QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka

QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA 708665 Do diagnostyki in vitro Złożoność CLIA: Wysoka Przeznaczenie QUANTA Lite β 2 GPI IgG jest to test immunoenzymatyczny (ELISA) do półilościowego wykrywania przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI w surowicy człowieka. W połączeniu z wynikami klinicznymi i innymi testami laboratoryjnymi do wspomagania diagnozy pewnych autoimmunologicznych zaburzeń płytkowych, takich jak te pojawiające się w następstwie tocznia rumieniowatego układowego (SLE), lub innych zaburzeń podobnych do tocznia można wykorzystać badanie na obecność przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI. Podsumowanie i wyjaśnienie testu Występowanie przeciwciał przeciwko kardiolipinie (ACA) ma ścisły związek z zakrzepicą tętniczą i żylną. 1-5 Zaobserwowano to po raz pierwszy w badaniach nad toczniem rumieniowatym układowym chorobą, której jednym z wielu objawów jest zakrzepica. 6,7 Ostanie badania 8-12 wykazały, że aby przeciwciała przeciwko kardiolipinie, które pojawiły się u pacjentów z SLE, związały się z kardiolipiną, którą opłaszczono plastikowe płytki, potrzebny jest występujący w surowicy kofaktor o masie 50 kd. Ustalono, że kofaktorem tym jest β 2 -glikoproteina I nazywana również apolipoproteiną H. 8,12,13,14 Chociaż wiadomo było, że β 2 GPI jest in vitro inhibitorem wewnątrzpochodnego szlaku krzepnięcia krwi, 15 zależnej od ADP agregacji płytek, 16 i aktywności protrombinazy aktywowanych płytek krwi, 17 to jego funkcja fizjologiczna pozostaje nadal niewyjaśniona. Stało się jasne, że przeciwciała przeciwko kardiolipinie pacjentów cierpiących na zespół antyfosfolipidowy (APS) rozpoznają zmodyfikowaną strukturę β 2 GPI a nie kardiolipinę, natywną β 2 GPI bądź epitop definiowany strukturalnie zarówno przez kardiolipinę jak i β 2 GPI. 8-12 Galli i wsp. 9 oraz Viard i wsp. 18 niezależnie od siebie wykazali, że przeciwciała przeciw kardiolipinie pochodzące od autoimmunologicznych pacjentów (tzn. SLE i/lub APS) zostały skierowane na cząsteczkę GPI β 2 naniesioną na płytki polistyrenowe. Koike 11 i Matsuura 12 wykazali bezspornie, że β 2 GPI rzeczywiście jest antygenem, z którym łączy się wiele przeciwciał przeciw-kardiolipinia pacjenta, a co więcej wykazali oni, że fosfolipid zaledwie służy do łączenia β 2 GPI z fazą stałą. Dobrze wiadomo, że tradycyjne testy wykrywające przeciwciała przeciwko kardiolipinie z dużą częstością dają wyniki fałszywie pozytywne, co spowodowane jest reaktywnością krzyżową fosfolipidów z pewnymi próbkami od pacjentów cierpiących na choroby zakaźne, zwłaszcza w przypadku syfilisu jak również w przypadku pewnych innych autoprzeciwciał takich jak przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA. 2,3 Dzięki wyeliminowaniu fosfolipidów z fazy stałej i zastosowaniu wyłącznie β 2 GPI, uzyskuje się jeszcze większą swoistość testu pod względem wykrywania potencjalnych zaburzeń krzepnięcia. Tę zwiększoną swoistość wykazało kolejno kilka grup. 11,12,16,17,19,20,21,22 Test autoprzeciwciał β 2 GPI jest przydatnym i bardziej swoistym badaniem, które może być stosowane wraz z tradycyjnie stosowanymi testami na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie i antykoagulantów tocznia w celu wsparcia diagnozy zakrzepicy u pacjentów podwyższonego ryzyka. U 17 z 47 pacjentów z SLE (36%) stwierdzono występowanie przeciwciał klasy IgG przeciwko β 2 GPI. 18 U dziewięciu z tych 47 pacjentów z SLE występowała zakrzepica, a u 8 z nich (89%) przeciwciała przeciwko β 2 GPI. Hisham i wsp. 20 znalazł przeciwciała klasy IgG β 2 GPI u wszystkich 5 pacjentów (100%) z przynajmniej 2 udokumentowanymi przypadkami klinicznymi APS. U wszystkich 5 pacjentów stwierdzono wysokie poziomy przeciwciał