŚSSPM 6 1/5DŚSSPM 34 28 34 40 20 27 26 14 6 22 10 32* 12 14 6 6 0,25* 22 35 4* 6 6 6DŚSSPM 1/6DŚSSPM 32 29 33 39 18 27 27 15 6 6 21 19 32* 14 13 6 6 0,25* 23 36 1* 6 6 7SD 1/7SD 34 29 36 40 18 28 26 13 6 6 21 14 11 13 14 6 6 38 21 39 nb 6 6 penicylina (Pe), ampicylina (AM), amoksycylina (AMC), piperacylina (PRL), cefuroksym (CXM), cefotaksym (CTX), ceftazydym (CAZ), imipenem (IPM), meropenem (MEM), gentamycyna (GM), neomycyna (N), netylmycyna (NET), tobramycyna (NN), streptomycyna (S), erytromycyna (E), wankomycyna (VA), doksycyklina (D), trimetoprim-sulfametaksazol (SXT), kwas nalidyksowy (NA), klindamycyna (CC), kolistyna (CT), metronidazol (MET), teikoplanina (TEC), cefradyna (CE), cefepim (FEP), kloksacylina (OB); PL produkt leczniczy, DŚSSPM dietetyczny środek spożywczy specjalnego przeznaczenia medycznego, SD suplement diety, nb nie badano Polami zacieniowanymi zaznaczono oporność sumaryczną na zastosowane leki. * wartości MIC (µg/ml); wartości graniczne wg EFSA MIC (µg/ml) (6)

Nr 3-4 Lekowrażliwość izolowanych z probiotyków 203 Minimalne stężenie hamujące. Otrzymane wyniki MIC przedstawiono w Tabeli II. Wartości MIC wybranych antybiotyków określono wobec referencyjnych wartości wyznaczonych przez EFSA w dokumencie z 2012 roku Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance (6). Wysokie wartości MIC, w porównaniu do stężeń podanych przez EFSA wskazujące na oporność, występowały u większości badanych szczepów dla gentamycyny (>16µg/ml). Trzy szczepy wykazywały oporność na tetracyklinę, z których dwa, wchodzące w skład produktów 1PL i 3PL, wykazywały wysoką oporność na ten antybiotyk (MIC>256µg/ml). Dwa szczepy L. rhamnosus wykazywały oporność na erytromycynę, z których jeden, wchodzący w skład produktu 1PL, wykazywał wysoką oporność na ten antybiotyk. DYSKUSJA Wzrastające spożycie preparatów zawierających probiotyki przez ludzi w każdym wieku, zarówno zdrowych jak i chorych, przyczyniło się do nasilenia działań zmierzających do optymalizacji bezpieczeństwa ich stosowania. W 2002 roku grupa robocza FAO/WHO opracowała raport Guidelines for the evaluation of probiotics in food zawierający wytyczne i zalecenia dla wytwórców produktów o statusie probiotyku (8). Zalecenia te odnoszą się nie tylko do każdego nowego szczepu probiotycznego, ale także do szczepów uprzednio zaklasyfikowanych, jako GRAS. Zastosowanie wymogów potwierdzających status GRAS szczepów probiotycznych, dotychczas obowiązujące w Stanach Zjednoczonych, jest obecnie weryfikowane przez powoływane w krajach europejskich zespoły ekspertów (BIOHAZ Panel) w celu oceny zasadności umieszczania ich na liście The Qualified Presumption of Safety (QPS). Dotychczas, jakość produktów probiotycznych, szczególnie zaliczanych do kategorii żywności w Polsce, nie jest rutynowo kontrolowana, a zasadność stosowania statusu GRAS nie podlega weryfikacji. Przeprowadzona analiza wskazań badanych produktów wykazała, że były one zgodne z udowodnionymi właściwościami, obejmującymi korzystne działanie na dysfunkcje przewodu pokarmowego. Tożsamość wszystkich badanych szczepów została potwierdzona metodami genetycznymi na poziomie gatunku lub szczepu GG, co wskazuje, że produkty probiotyczne poddane badaniom, zostały pod względem gatunku lub szczepu prawidłowo oznakowane na opakowaniu. Badania genotypowania metodami rep-pcr i AFLP, oprócz potwierdzenia tożsamości, wykazały zmienność między-szczepową GG, co może wynikać z różnic pochodzenia szczepu, liczby i warunków pasażowania, sposobu zapewnienia stabilności poprzez swoiste procedury utrzymywania serii siewnych oraz swoistych procesów wytwarzania. Wykryta zmienność między-szczepowa potwierdza zasadność podjęcia dalszych badań nad różnicami funkcjonalnymi szczepów GG, ponieważ swoiste procesy mikroewolucji mogą mieć wpływ na utrzymanie stabilności ich prozdrowotnego działania. Jednym z podstawowych wymagań oceny bezpieczeństwa stosowania probiotyków jest oznaczenie wrażliwości na antybiotyki. Ocena wrażliwości na antybiotyki, stanowiąc szczepowo swoistą cechę, posiada kluczowe znaczenie przy wyborze terapii w przypadku zdarzeń niepożądanych, kiedy w szczególnych warunkach szczep probiotyczny może stać się czynnikiem etiologicznym uogólnionego zakażenia (25). Analiza ponad 200 przypadków infekcji wywołanych tymi drobnoustrojami, wykonana przez Cannon i wsp. (3) wykaza-

