Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych
Studia biologiczne rozpocząłem w 1989 roku na Wydziale Matematyczno- Przyrodniczym Filii Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku, gdzie 6 stycznia 1994 roku uzyskałem dyplom magistra biologii. Pracę magisterską na temat Zmiany w zawartości białek i monosacharydów oraz ich sekrecji w Chlorella vulgaris pod wpływem estradiolu i testosteronu wykonałem pod kierunkiem prof. dr hab. Romualda Czerpaka. Cześć wyników pracy magisterskiej opublikowałem w dwuczęściowym artykule w Polskim Archiwum Hydrobiologii (1996 r.) 1. W trakcie studiów dodatkowo wykonywałem badania dotyczące oddziaływania metali ciężkich niklu i kadmu na kultury glonu Chlorella vulgaris 2 oraz wpływu auksyn i cytokinin na metabolity glonu 3 oraz wydzielanie pozakomórkowe białek i cukrów przez ww. glon 4. Wyniki badań dotyczące wpływu metali ciężkich zaprezentowałem w 1993 roku na XXIX Zjeździe Polskiego Towarzystwa Biochemicznego we Wrocławiu. 1 lutego 1994 roku rozpocząłem pracę w Zakładzie Biochemii Instytutu Biologii Filii Uniwersytetu Warszawskiego w Białymstoku (przekształconego w 1997 r. w Uniwersytet w Białymstoku) najpierw na stanowisku asystenta, a następnie od 1999 roku jako adiunkt. Pod kierunkiem naukowym prof. dr hab. Romualda Czerpaka w latach 1994-1998 wykonałem pracę doktorską pt. Zależność między strukturą chemiczną i aktywnością 1 Bajguz A., Czerpak R. (1996) Metabolic activity of estradiol in Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). Part I. Content of photosynthetic pigments. Pol. Arch. Hydrobiol., 43 (4): 421-426. Bajguz A., Czerpak R. (1996) Metabolic activity of estradiol in Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). Part II. Content of the cellular sugar and protein accumulation. Pol. Arch. Hydrobiol., 43 (4): 427-430. 2 Czerpak R., Bajguz A., Chodkowski K., Popow H. (1994) Influence of nickel and cobalt on the growth and biochemical changes of Chlorella pyrenoidosa (Chlorophyceae). Pol. Arch. Hydrobiol., 41 (2): 161-169. 3 Czerpak R., Bajguz A., Białecka B., Wierzchołowska L.E., Wolańska M.M. (1994) Effect of auxin precursors and chemical analogues on the growth and chemical composition in Chlorella pyrenoidosa Chick. Acta Soc. Bot. Pol., 63 (3-4): 279-286. Czerpak R., Bajguz A. (1997) Stimulatory effect of auxins and cytokinins on carotenes, with differential effects on xanthophylls, in the green alga Chlorella pyrenoidosa Chick. Acta Soc. Bot. Pol., 66 (1): 41-46. 4 Czerpak R., Bajguz A. (1993) Effect of auxins and cytokinins on protein and saccharides extracellular excretion in Chlorella pyrenoidosa. Pol. Arch. Hydrobiol., 40 (3-4): 249-254. Strona 1 z 29
biologiczną brassinosteroidów w glonie Chlorella vulgaris. Obrona pracy doktorskiej odbyła się w 29 maja 1998 roku na Uniwersytecie Mikołaja Kopernika w Toruniu, na podstawie której otrzymałem stopień naukowy doktora biologii. Rada Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi UMK przyznała mi wyróżnienie za pracę doktorską oraz jej obronę. Ponadto Rektor Uniwersytetu w Białymstoku przyznał mi w 1999 r. nagrodę naukową. Tematyka pracy doktorskiej dotyczyła ustalenia zależności między budową chemiczną dwóch głównych klas brassinosteroidów typu 7-oksalaton (brassinolid, BL; 24-epiBL; 28-homoBL) i 6-keton (kastasteron, CS; 24-epiCS; 28-homoCS), a ich aktywnością biologiczną w jednokomórkowym glonie Chlorella vulgaris. Związki różniły się budową pierścienia B, długością łańcucha bocznego oraz odmienną strukturą przestrzenną grup metylowych w łańcuchu bocznym brassinosteroidów. Przeanalizowałem zmiany w szybkości przebiegu cyklu rozwojowego glonu i liczebności komórek pod wpływem brassinosteroidów, a także zawartość w nich kwasów nukleinowych, białek, cukrów, chlorofili, karotenoidów, kwasu glikolowego, fosforu organicznego i nieorganicznego. Oprócz tego zbadałem zmiany w intensywności procesu fotosyntezy i fotooddychania glonów oraz wydzielanie pozakomórkowe białek i monosacharydów i kwasu glikolowego. W oparciu o uzyskane wyniki dokonałem analizy QSAR brassinosteroidów. Wyniki z tej części badań zostały opublikowane w dwóch artykułach oryginalnych w Journal of Plant Growth Regulation (1996 1, 1998 r. 2 ). Największą aktywność biologiczną wykazały brassinosteroidy posiadające 7-oksalakton w pierścieniu B, 1 Bajguz A., Czerpak R. (1996) Effect of brassinosteroids on growth and proton extrusion in the alga Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). J. Plant Growth Regul., 15, 153-156. 2 Bajguz A., Czerpak R. (1998) Physiological and biochemical role of brassinosteroids and their structure-activity relationship of brassinosteroids in the green alga Chlorella vulgaris. J. Plant Growth Regul., 17: 131-139. Strona 2 z 29