β 2 GPI. U ośmiu z 14 pacjentów (57%) ze stwierdzonym niskim poziomem przeciwciał β 2 GPI występowało przynajmniej 1 zdarzenie zakrzepowe. Tsutsumi i wsp. 22 znaleźli przeciwciała IgG i IgM dla β 2 GPI odpowiednio w 10,1% i 5,8% z 308 losowo wybranych japońskich pacjentów z SLE. Przeciwciała IgG β 2 GPI występowały częściej u pacjentów z historią zakrzepicy. Ta grupa również wykazała, że 15 pacjentów z nawracającymi poronieniami na poziomie 20% miało pozytywny wynik IgG β 2. Wykazano również, że pacjenci z historią zakrzepicy częściej mieli pozytywny wynik dla IgM β 2 GPI oraz że poziomy IgM β 2 GPI były wyższe w grupie z zakrzepicą niż w grupie bez niej. Spośród 15 pacjentek bez historii poronień, żadna nie miała wyniku pozytywnego IgM β 2 GPI. Cabiedes i wsp. 23 przebadali 94 pacjentów z SLE, z których 39 miało kliniczne oznaki APS. Zespół oznak klinicznych APS był silniej powiązany z przeciwciałami β 2 GPI niż z pozytywnymi wynikami w konwencjonalnych testach ACA. Przeciwciała IgG β 2 GPI występowały w surowicy 16 z 18 pacjentów (89%) z APS. Spośród 22 pacjentów z pozytywnym wynikiem na ACA, ale bez klinicznych oznak APS, żaden nie miał pozytywnego wyniku β 2 GPI. Cerrato i wsp. 24 stwierdzili obecność przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI u 87,5% w grupie 32 pacjentów z historią zakrzepicy (APS). Przeciwciała IgM przeciw-β 2 GPI zostały stwierdzone u 71,9% z tej samej grupy 32 pacjentów. Sebastiani i wsp. 25 wykryli przeciwciała IgG przeciwko β 2 GPI u 110 pacjentów (20,3%) i przeciwciała IgM u 109 pacjentów (20,1%) spośród wszystkich 542 pacjentów z SLE. Obecność przeciw-β 2 GPI była silnie powiązana z ACA (p < 10-5 ). Następnie badania wykazały, że przeciwciała IgG i IgM β 2 GPI były powiązane z zakrzepicą tętniczą i żylną. 1

Zasada badania Oczyszczony antygen β 2 GPI wiąże się z dołkami płytek polistyrenowych w warunkach, które zabezpieczają antygen w jego naturalnym stanie. Wstępnie rozcieńczone kontrole oraz surowice pacjentów są dodawane do oddzielnych dołków umożliwiając związanie wszelkich występujących przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI z unieruchomionym antygenem. Niezwiązana próbka jest wypłukiwana i do każdego dołka dodawany jest koniugat znakowanego enzymem przeciwciała przeciw-ludzkiego IgG. Druga inkubacja umożliwia przeciwciałom przeciw-ludzkim IgG znakowanym enzymem związać się z dowolnymi przeciwciałami pacjenta, które zostały przytwierdzone do mikrodołków. Po wypłukaniu wszelkich niezwiązanych przeciwciał przeciw-ludzkich IgG znakowanych enzymem, aktywność pozostałego enzymu bada się dodając substrat chromogeniczny i mierząc intensywność powstałej barwy. Test ten można poddać ocenie spektrofotometrycznej, mierząc i porównując intensywność barwy, która powstaje w dołkach z próbkami potrzebnymi do wyznaczenia 5-punktowej krzywej kalibracji. Wzorzec użyty do sporządzenia tej krzywej porównuje się z kalibratorami referencyjnymi dla IgG przeciwko β 2 -glikoproteinie I uzyskanymi z Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's Hospital and Medical Center. 26 Wyniki podano w postaci półilościowej w standardowych jednostkach używanych do pomiaru poziomu przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI - SGU. Odczynniki 1. Polistyrenowe płytki z mikrodołkami ELISA pokryte oczyszczonym antygenem β 2 GPI (12-1 x 8 dołków), z uchwytem w torebce foliowej zawierającej osuszacze 2. Kontrola negatywna ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i surowicę ludzką bez ludzkich przeciwciał IgG przeciwko β 2 GPI, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 3. Kontrolaβ 2 GPI IgG ELISA Control, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG surowicy ludzkiej przeciwko β 2 GPI, wstępnie rozcieńczona, 1,2 ml 4. Kalibrator Aβ 