204 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 ła, że w większości takich przypadków, czynnikiem etiologicznym były szczepy L. casei (35,7%) lub (22,9%), a skuteczność wdrożonej terapii zależała od zastosowania odpowiedniego leku. W większości przypadków, lekami z wyboru były: penicyliny i cefalosporyny oraz w terapii skojarzonej: penicyliny + aminoglikozydy lub cefalosporyny + aminoglikozydy. Szczepy pochodzące z badanych produktów probiotycznych posiadały charakterystyczne dla danego gatunku, ale nie identyczne, wyznaczone metodą dyfuzyjno-krążkową, profile lekowrażliwości. Lekowrażliwość szczepów wobec gentamycyny, tetracykliny i erytromycyny, dla których znane są wartości referencyjne kwalifikacji oporności szczepu wykonano zgodnie z zaleceniami EFSA. W przeprowadzonych badaniach wszystkie szczepy charakteryzowały się opornością na zastosowane chemioterapeutyki (SXT, MET, NA), co jest zgodne z wynikami otrzymanymi przez innych autorów (1,5,26). Analiza sumarycznego profilu lekowrażliwości badanych produktów wykazywała możliwość zastosowania celowanej terapii w 6 produktach na 7 badanych. Obecnie postuluje się, aby do zaleceń wyboru szczepów probiotycznych do stosowania u ludzi, wprowadzić zasadę konieczności stosowania jedynie takich szczepów, które wykazują wrażliwość na nie mniej niż 3 powszechnie stosowane antybiotyki, co umożliwia racjonalny wybór terapii w przypadku wywołania zakażeń inwazyjnych (13). W kontekście tego zalecenia bezpieczeństwo stosowania jednego z produktów leczniczych 1PL pozostaje wątpliwe ze względu na fakt, że skład szczepów w ujęciu całościowym warunkował oporność na wszystkie badane antybiotyki i chemioterapeutyki. Należy podkreślić, że w przypadku tego produktu wytwórca powinien ocenić czy inne związki mogą zagwarantować opcje terapeutyczne w przypadku zakażeń ogólnoustrojowych. Otrzymane wyniki MIC wskazują także na konieczność podjęcia badań nad lokalizacją genów oporności na gentamycynę (10 z 13 badanych szczepów), erytromycynę (3 z 13 badanych szczepów) i tetracyklinę (4 z 13 badanych szczepów). Potencjalna obecność ruchomych elementów genetycznych wśród szczepów Lactobacillus spp., tj transpozonów lub plazmidów, może stwarzać ryzyko przeniesienia genów oporności na inne komensalne lub patogenne bakterie, bytujące w tej samej niszy. W piśmiennictwie dostępne są wyniki badań przeprowadzonych in vitro potwierdzające możliwość transferu genów oporności różnych szczepów probiotycznych do innych bakterii (9 12). Pomimo, że większość badań wskazuje na naturalny charakter oporności na wankomycynę (6) istnieją także przesłanki o możliwości transferu operonu vana zlokalizowanego na plazmidach lub transpozonach do innych gatunków lub rodzajów bakterii, w tym bakterii probiotycznych na drodze horyzontalnego transferu genów (29,30). Ze względu na niedostateczną wiedzę na temat podłoża oporności szczepów stosowanych w składzie DŚSSPM i SD określenie lokalizacji wykrytej oporności na gentamycynę, tetracyklinę i erytromycynę oraz potwierdzenia naturalnego charakteru oporności na wankomycynę jest wysoce uzasadniona. PODSUMOWANIE 1. Potwierdzono, że zależny od szczepu charakter wrażliwości na badane antybiotyki i chemioterapeutyki zapewnia opcje terapeutyczne w 6 na 7 badanych produktów probiotycznych.