połączenie trans pierścieni A/B, grupy hydroksylowe w położeniu 2α,3α w pierścieniu A, konfigurację RR grup hydroksylowych w pozycji C-22, C-23 w łańcuchu bocznym oraz podstawniki metylowe w pozycji C-24S. Ponadto zastosowane steroidy w zakresie stężeń 10-15 -10-6 M osiągnęły optymalne działanie na wzrost i ww. parametry biochemiczne i fizjologiczne w stężeniu 10-8 M. 72-godzinna hodowla kultur glonu traktowana brassinosteroidami cechowała się dwiema fazami wzrostu Chlorella vulgaris: logarytmiczną pomiędzy 12 a 48 godziną i stagnacji pomiędzy 48 a 72 godziną. Kultury kontrolne wykazały jedynie fazę wzrostu logarytmicznego. Stwierdziłem, że pod wpływem brassinosteroidów zwiększyła się 2-3-krotnie zawartość białek, cukrów, chlorofili, karotenoidów, kwasu glikolowego, fosforu organicznego i nieorganicznego. Do czasu uzyskania stopnia naukowego doktora biologii mój dorobek naukowy składał się z 10 publikacji (8 oryginalnych i 2 przeglądowych). Dotyczyły one egzogennego działania steroidów, tj. brassinosteroidów i estradiolu na aktywność biologiczną glonu Chlorella vulgaris. Obie prace przeglądowe opublikowane w czasopiśmie Kosmos poświęcone były występowaniu, biosyntezie, metabolizmowi oraz aktywności fizjologicznej i biochemicznej brassinosteroidów w roślinach. W celu podniesienia kwalifikacji naukowych odbyłem dwa, trzymiesięczne staże zagraniczne; jeden w zespole profesora Güntera Adama w Instytucie Biochemii Roślin w Halle w Niemczech (1997 r.) oraz drugi w zespole profesora Laurence a Dinana na Uniwersytecie w Exeter w Wielkiej Brytanii (2005 r.). Zapoznałem się z metodami izolacji i charakterystyki brassinosteroidów i ekdysteroidów technikami HPLC i GC-MS Strona 3 z 29
z zastosowaniem izotopów. Ponadto nauczyłem się oceny aktywności biologicznej ww. steroidów za pomocą testów biologicznych i immunologicznych. Od kilku lat aktywnie współpracuję z prof. Tadao Asami z Institute of Physical and Chemical Research RIKEN w Saitama w Japonii i Uniwersytetu w Tokio, prof. Laurencem Dinanem z Uniwersytetu w Exeter oraz prof. Shamsulem Hayat z Aligarh Muslim University z Indii. Efektem tej współpracy są artykuły opublikowane w Planta, Phytochemistry, Physiologia Plantarum oraz Indian Journal of Plant Physiology. Po uzyskaniu stopnia naukowego doktora w mojej pracy badawczej dominującymi stały się zagadnienia dotyczące wpływu różnorodnych hormonów roślinnych. Przez wiele lat wyróżniano pięć odrębnych grup fitohormonów określanych jako hormony klasyczne, a mianowicie: auksyny, cytokininy, gibereliny, kwas abscysynowy i etylen. Obecnie do grupy hormonów roślinnych włączono również brassinosteroidy i jasmoniany. W ogólnym rozumieniu definicji hormonu roślinnego związki te występują powszechnie w roślinach i wykazują aktywność biologiczną w bardzo niskich stężeniach rzędu 10-8 -10-6 M, wykluczających ich funkcje odżywcze czy budulcowe. Charakterystyczną cechą fitohormonów jest ich działanie plejotropowe, które oznacza indukowanie odrębnych odpowiedzi fizjologicznych w różnych komórkach docelowych przez ten sam związek. Wiadomo również, że pojedynczy proces fizjologiczny może być regulowany przez różne hormony, co w dużym stopniu utrudnia analizowanie odpowiedzi biologicznej tego hormonu. Aktywność fitohormonów determinują także czynniki wewnętrzne, które obejmują procesy ich biosyntezy, Strona 4 z 29
koniugacji, degradacji, transportu oraz zewnętrzne czynniki środowiskowe, do których należy zaliczyć m.in. światło, temperaturę, działanie patogenów czy metali ciężkich. Poznanie odpowiedzi biologicznej roślin wywołanej działaniem egzogennych fitohormonów oraz różnorodnych stresów stało się polem mojego zainteresowania. Wyniki badań opublikowałem w 25 oryginalnych pracach naukowych. W tym okresie również opublikowałem 12 prac przeglądowych, dwie monografie, pięć rozdziałów w podręcznikach oraz jeden podręcznik dydaktyczny. Oprócz tego uczestniczyłem w konferencjach naukowych krajowych i zagranicznych, na których 27-krotnie przedstawiłem wyniki badań w formie posterów. W IV kwartale 1997 r. na mój wniosek zostało otwarte postępowanie habilitacyjne na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, na podstawie monografii Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Jednakże z powodów osobistych zmuszony byłem w kwietniu 1998 r. złożyć prośbę o jego zamknięcie, która została pozytywnie rozpatrzona. Strona 5 z 29