2 GPI IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG 5. Kalibrator Bβ 2 GPI IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG 6. Kalibrator Cβ 2 GPI IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG 7. Kalibrator Dβ 2 GPI IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG 8. Kalibrator Eβ 2 GPI IgG ELISA, 1 fiolka buforu zawierająca środek konserwujący i przeciwciała IgG 9. Rozcieńczalnik do próbek HRP, 1 fiolka zabarwienie różowe, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS, Tween 20, stabilizatory białka i konserwant, 50 ml 10. Koncentrat do płukania HRP, 1 fiolka koncentratu 40x zabarwienie czerwone, zawiera sól fizjologiczną buforowaną TRIS i Tween 20, 25 ml. Instrukcje dotyczące rozcieńczania można znaleźć w sekcji Metody. 11. Koniugat β 2 HRP IgG, (kozi), przeciw-ludzki, 1 fiolka zabarwienie niebieskie, zawiera bufor, stabilizatory białka i konserwant, 10 ml 12. Chromogen TMB, 1 fiolka zawierająca stabilizatory, 10 ml 13. Roztwór zatrzymujący HRP, kwas siarkowy 0,344 M, 1 fiolka bezbarwny Ostrzeżenia 1. OSTRZEŻENIE: Ten produkt zawiera substancję chemiczną (0,02% chloramfenikol) w rozcieńczalniku do próbek, kontrolach i koniugacie, która według stanu Kalifornii wywołuje raka. 2. Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono, że nie zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W związku z tym, kontrola β 2 GPI IgG ELISA, kalibratory β 2 GPI IgG ELISA oraz kontrola negatywna ELISA powinny być obsługiwane w taki sam sposób, jak potencjalnie zakaźny materiał. 27 3. Jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy. Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku. 4. Koniugat HRP zawiera rozcieńczoną trującą/korozyjną substancję chemiczną, która może być toksyczna w przypadku spożycia w dużej ilości. Aby uniknąć potencjalnych oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 5. Chromogen TMB zawiera środek drażniący, w który może być szkodliwy w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Aby uniknąć urazów, należy unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą i oczami. 6. Roztwór zatrzymujący HRP składa się z rozcieńczonego roztworu kwasu siarkowego. Unikać wystawienia na działanie zasad, metali lub innych związków, które mogą wchodzić w reakcje z kwasami. Kwas siarkowy jest trucizną i ma właściwości korozyjne. W razie połknięcia może być toksyczny. Aby uniknąć oparzeń chemicznych, należy unikać kontaktu ze skórą i oczami. 7. Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. 8. Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i 2

lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów. Środki ostrożności 1. Ten produkt jest przeznaczony do zastosowań diagnostycznych in vitro. 2. Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować osiągnięciem niespójnych wyników. 3. Niepełne lub nieprawidłowe płukanie i niewystarczające usunięcie płynu z płytek z dołkami ELISA wpłynie negatywnie na precyzję badań i/lub spowoduje wysoki poziom tła. 4. Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań mieszczą się w akceptowalnych limitach. 5. Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową odczynników, temperaturę otoczenia, dokładność i powtarzalność techniki pipetowania, dokładność płukania i usuwania płynu z dołków płytek ELISA, fotometr użyty do analizy wyników oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji. 6. Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej. 7. Niedokładne zamknięcie torebki z zamknięciem strunowym, zawierającej płytki z mikrodołkami i osuszaczami, spowoduje degradację antygenu i brak precyzji badania. 