Nr 3-4 Lekowrażliwość izolowanych z probiotyków 205 2. Wyniki genotypowania metodami rep-pcr i AFLP potwierdziły różnice genetyczne wśród szczepów GG wyizolowanych z badanych produktów probiotycznych, które mogą być wynikiem mikroewolucji swoistej dla danego procesu wytwarzania. Finansowanie Praca została wykonana w ramach realizacji projektu statutowego NIZP-PZH nr 1/EM 3N. PIŚMIENNICTWO 1. Blaiotta G, Capua M Di, Coppola R, Aponte M. Production of fermented chestnut purees by lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 2012; 158: 195 202. 2. Brandt K, Alatossava T. Specific identification of certain probiotic Lactobacillus rhamnosus strains with PCR primers based on phage-related sequences. Int J Food Microbiol 2003; 84: 189 96. 3. Cannon JP, Lee TA, Bolanos JT, Danziger LH. Pathogenic relevance of Lactobacillus: a retrospective review of over 200 cases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 31 40. 4. Coudeyras S, Marchandin H, Fajon C, Forestier C. Taxonomic and strain-specific identification of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus 35 within the Lactobacillus casei group. Appl Environ Microbiol 2008; 74: 2679 89. 5. Danielsen M, Wind A. Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int J Food Microbiol 2003; 82 :1 11. 6. EFSA. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). EFSA J 2012; 10: 2740. 7. EUCAST. Reading guide. EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing. 2014. 8. FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, 2002. 9. Gevers D, Huys G, Swings J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Lett 2003; 225: 125 30. 10. Gzyl A, Augustynowicz E, Mosiej E i inni. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) versus randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) as new tools for inter- and intra-species differentiation within Bordetella. J Med Microbiol 2005; 54: 333 46. 11. Heczko P B, Strus M, Jawień M, Szymański H. Medyczne zastosowanie probiotyków. Wiad Lek 2005; LVIII: 11 2. 12. Jach M, Łoś R, Maj M, Malm A. Probiotyki - aspekty funkcjonalne i technologiczne. POST MIKROBIOL 2013; 52: 161 70. 13. Klare I, Konstabel C, Werner G i inni. Antimicrobial susceptibilities of Lactobacillus, Pediococcus and Lactococcus human isolates and cultures intended for probiotic or nutritional use. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 900 12. 14. Kochan P, Chmielarczyk A, Szymaniak L i inni. Lactobacillus rhamnosus administration causes sepsis in a cardiosurgical patient is the time right to revise probiotic safety guidelines? Clin Microbiol Infect 2011; 17: 1589 92. 15. Lutyńska A, Augustynowicz E, Wiatrzyk A. Problemy stosowania suplementów diety zawierających probiotyki. Probl Hig Epidemiol 2012; 93: 493 8. 16. Nawaz M, Wang J, Zhou A i inni. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products. Curr Microbiol 2011; 62: 1081 9.

206 A. Wiatrzyk i inni Nr 3-4 17. Ouwehand AC, DongLian C, Weijian X i inni. Probiotics reduce symptoms of antibiotic use in a hospital setting: a randomized dose response study. Vaccine 2014; 32: 458 63. 18. Ozdemir O. Various effects of different probiotic strains in allergic disorders: an update from laboratory and clinical data. Clin Exp Immunol 2010; 160: 295 304. 19. Rijkers GT, Bengmark S, Enck P i inni. Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics: current status and recommendations for future research. J Nutr 2010; 140: 671 6. 20. Sadowska-Krawczenko I, Paprzycka M, Korbal P i inni. Lactobacillus rhamnosus GG suspected infection in a newborn with intrauterine growth restriction. Benef Microbes 2014; 5: 397 402. 21. Song Y, Kato N, Liu C i inni. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S-23S rrna intergenic spacer region and its flanking 23S rrna. FEMS Microbiol Lett 2000; 187: 167 73. 22. Toomey N, Monaghan Á, Fanning S i inni. Assessment of antimicrobial resistance transfer between lactic acid bacteria and potential foodborne pathogens using in vitro methods and mating in a food matrix. Foodborne Pathog Dis 2009; 6: 925 33. 23. Toomey N, Monaghan Á, Fanning S, Bolton DJ. Assessment of horizontal gene transfer in Lactic acid bacteria A comparison of mating techniques with a view to optimising conjugation conditions. J Microbiol Methods 2009; 77: 23 8. 24. Verma A, Shukla G. Probiotics Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus suppresses DMH-induced procarcinogenic fecal enzymes and preneoplastic aberrant crypt foci in early colon carcinogenesis in Sprague Dawley rats. Nutr Cancer 2013; 65: 84 91. 25. Yang C, Wang D, Zhou Q, Xu J. Bacteremia due to vancomycin-resistant Leuconostoc lactis in a patient with pneumonia and abdominal infection: Am J Med Sci 2015; 349: 282 3. 26. Zhou JS, Pillidge CJ, Gopal PK, Gill HS. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Int J Food Microbiol 2005; 98: 211 7. Otrzymano: 13 XI 2015 r Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Badania Surowic i Szczepionek Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny e-mail: awiatrzyk@pzh.gov.pl