Zaprezentowana część wyników moich badań, opublikowanych w niżej wymienionych artykułach 1 (załącznik 3), stanowi cykl publikacji Występowanie brassinosteroidów oraz ich egzogenny wpływ na kultury Chlorella vulgaris narażone na działanie metali ciężkich przedstawiony do oceny osiągnięć naukowych zgodnie z art. 16, ust. 2 Ustawy z dnia 18 marca 2011 r. o zmianie ustawy Prawo o szkolnictwie wyższym, ustawy o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki oraz o zmianie niektórych innych ustaw (Dz. U. z 2011 r. Nr 84, poz. 455): 1. Bajguz A. (2000) Blockade of heavy metals accumulation in Chlorella vulgaris cells by 24-epibrassinolide. Plant Physiol. Biochem., 38: 797-801. 2. Bajguz A. (2002) Brassinosteroids and lead as stimulators of phytochelatins synthesis in Chlorella vulgaris. J. Plant Physiol., 159: 321-324. 3. Bajguz A., Tretyn A. (2003) The chemical characteristic and distribution of brassinosteroids in plants. Phytochemistry, 62: 1027-1046. 4. Bajguz A., Asami T. (2004) Effects of brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis, on light- and dark-grown Chlorella vulgaris. Planta, 218: 869-877. 5. Bajguz A., Hayat S. (2009) Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses. Plant Physiol. Biochem., 47: 1-8. 6. Bajguz A. (2009) Isolation and characterization of brassinosteroids from algal cultures of Chlorella vulgaris Beijerinck (Trebouxiophycaea). J. Plant Physiol., 166: 1946-1949. 7. Bajguz A. (2010) An enhancing effect of exogenous brassinolide on the growth and antioxidant activity in Chlorella vulgaris cultures under heavy metals stress. Environ. Exp. Bot., 68: 175-179. 8. Bajguz A. (2011) Suppression of Chlorella vulgaris growth by cadmium, lead and copper stress and its restoration by endogenous brassinolide. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 60: 406-416, 2011. 1 cytowania w tekście oraz przypisach pogrubioną czcionką oznaczają publikacje przedstawione do oceny osiągnięć naukowych (art. 16, ust. 2 Ustawy z dnia 18 marca 2011 r.; Dz. U. z 2011 r. Nr 84, poz. 455) Strona 6 z 29
Obiektem moich doświadczeń pozostał jednokomórkowy glon Chlorella vulgaris, w którym odbiór bodźca hormonalnego czy środowiskowego oraz odpowiedź biochemiczna zachodzi w obrębie pojedynczej komórki i nie ulega rozproszeniu. Zatem mogłem stwierdzić bezpośrednie działanie egzogennych substancji wzrostowych czy stresów na pojedynczą komórkę glonu. W przeciągu ostatnich dziesięciu lat dominującym nurtem moich eksperymentów naukowych była hormonalna regulacja wzrostu i rozwoju glonu Chlorella vulgaris głównie przez brassinosteroidy, które stanowią grupę hormonów roślinnych 1. Egzogenne brassinosteroidy wywołują efekty fizjologiczne zależne od użytego stężenia: niskie zazwyczaj indukują je, a wysokie hamują. W przeciwieństwie do innych roślinnych substancji wzrostowych stymulację procesów biologicznych przez brassinosteroidy uzyskuje się w stężeniach o kilka rzędów wielkości niższych, w granicach pikomoli, a nawet femtomoli. Równie niskie stężenie brassinosteroidów wykrywa się wewnątrz tkanek roślinnych. Ponadto zająłem się wyjaśnieniem oddziaływania brassinosteroidów na kultury Chlorella vulgaris, które narażone były na różnorodne stresy środowiskowe, tzn. świetlny, termiczny czy działanie metali ciężkich. W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na możliwość wykorzystania hormonów roślinnych w usuwaniu zanieczyszczeń środowiska. Znane są doniesienia dotyczące bezpośredniego lub pośredniego wpływu niektórych fitohormonów na funkcjonowanie komórek w warunkach stresowych, w których działają osłaniająco lub jako modulatory odpowiedzi na stres środowiskowy. Poznanie mechanizmów 1 Bajguz A. (1999) Działanie brassinosteroidów na wzrost i rozwój roślin. Kosmos, 48 (1): 75-85. Bajguz A., Tretyn A. (2003) Brassinosteroidy hormony roślinne. Wyd. UMK, Toruń, ISBN 83-231-1638-5, ss. 246. Strona 7 z 29