8. Dwukrotne lub wielokrotne użycie koniugatu HRP z jednej butelki w pewnym okresie czasu może spowodować niedopuszczalnie niski poziom absorbancji. Aby nie dopuścić do takiej sytuacji istotne jest przestrzeganie wszystkich zaleceń dotyczących procedur pracy z koniugatem HRP. 9. Zanieczyszczenie chemiczne koniugatu HRP może być spowodowane nieprawidłowym czyszczeniem lub płukaniem sprzętu lub narzędzi. Pozostałości typowych laboratoryjnych substancji chemicznych, takich jak formalina, substancja wybielająca, etanol lub detergent, z czasem spowoduje degradację koniugatu HRP. Po użyciu chemicznych substancji czyszczących/dezynfekujących dokładnie wypłukać cały sprzęt i wszystkie narzędzia. Warunki przechowywania 1. Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamrażać. Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane zgodnie z instrukcjami. 2. Nieużyte płytki z mikrodołkami pokrytymi antygenem powinny być starannie zamknięte w torebce foliowej z osuszaczami i przechowywane w temperaturze 2 8 C. 3. Rozcieńczony bufor do płukania zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 C. Pobieranie próbek Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek. Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CSLI (uprzednio) NCCLS H18-A2 zaleca następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę do temperatury 2 8 C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20 C lub niższej. Zamrożone próbki po rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane. Badanie Dostarczone materiały 1 Płytka z mikrodołkami testu β 2 GPI ELISA (12-1 x 8 dołków), z uchwytem 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej testu ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonej kontroli β 2 GPI IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora A β 2 GPI IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora B β 2 GPI IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora C β 2 GPI IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora D β 2 GPI IgG ELISA 1 1,2 ml wstępnie rozcieńczonego kalibratora E β 2 GPI IgG ELISA 1 50 ml rozcieńczalnika do próbek HRP 1 25 ml koncentratu do płukania HRP, koncentrat 40x 1 10 ml koniugatu β 2 HRP IgG, (kozie), przeciw-ludzkie IgG 1 10 ml chromogenu TMB 1 10 ml roztworu zatrzymującego HRP, kwas siarkowy 0,344M Wymagane materiały nie dołączone do zestawu Mikropipety na 5, 100, 200 300 i 500 µl Jednorazowe końcówki mikropipet Probówki do roztworów próbek pochodzących od pacjenta, 4 ml objętości Woda destylowana lub dejonizowana Naczynie o objętości 1 l do rozcieńczonego koncentratu HRP do płukania Czytnik płytek z mikrodołkami umożliwiający pomiar gęstości optycznej przy 450 nm (i przy 620 nm dla odczytów przy dwóch długościach fali) 3

Sposób przygotowania Przed rozpoczęciem 1. Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20-26 o C) i dobrze wymieszać. 2. Rozcieńczyć koncentrat do płukania HRP w stosunku 1:40, dodając zawartość butelki koncentratu do płukania HRP do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Jeśli cała płytka nie zostanie przetworzona w tym czasie, można przygotować mniejszą ilość. W tym celu należy dodać 2,0 ml koncentratu do 78 ml wody destylowanej lub dejonizowanej na każde 16 dołków, które będą użyte. Rozcieńczony bufor zachowuje trwałość przez 1 tydzień w temperaturze 2 8 o C. 3. Przygotować roztwór 1:101 każdej próbki pobranej od pacjenta, dodając 5 µl próbki do 500 µl rozcieńczalnika do próbek HRP. Rozcieńczone próbki muszą być użyte w ciągu 8 godzin od przygotowania. NIE ROZCIEŃCZAĆ kalibratorów β 2 GPI IgG ELISA, kontroli β 2 GPI IgG ELISA ani kontroli negatywnej ELISA. 4. Oznaczanie obecności lub braku przeciwciał przeciwko β 2 wymaga dwóch dołków dla każdego kalibratora i każdej kontroli oraz jednego lub dwóch dołków dla każdej próbki otrzymanej od pacjenta. Zalecane jest wykonanie duplikatów próbek. 5. Przygotowanie krzywej wzorcowej: Dla punktów od A do E 5-punktowej krzywej wzorcowej stosować WSTĘPNIE ROZCIEŃCZONE kalibratory A do E β 2 GPI IgG ELISA bezpośrednio z fiolki. Pięciopunktowa krzywa wzorcowa ma następujące wartości: Punkt Wzorzec IgG β 2 GPI jednostki (SGU) A Wstępnie rozcieńczony kalibrator A β 2 GPI IgG ELISA 150,0 B Wstępnie rozcieńczony kalibrator B β 2 GPI IgG ELISA 75,0 C Wstępnie rozcieńczony kalibrator C β 2 GPI IgG ELISA 37,5 D Wstępnie rozcieńczony kalibrator D β 2 GPI IgG ELISA 18,8 lub 18,75 E Wstępnie rozcieńczony kalibrator E β 2 GPI IgG ELISA 9,4 lub 9,375 Procedura badania 1. WSZYSTKIE ODCZYNNIKI PRZED ROZPOCZĘCIEM BADANIA MUSZĄ BYĆ DOPROWADZONE DO TEMPERATURY POKOJOWEJ (20 26 C). Umieścić wymaganą liczbę mikrodołków/pasków w uchwycie. Natychmiast umieścić nieużywane płytki w torebce foliowej zawierającej osuszacz i dobrze ją zamknąć, aby ograniczyć kontakt z parą wodną. 2. Dodać do dołków po 100 µl każdego z pięciu kalibratorów, rozcieńczonych próbek otrzymanych od pacjentów, kontroli negatywnej testu ELISA i kontroli β 2 GPI IgG ELISA. UWAGA: Zarówno kontrola β 2 GPI IgG ELISA jak i kontrola negatywna testu ELISA są wstępnie rozcieńczone i gotowe do użycia. Wartość i dopuszczalny zakres kontroli β 2 GPI IgG ELISA jest nadrukowany na etykiecie fiolki. Jeśli kontrola nie wypadnie w dopuszczalnym zakresie zgodnym z tym wydrukowanym na etykiecie, należy powtórzyć serię. 3. Przykryć dołki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na równej powierzchni. Czas inkubacji rozpoczyna się po dodaniu ostatniej próbki. 4. Etap płukania: Odessać całkowicie zawartość każdego dołka. Dodać 200 300 µl rozcieńczonego buforu do płukania HRP do wszystkich dołków, a następnie odessać. Powtórzyć tę sekwencję jeszcze dwukrotnie, aby łącznie przeprowadzić trzy płukania. Odwrócić płytkę i postukać w nią na materiale pochłaniającym w celu usunięcia pozostałości płynu po ostatnim płukaniu. Ważne jest, aby całkowicie opróżnić każdy dołek po każdym etapie płukania. Zachować tę samą sekwencję odsysania, jak w przypadku dodawania próbki. 5. Do każdego dołka dodać 100 μl koniugatu β 2 HRP IgG. Koniugat powinien być usunięty z butelek z zastosowaniem standardowych warunków aseptycznych oraz zalecanych technik laboratoryjnych. Pobrać z butelki jedynie wymaganą do analizy ilość koniugatu. ABY UNIKNĄĆ POTENCJALNEGO ZANIECZYSZCZENIA BAKTERYJNEGO I/LUB CHEMICZNEGO, NIE WOLNO WLEWAĆ NIEUŻYTEGO KONIUGATU Z POWROTEM DO BUTELKI. Inkubować dołki przez 30 minut jak w etapie 3. 6. Etap płukania: Powtórzyć etap 4. 7. Dodać 100 µl chromogenu TMB do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 8. Do każdego dołka dodać 100 µl roztworu zatrzymującego HRP. Zachować tę samą sekwencję i czas dodawania roztworu zatrzymującego HRP, jak w przypadku chromogenu TMB. Delikatnie postukać płytkę palcem, aby dokładnie wymieszać zawartość dołków. 9. W ciągu jednej godziny od zatrzymania reakcji odczytać absorbancję (gęstość optyczną) każdego dołka przy długości fali 450 nm. Jeśli wymagane są pomiary bichromatyczne, referencyjną długością fali może być długość 620 nm. Kontrola jakości 1. Aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury funkcjonują prawidłowo, każdą serię próbek należy testować wraz z kalibratorami β 2 GPI IgG ELISA, kontrolą β 2 GPI IgG ELISA i kontrolą negatywną ELISA. 2. Należy zauważyć, że ponieważ kalibratory β 2 GPI IgG ELISA, kontrola β 2 GPI IgG ELISA i kontrola negatywna ELISA są już wstępnie rozcieńczone, to nie będą one stanowić kontroli w przypadku procedur związanych z rozcieńczaniem próbek. 4