adaptacyjnych do stresów w kulturach glonu Chlorella vulgaris, w tym udziału hormonów roślinnych, ich występowania oraz regulacji biosyntezy stanowiło główny nurt moich zainteresowań naukowych. Ponadto stwierdzenie obecności fitosteroli w glonach z rodzaju Chlorella, m.in. kampesterolu, które są prekursorami biosyntezy brassinosteroidów oraz jedynie dwóch brassinosteroidów, tzn. 24-epikastasteronu i 28- homokastasteronu w wielokomórkowym glonie zielenicy płóczni sieciowatej (Hydrodictyon reticulatum) (Bajguz i Tretyn 2003 1 ) stało się dodatkowym bodźcem w podjęciu badań nad występowaniem brassinosteroidów w Chlorella vulgaris. Do przeprowadzenia badań dotyczących odpowiedzi brassinosteroidów na działanie stresów, np. jakim jest działanie metali ciężkich w Chlorella vulgaris, skłonił mnie również brak jakichkolwiek tego typu badań na roślinach. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń stwierdziłem, że w komórkach glonu Chlorella vulgaris występuje siedem brassinosteroidów (Bajguz 2009 2 ). Należą do nich: brassinolid (BL), teasteron (TE), 6-deoksoteasteron (6-deoksoTE), tyfasterol (TY), 6-deoksotyfasterol (6-deoksoTY), kastasteron (CS), 6-deoksokastasteron (6-deoksoCS). Spośród wyizolowanych brassinosteroidów wszystkie z nich należą do związków typu C28, które należą to szlaku biosyntezy, tzw. wczesnego i późnego C6 utlenianie. Według zróżnicowania w budowie pierścienia B szkieletu steroidowego zaliczamy je do trzech różnych typów, a mianowicie: 7-oksalaktonu (brassinolid), 6-okso typu (kastasteron, 1 Bajguz A., Tretyn A. (2003) The chemical characteristic and distribution of brassinosteroids in plants. Phytochemistry, 62: 1027-1046. 2 Bajguz A. (2009) Isolation and characterization of brassinosteroids from algal cultures of Chlorella vulgaris Beijerinck (Trebouxiophycaea). J. Plant Physiol., 166: 1946-1949. cytowania w tekście oraz przypisach pogrubioną czcionką oznaczają publikacje przedstawione do oceny osiągnięć naukowych (art. 16, ust. 2 Ustawy z dnia 18 marca 2011 r.; Dz. U. z 2011 r. Nr 84, poz. 455) Strona 8 z 29
tyfasterol, teasteron) i 6-deokso typu (6-deoksokastasteron, 6-deoksotyfasterol, 6-deoksoteasteron). Pod względem ilościowym w komórkach Chlorella vulgaris dominuje kastasteron (0,47 ng g -1 świeżej masy), zaś najmniejszą zawartość wykazuje brassinolid (0,07 ng g -1 świeżej masy). Na uwagę zasługują również dwa związki wyizolowane z Chlorella vulgaris 24-epibrassinolid i 28-homobrassinolid, które są metabolitami brassinolidu 1. Na tej podstawie można sądzić, że w Chlorella vulgaris, obok typowych związków biosyntezy brassinosteroidów, występują również produkty przemian brassinolidu, który uległ reakcji epimeryzacji i metylacji w pozycji C-24. Do tego czasu w roślinach niższych stwierdzono obecność brassinosteroidów jedynie w trzech gatunkach. Z komórek zielenicy płóczni sieciowatej (Hydrodictyon reticulatum) wyizolowano jedynie 24-epikastasteron i 28-homokastasteron. Z kolei z kultur komórkowych porostnicy wielokształtnej (Marchantia polimorpha) wyizolowano trzy brassinosteroidy, tzn. teasteron, 3-dehydroteasteron i tyfasterol. Natomiast w skrzypie polnym (Equisetum arvense) stwierdzono obecność czterech związków, a mianowicie: dolichosteronu, 28-norkastasteronu, kastasteronu i 28-norbrassinolidu. Biorąc pod uwagę liczbę siedmiu wyizolowanych brassinosteroidów z komórek glonu Chlorella vulgaris, roślina ta jest jedną z bardziej zasobnych w steroidowe hormony roślinne. Najwięcej brassinosteroidów posiadają niedojrzałe nasiona fasoli zwykłej (Phaseolus vulgaris) (25 związków), barwinek różyczkowy (Catharanthus roseus) (19 związków) oraz Arabidopsis thaliana (18 związków) (Bajguz i Tretyn 2003 2 ). 1 Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. 2 Bajguz A., Tretyn A. (2003) The chemical characteristic and distribution of brassinosteroids in plants. Phytochemistry, 62: 1027-1046. Strona 9 z 29