3. Dodatkowe kontrole mogą być przebadane zgodnie z wytycznymi lub wymaganiami lokalnych i/lub krajowych przepisów lub organów normalizacyjnych. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować, dzieląc połączone próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze < - 20 C. 4. Aby wyniki badania mogły być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek kryterium nie będzie spełnione, badanie powinno być traktowane jako nieważne i powinno zostać powtórzone. a. Absorbancja wstępnie rozcieńczonego kalibratora A β 2 GPI IgG ELISA musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli β 2 GPI IgG ELISA, która musi być większa niż absorbancja wstępnie rozcieńczonej kontroli negatywnej ELISA. b. Absorbancja wstępnie rozcieńczonego kalibratora A β 2 GPI IgG ELISA musi być większa niż 1,0, a absorbancja wstępnie rozcieńczonej negatywnej kontroli ELISA nie może być większa niż 0,2. c. Absorbancja kontroli β 2 GPI IgG ELISA musi dwukrotnie przewyższać absorbancję kontroli ujemnej ELISA lub powinna przekraczać 0,25. d. Stężenie kontroli β 2 GPI IgG ELISA musi mieścić się w zakresie podanym na etykiecie. e. Dodatkowe wytyczne dotyczące odpowiednich praktyk QC można znaleźć w dokumencie CLSI (uprzednio NCCLS) C24-A2. Obliczanie wyników 1. Ustalić wartość średnią wszystkich zdublowanych odczytów. 2. Wykreślić krzywą średniej absorbancji kalibratorów dla badania IgG w funkcji logarytmu ich stężeń. Użyć wykresu krzywej najlepszego dopasowania. Można również użyć wykresu logarytmicznego. Jednostki SGU przypisane do kalibratorów znajdują się na fiolce kalibratora. 3. Określić nieznane stężenie β 2 GPI IgG w standardowych jednostkach β 2 GPI IgG (SGU) z osi X odczytując odpowiednią absorbancję na osi Y. Kalibrator i kontrolę dla tego zestawu porównuje się z wzorcami referencyjnymi IgG β 2 -glikoproteiny I. 4. Wartości negatywnych mieszczą się w zakresie od 0 do 20 jednostek. Wyniki pozytywne to takie, dla których wartość SGU przewyższa 20. Interpretacja wyników Badanie ELISA jest bardzo wrażliwe na technikę i jest w stanie wychwycić nawet najdrobniejsze różnice w populacjach pacjentów. Każde laboratorium powinno ustalić własny normalny zakres na podstawie własnych technik, kontroli, sprzętu i populacji pacjentów, zgodnie z własnymi ustalonymi procedurami. 1. Pozytywny wynik wskazuje na obecność przeciwciał β 2 GPI IgG i sugeruje możliwość wystąpienia pewnych autoimmunologicznych zaburzeń płytkowych, takich jak te pojawiające się w następstwie tocznia rumieniowatego układowego lub innych podobnych do tocznia chorób płytkowych. 2. Wynik negatywny świadczy o tym, że nie występują przeciwciała IgG przeciwko β 2 GPI, lub że ich poziom jest poniżej granicy wykrywania dla tego testu. 3. Zalecane jest, aby wyniki raportowane przez laboratorium zawierały oświadczenie: Poniższe wyniki otrzymano przy wykorzystaniu zestawu INOVA QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA. Nie można stosować zamiennie wartości IgG przeciwko β 2 GPI uzyskanych przy zastosowaniu metod testowych innych producentów. Rząd wielkości poziomów raportowanego IgG nie może być skorelowany z mianem punktu końcowego. Ograniczenia badania 1. Obecnie prowadzone są analizy znaczenia klinicznego przeciwciał β 2 GPI w przypadku chorób innych niż SLE. 2. Jeśli zostaną znalezione ujemne miana anty-β 2 GPI, przy obecności wskazań klinicznych, wskazane może być przeprowadzenie badanie na obecność antykoagulantu tocznia lub przeciwciał przeciwko kardiolipinie i inne dodatkowe badania. 3. Nie można postawić diagnozy na podstawie samych wyników przeciw-β 2 GPI. Te wyniki muszą być interpretowane razem z wynikami fizycznymi. 4. Nie wolno rozpocząć leczenia jedynie na podstawie pozytywnego miana przeciw-β 2 GPI. Muszą być również wykazane uzasadniające wskazania kliniczne. 5. Należy się spodziewać, że niektóre próbki mogą być pozytywne przeciw-kardiolipinie a mimo to negatywne przeciw-β 2 GPI. Test przeciw-β 2 GPI jest bardziej swoistym znacznikiem ryzyka zakrzepowego. Test przeciw kardiolipinie może wygenerować fałszywe pozytywne wyniki na skutek reakcyjności krzyżowej z dsdna lub określonymi przeciwciałami chorób zakaźnych. 6. Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica. 5

Spodziewane wartości Próbki z warsztatów - 7th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies - New Orleans (7 Międzynarodowe Sympozjum nt. Przeciwciał Antyfosfolipidowych w Nowym Orleanie) W celu oceny wydajności różnych testów opartych na badaniach i komercyjnych testów na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie przeprowadzono warsztaty stanowiące część 7 sympozjum nt. przeciwciał antyfosfolipidowych, które odbywało się w dniach 9-13 października 1996. Do przebadania tych próbek zastosowano zestaw QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA. Panel obejmował 10 próbek pochodzących od pacjentów z udokumentowanym zespołem antyfosfolipidowym (APS), 7 próbek od pacjentów cierpiących na choroby zakaźne takie jak syfilis i gorączka Q, 2 próbki od pacjentów z autoimmunologiczną chorobą reumatyczną a 11 stanowiły próbki normalne. Próbki te badano również przy użyciu tradycyjnego testu na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie. Poniżej zostały przedstawione wyniki. Grupa Nr. Nr. + Nr.+ Próbki β 2 GPI Kardiolipina APS 10 10 10 Zakaźne 7 0 4 Reumatyczne 2 1 2 Normalne 11 0 1 Przeciwciała przeciwko β 2 GPI i kardiolipinie zostały znalezione u wszystkich 10 pacjentów z APS. W przypadku trzech innych grup pacjentów, wszystkie próbki w teście β 2 GPI dały wynik negatywny z wyjątkiem jednej próbki od osoby cierpiącej na chorobę reumatyczną. Cztery próbki od osób cierpiących na choroby zakaźne, obie próbki od osób cierpiących na choroby reumatyczne oraz 1 z jedenastu próbek normalnych dało wynik pozytywny w tradycyjnym teście na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie. Specyficzna charakterystyka wyników Podsumowanie wyników uzyskanych w badaniach klinicznych Wydajność testu QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA określono w 4 zewnętrznych i 1 wewnętrznym badaniu klinicznym.. Wyniki przedstawiono w tabeli poniżej. Grupa pacjentów Nr Liczba wyników pozytywnych (%) APS * w następstwie SLE 37 36 (97,2) Pierwotny APS (zespół antyfosfolipidowy) 15 14 (93,3) SLE 34 2 (5,8) Reumatoidalne zapalenie stawów 17 0 (0) Polihipergammaglobulinemia 7 0 (0) Zakaźne ** 81 0 (0) Normalne 256 1 (0,4) * APS = Zespół antyfosfolipidowy ** Większość z tych próbek dało pozytywny wynik w testach serologicznych na syfilis Opierając się na powyższych wynikach testów stwierdzono, że test β 2 GPI ma wrażliwość kliniczną na poziomie 96,2% i swoistość kliniczną na poziomie 99,6%. Swoistość i wrażliwość względna Zgodność z testem na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie 40 surowic wybranych losowo spośród próbek wysłanych do dużego laboratorium referencyjnego w celu przebadania na obecność przeciwciał przeciw kardiolipinie przebadano na obecność przeciwciał IgG zarówno przeciwko kardiolipinie jak i przeciwko β 2 GPI. Poniżej zostały przedstawione wyniki. β 2 GPI + - + 5 19 Wrażliwość względna 20,8% Kardiolipina Swoistość względna 100,0% - 0 16 Skuteczność względna 52,5% Przy zastosowaniu obu metod w obu przypadkach 5 próbek dało wynik pozytywny a 16 dało wynik negatywny. Żadna z próbek nie dała wyniku pozytywnego na obecność przeciwciał przeciwko β 2 GPI i negatywnego na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie. Dziewiętnaście próbek dało wynik pozytywny na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie i negatywny na obecność przeciwciał przeciwko β 2 GPI. W tym małym badaniu porównawczym z wykorzystaniem losowo wybranych próbek od osób zdrowych, względna wrażliwość wyników dla IgG przeciwko β 2 GPI wydaje się być niewielka w porównaniu z tymi