Dotychczas było wiadomo, że w glonie Chlorella fusca biosynteza steroli, związków prekursorowych w biosyntezie brassinosteroidów, zachodzi wyłącznie poprzez szlak niemewalonowy. Poprzez bliskie pokrewieństwo gatunkowe mogłem jedynie domniemywać, że w Chlorella vulgaris występuje podobny szlak biosyntezy steroli. Większość roślin wyższych, np. w Arabidopsis thaliana biosynteza steroli zachodzi przez szlak mewalonowy. Dlatego też podjąłem badania w celu wyjaśnienia tego problemu. Zastosowanie specyficznych inhibitorów: 1) mewinolinu blokującego reakcję przekształcenia hydroksymetyloglutarylo~coa w kwas mewalonowy oraz 2) klomazonu inhibitora reakcji przekształcenia pirogronianu i aldehydu 3-fosfoglicerynowego w 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforan pozwoliło mi potwierdzić występowanie szlaku niemewalonowego w Chlorella vulgaris. Klomazon, w przeciwieństwie do mewinolinu, wykazał się hamującym wpływem na wzrost kultur Chlorella vulgaris, które zostało zniesione po dodaniu brassinolidu (Bajguz i Asami 2004 1 ). Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że w glonie Chlorella vulgaris biosynteza brassinosteroidów przebiega równolegle poprzez tzw. szlak późnego i wczesnego C-6 utleniania (Bajguz i Asami 2004 1, Bajguz 2009 2 ). Identyczne reakcje biosyntezy brassinosteroidów zostały stwierdzone w roślinach wyższych. Przy czym typ późnego C-6 utleniania jest bardziej rozpowszechniony u roślin, np. występuje w Arabidopsis thaliana i grochu zwyczajnym, podczas gdy u pomidora jest jedynym 1 Bajguz A., Asami T. (2004) Effects of brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis, on light- and dark-grown Chlorella vulgaris. Planta, 218: 869-877. 2 Bajguz A. (2009) Isolation and characterization of brassinosteroids from algal cultures of Chlorella vulgaris Beijerinck (Trebouxiophycaea). J. Plant Physiol., 166: 1946-1949. Strona 10 z 29
szlakiem biosyntezy brassinosteroidów. Biosynteza brassinosteroidów typu C28 w glonie Chlorella vulgaris jest jak dotąd jedynym doniesieniem występującym w roślinach niższych. Wspólnym związkiem szlaków późnego i wczesnego C-6 utleniania jest kastasteron, związek będący bezpośrednim prekursorem brassinolidu. W wielu roślinach przemianie 6-deoksokastasteronu w kastasteron towarzyszy dodatkowo proces hydroksylacji, w wyniku którego tworzy się związek pośredni 6α-hydroksykastasteron. Jednak z komórek Chlorella vulgaris nie udało się wyizolować tego związku. Prawdopodobnie przyczyną jest zbyt niskie jego stężenie, występujące poniżej poziomu detekcji. Stwierdziłem, że katasteron ulega hydroksylacji, zachodzącej przy C-23, tworząc teasteron, który w wyniku utleniania katalizowanego przez dehydrogenazę teasteronu jest przekształcany w 3-dehydroteasteron. Redukcja w pozycji C-3 z udziałem reduktazy 3-dehydroteasteronu powoduje powstanie tyfasterolu, który w wyniku hydroksylacji w pozycji C-2 ulega przemianie do kastasteronu. Z kolei w szlaku późnego C-6 utleniania po przekształceniu się 6-deoksokatasteron w 6-deoksoteasteron zachodzi proces 3-epimeryzacji do 3-dehydro- 6-deoksoteasteronu, który przechodzi w 6-deoksotyfasterol. Następnie 6-deoksotyfasterol jest przekształcany w 6-deoksokastasteron, który poprzez utlenianie w C-6 daje kastasteron. Przekształcenie kastasteronu w brassinolid odbywa się poprzez reakcję typu Baeyer-Villigera wstawienie atomu tlenu w pierścień B pomiędzy atomy węgla C-6 i C-7. Konwersja ta była stwierdzona wyłącznie w kulturach komórkowych i sadzonkach barwinka różyczkowego, sadzonkach tytoniu, ryżu siewnego i Arabidopsis Strona 11 z 29
thaliana oraz kulturach komórkowych glonu Chlorella vulgaris (Bajguz i Asami 2004 1, Bajguz 2009 2 ). Dodatkowym dowodem potwierdzającym występowanie brassinosteroidów w Chlorella vulgaris było specyficzne działanie inhibitora ich biosyntezy brassinazolu, który jest syntetycznym analogiem chemicznym paklobutrazolu, 4-(4-chlorofenylo)-2- fenylo-3-(1,2,4-triazoilo)butan-2-olu (Bajguz i Asami 2004 1 ). Związek ten zablokował proces utleniania brassinosteroidów w pozycji C-22 w szlaku wczesnego (6-oksokampestanolu w katasteron oraz katasteronu w teasteron) oraz późnego (kampestanolu w 6-deoksokatasteron oraz 6-deoksokatasteronu w 6-deoksoteasteron) C-6 utleniania. Po jego dodaniu do kultur glonu stwierdziłem około 70% zmniejszenie zawartości brassinosteroidów w komórkach Chlorella vulgaris. Ponadto kultury glonu traktowane brassinazolem w zakresie stężeń 10-7 10-5 M charakteryzowały się zahamowaniem wzrostu oraz obniżeniem poziomu chlorofili, cukrów i białek w stosunku do kontroli. Najsilniej hamująco oddziałuje brassinazol w stężeniu 10-5 M, najsłabiej w 10-7 M. Z kolei stężenia poniżej 10-7 M brassinazolu nie wywierają żadnego efektu inhibicyjnego, ponieważ liczba komórek kultur narażonych na działanie brassinazolu była zbliżona do kultur kontrolnych. Związek ten wykazuje najbardziej hamujący wpływ na wzrost Chlorella vulgaris w stężeniu 10-5 M. Zastosowanie mieszaniny brassinazolu i brassinolidu spowodowało zniesienie hamującego działania inhibitora. Niezależnie od użytego stężenia brassinazolu zaobserwowano działanie 1 Bajguz A., Asami T. (2004) Effects of brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis, on light- and dark-grown Chlorella vulgaris. Planta, 218: 869-877. 2 Bajguz A. (2009) Isolation and characterization of brassinosteroids from algal cultures of Chlorella vulgaris Beijerinck (Trebouxiophycaea). J. Plant Physiol., 166: 1946-1949. Strona 12 z 29