z testu na obecność IgG przeciwko kardiolipinie. Nie jest to niczym zaskakującym. W tradycyjnych testach na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie wykrywane są przeciwciała przeciwko β 2 GPI jak również przeciwciała reagujące z samym fosfolipidem. Jak wykazują powyższe dane uzyskane we wspomnianych warsztatach w Nowym Orleanie oraz te z podsumowania wyników badań klinicznych, testy β 2 GPI charakteryzują się porównywalną wrażliwością i wyższą swoistością w porównaniu z wynikami na obecność przeciwciał przeciwko kardiolipinie u pacjentów z udokumentowanym APS. 6

Precyzja i powtarzalność Precyzję i powtarzalność obliczono przeprowadzając sześciokrotne badanie próbki negatywnej, silnie i umiarkowanie pozytywnej w cyklu porannym i popołudniowym przez trzy kolejne dni. Średnia wyników dla próbki negatywnej wynosiła 18,9, dla próbki umiarkowanie pozytywnej - 44,3, a dla silnie pozytywnej - 82,4. Wyniki w obrębie oraz pomiędzy seriami badań podano w tabeli poniżej. Negatywny Średnio pozytywna Silnie pozytywna SD CV SD CV SD CV Łącznie 0,86 4,5% 2,48 5,6% 2,79 3,4% W ramach serii 0,75 4,0% 2,34 5,3% 2,66 3,2% Pomiędzy seriami 0,82 4,3% 2,41 5,4% 2,87 3,5% Piśmiennictwo 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: 1211-1214, 1983. 2. Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: 193-199, 1984. 3. Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: 1081-1087, 1986. 4. Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: 152-156, 1985. 5. McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: 193-280, 1991. 6. Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: 591-609, 1985. 7. Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: 486-489, 1986. 8. McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4120-4124, 1990. 9. Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: 1544-1547, 1990. 10. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: 177-178, 1990. 11. Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: 671-672, 1991. 12. Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: 3885-3891, 1992. 13. Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: 1217-1221, 1991. 14. Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: 1086-1091, 1985. 16. Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: 109-114, 1987. 17. Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: 142-149, 1986. 18. Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: 181-186, 1992. 19. Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: 305-313, 1995. 20. Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: 2233-2237, 1995. 21. Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: 1444-1454, 1996. 22. Tsutsumi A, et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: 1466-1474, 1996. 23. Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899, 1995. 24. Cerrato, et al. Antibodies to prothrombin and β 2 glycoprotein I in antiphospholipid syndrome. Lupus, 5: 516, 1996. 25. Sebastiani, G.D., et al. Anti β 2 GPI and acl in SLE-association with clinical manifestation of APS. Lupus, 5: 519, 1996. 26. Erickson, E., S. Najmey, L. Keil, H. EL-Kadi, and V. DeBari. Reference calibrators for IgG antibodies to β 2 - glycoprotein I: preparation, properties and availability to investigators. Clinical Chemistry, 42: 1116-1117, 1996. 27. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

QUANTA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2011. Wszelkie prawa zastrzeżone Wyprodukowano przez: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Stany Zjednoczone Ameryki Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745 Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Niemcy Tel.: +49-6894-581020 Faks.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 628665POL Marzec 2011 Wersja 0 8