stymulujące na wzrost kultury Chlorella vulgaris traktowanej brassinosteroidem w porównaniu do kultur kontrolnych. Podobny efekt działania brassinazolu stwierdziłem badając zawartość chlorofili, cukrów i białek w komórkach glonu. W doświadczeniu, w którym kultury Chlorella vulgaris rosły w ciemności wykazałem brak hamującego działania brassinazolu na wzrost glonów. Sugeruje to, że endogenne brassinosteroidy są niezbędne do prawidłowego wzrostu i rozwoju glonu rosnącego na świetle. Ponadto glony rosnące w ciemności wykazały fazę ograniczonego wzrostu. Zjawisko to zaobserwowałem wyłącznie w kulturach pozbawionych endogennego brassinolidu. Z kolei glony potraktowane brassinolidem charakteryzowały się zwiększeniem liczby komórek Chlorella vulgaris. Zatem w warunkach ciemności traktowanie glonów brassinolidem spowodowało przyspieszenie ich wzrostu. Można przypuszczać, że fitohormony te mogą w ciemności zastąpić efekt światła białego, które jest niezbędne do indukcji procesów zachodzących w jego obecności (Bajguz i Asami 2004 1 ). Głównym objawem toksycznego oddziaływania metali ciężkich na rośliny jest ograniczenie wzrostu i rozwoju. Doświadczenia własne wykazały, że zastosowane metale ciężkie (kadm, ołów i miedź) były inhibitorami wzrostu i rozwoju glonu Chlorella vulgaris (Bajguz 2000 2 ). Aktywność inhibicyjna metali malała stopniowo wraz ze spadkiem ich stężenia w pożywce, osiągając najniższą wartość w stężeniu 10-4 M. Stężenia metali ciężkich, równe lub większe od 10-3 M, spowodowały defragmentację 1 Bajguz A., Asami T. (2004) Effects of brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis, on light- and dark-grown Chlorella vulgaris. Planta, 218: 869-877. 2 Bajguz A. (2000) Blockade of heavy metals accumulation in Chlorella vulgaris cells by 24-epibrassinolide. Plant Physiol. Biochem., 38: 797-801. Strona 13 z 29
oraz rozpad komórek Chlorella vulgaris. Z kolei stężenia poniżej 10-6 M nie wywierały hamującego wpływu na kultury glonu. Kultury Chlorella vulgaris, poddane działaniu ww. metali ciężkich, charakteryzowały się również zmniejszeniem zawartości białek, chlorofili i cukrów (Bajguz 2011 1 ). Inhibitorowa aktywność biologiczna metali ciężkich przedstawiała się następująco: kadm > ołów > miedź. Z kolei traktowanie kultur glonu brassinolidem, poddanych równoczesnemu działaniu ww. metali, spowodowało wzrost liczby komórek oraz analizowanych składników biochemicznych. Doszło do całkowitego lub częściowego zniesienia hamującego wpływu metali ciężkich. Najniższą stymulację wzrostu i zawartości analizowanych składników chemicznych glonu traktowanych brassinolidem stwierdziłem w kulturach poddanych działaniu ww. metali w stężeniu 10-4 M, zaś największą w 10-6 M (Bajguz 2011 1 ). Metale ciężkie (kadm, miedź, ołów) hamują biosyntezę barwników fotosyntetycznych, obniżając zawartość chlorofilu a i b oraz karotenoidów w komórkach zdolnych do przeprowadzenia procesu fotosyntezy. Hamowanie syntezy barwników, głównie chlorofili, jest przejawem oddziaływania różnych metali ciężkich na proces fotosyntezy. Wytworzone w procesie fotosyntezy cukry proste są dla roślin materiałem budulcowym oraz źródłem energii niezbędnej do stymulowania wszystkich procesów i reakcji biochemicznych wymagających jej nakładu. Spadek zawartości barwników fotosyntetycznych spowodował również zahamowanie syntezy cukrów w komórkach Chlorella vulgaris. Badania własne dowiodły, że metale ciężkie w stężeniu 10-4 M spowodowały najsilniejsze zahamowanie zawartości cukrów w komórkach glonu. Podobnie jak zawartość cukrów, pod wpływem metali ciężkich 1 Bajguz A. (2011) Suppression of Chlorella vulgaris growth by cadmium, lead and copper stress and its restoration by endogenous brassinolide. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 60: 406-416. Strona 14 z 29
obniżała się również zawartość ogólna białka. Hamujący wpływ tych związków był niwelowany poprzez dodanie do kultur 10-8 M brassinolidu. Wiadomo, że niektóre białka są w stanie związać jony metali ciężkich. W ten sposób następuje ochrona komórek przed szkodliwym, toksycznym działaniem metali ciężkich. Rolę w detoksykacji metali ciężkich odgrywają polipeptydy o niewielkim ciężarze cząsteczkowym, bogate w reszty cysteinowe, zwane fitochelatynami. Mechanizm oddziaływania metali ciężkich na procesy fizjologiczne, związane z syntezą białek, jest jeszcze nie w pełni poznany. Proces transkrypcji i syntezy białek stanowi podstawę wzrostu i rozwoju roślin. Jednak wydaje się oczywistym, że na poziomie biosyntezy białek zachodzą główne, najważniejsze relacje między rośliną a działaniem metali ciężkich. Oddziaływanie brassinosteroidów poprzez zwiększenie zawartości podstawowych składników komórek glonu Chlorella vulgaris, hodowanych w obecności metali ciężkich, stanowi dowód na antystresowe właściwości tych fitohormonów. Wiadomo, że zmiana odczynu środowiska występowania glonów, np. alkaliczny odczyn, obniżał stężenie labilnych form jonów metali, ograniczając biodostępność metali dla glonów, w wyniku czego zmniejszała się aktywność syntezy fitochelatyn (Bajguz 2000 1 ). Wzrost kwasowości środowiska spowodował zwiększenie biodostępności metali, skutkiem czego była zwiększona synteza fitochelatyn w glonach. Stwierdziłem, że wraz ze zmianą odczynu środowiska wzrastała dostępność metali ciężkich dla glonów oraz następowała zwiększona synteza fitochelatyn. Zawartość metali ciężkich w glonie Chlorella vulgaris zmieniała się wprost proporcjonalnie do zastosowanego stężenia 1 Bajguz A. (2000) Blockade of heavy metals accumulation in Chlorella vulgaris cells by 24-epibrassinolide. Plant Physiol. Biochem., 38: 797-801. Strona 15 z 29
metalu ciężkiego. Największą endogenną zawartość w glonie spośród zastosowanych metali ciężkich odnotowałem w przypadku miedzi, zaś najmniejszą kadmu. Natomiast kultury glonu, potraktowane mieszaniną metalu ciężkiego i brassinolidu, charakteryzowały się znacznym obniżeniem zawartości tych pierwiastków w komórkach. Obecność metali ciężkich w zakresie stężeń 10-6 -10-4 M w pożywce wzrostu glonu Chlorella vulgaris spowodowała obniżenie ph ze słabo kwaśnego (6,6) do silnie kwaśnego (3,1-5,6). Zmiana ph była wprost proporcjonalna do zwiększającego się stężenia metali ciężkich. Największe obniżenie odczynu pożywki zanotowano w kulturach traktowanych metalami ciężkimi w stężeniu 10-4 M. Najsilniej działają jony miedzi, nieco słabiej ołowiu, zaś najsłabiej kadmu. Podanie do kultury glonu 10-8 M brassinosteroidu spowodowało zmianę ph w kierunku słabo kwaśnego, przeciętny wzrost wyniósł jedną jednostkę. Z kolei kultury glonu, potraktowane samym brassinolidem, wykazywały nieznaczny spadek ph do 6,35 w stosunku do 6,6 kultury kontrolnej. Zbadałem również wpływ sześciu brassinosteroidów (brassinolidu, 24-epibrassinolidu, 28-homobrassinolidu, kastasteronu, 24-epikastasteronu oraz 28-homokastasteronu) na ogólną zawartość fitochelatyn w kulturach glonu Chlorella vulgaris traktowanego ołowiem (10-6 i 10-4 M) (Bajguz 2002 1, 2010 2 ). Zawartość fitochelatyn oznaczyłem w 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 16, 24 i 36 godzinie trwania hodowli. Najbardziej wzmożony wzrost zawartości fitochelatyn następował do 24 godziny 1 Bajguz A. (2002) Brassinosteroids and lead as stimulators of phytochelatins synthesis in Chlorella vulgaris. J. Plant Physiol., 159: 321-324. 2 Bajguz A. (2010) An enhancing effect of exogenous brassinolide on the growth and antioxidant activity in Chlorella vulgaris cultures under heavy metals stress. Environ. Exp. Bot., 68: 175-179. Strona 16 z 29
hodowli, natomiast w 36 godzinie odnotowano spadek zawartości fitochelatyn w kulturach traktowanych 10-8 M brassinosteroidami. W kulturach narażonych na działanie ołowiu wraz z przedłużającym się jego działaniem wzrastała zawartość fitochelatyn. Z przeglądu literatury wynika, że po raz pierwszy stwierdzono regulację biosyntezy fitochelatyn przez brassinosteroidy. Ustaliłem również szereg aktywności biologicznej brassinosteroidów na zmiany zawartości fitochelatyn w odpowiedzi na działanie metalu ciężkiego w kulturach Chlorella vulgaris, który przedstawia się następująco: brassinolide (BL) > 24-epiBL > 28-homoBL > kastasteron (CS) > 24-epiCS > 28-homoCS. Wykazałem, że najsilniejszy wpływ na proces biosyntezy fitochelatyn wywierał miedź i ołów, zaś najsłabszy kadm. Z kolei w kulturach traktowanych mieszaniną metali ciężkich i brassinosteroidów największą zawartość fitochelatyn odnotowano w 24 godzinie hodowli. Wraz z upływem czasu następował spadek zawartości fitochelatyn w kulturach traktowanych metalami ciężkimi i brassinosteroidami od 36 godziny hodowli, zaś dla kultur traktowanych wyłącznie metalami ciężkimi od 48 godziny. Oznacza to, że brassinosteroidy przyspieszały biosyntezę fitochelatyn oraz równocześnie oddziaływały na inny mechanizm związany z detoksykacją metali ciężkich przez rośliny. W hodowli kontrolnej oraz w kulturach traktowanych samymi brassinosteroidami nie stwierdziłem obecności fitochelatyn. Jednocześnie wykazałem, że zawartość tych peptydów była większa w kulturach traktowanych jedynie metalami ciężkimi. Hormony spowodowały szybszy spadek wewnątrzkomórkowej zawartości metali ciężkich w Chlorella vulgaris. Badania własne wykazały, że w warunkach stresu wywołanego działaniem metali ciężkich brassinolid podwyższał aktywność enzymów systemu obronnego przeciwko Strona 17 z 29
stresowi oksydacyjnemu, czego efektem był wzrost zawartości nieenzymatycznych antyutleniaczy: glutationu i askorbinianu oraz aktywności enzymatycznych antyutleniaczy: dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, peroksydazy askorbinianowej i reduktazy glutationowej (Bajguz 2011 1 ). Brassinosteroidy przyspieszają uruchomienie mechanizmu detoksykacji reaktywnych form tlenu, takich, jak: wolnorodnikowy anion ponadtlenkowy, nadtlenek wodoru i rodnik hydroksylowy, ponieważ indukują syntezę i aktywność enzymów bezpośrednio zaangażowanych w usuwanie reaktywnych rodników tlenowych (dysmutazy ponadtlenkowe, katalazy, peroksydazy), jak i enzymów biorących udział w reakcjach utleniania i redukcji kwasu askorbinowego (peroksydaza askorbinianu) czy redukcji glutationu (reduktaza glutationu). Wiadomo, że w wyniku traktowania roślin brassinosteroidami dochodzi do wzrostu zawartości osmoprotektantów takich, jak: prolina, sorbitol, mannitol, które mogą pełnić rolę wychwytywaczy agresywnych metabolicznie form tlenu. Działanie takie wykazują również same brassinosteroidy, dzięki czemu łagodzą skutki stresu oksydacyjnego i opóźniają śmierć komórek. Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały antystresową rolę brassinosteroidów w kulturach glonu Chlorella vulgaris narażonych na działanie metali ciężkich poprzez udział w różnorodnych mechanizmach obronnych. Następstwem tego jest redukcja zawartości wchłoniętego przez komórki metalu ciężkiego oraz działanie stymulujące na procesy wzrostu i rozwoju glonu. Aktywność mechanizmów obronnych podnosi się dzięki obecności egzogennych brassinosteroidów, które: 1) przyspieszały 1 Bajguz A. (2011) Suppression of Chlorella vulgaris growth by cadmium, lead and copper stress and its restoration by endogenous brassinolide. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 60: 406-416. Strona 18 z 29
syntezę fitochelatyn peptydów biorących udział w detoksykacji metali ciężkich (zwłaszcza w ciągu pierwszych 12 godzin od momentu traktowania brassinolidem i metalami ciężkimi w 48 godzinnej hodowli) (Bajguz 2002 1, 2011 2 ) oraz 2) zwiększały poziom enzymatycznych (tzn. dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, peroksydazy askorbinianowej i reduktazy glutationowej) i nieenzymatycznych (tzn. askorbinianu czy glutationu) antyoksydantów związków chroniących rośliny przed stresem oksydacyjnym (Bajguz 2010 3 ). W związku z tym należy traktować brassinosteroidy jako związki, które stymulując aktywność antyutleniaczy enzymatycznych i nieenzymatycznych przyczyniają się do przyspieszenia reakcji usuwania toksycznych form tlenu, których źródłem może być działanie wysokiego natężenia światła, niska i wysoka temperatura otoczenia (Bajguz i Hayat 2009 4 ) czy obecność metali ciężkich w środowisku rośliny (Bajguz 2011 2 ). Stwierdziłem również, że traktowanie brassinolidem kultur narażonych lub nie narażonych na działanie metali ciężkich (kadmu, ołowiu i miedzi) nie wpływa na zmianę endogennej zawartości brassinolidu (Bajguz 2011 2 ). Sugeruje to, że nie dochodzi do bezpośredniej aktywacji biosyntezy brassinosteroidów w roślinach poddanych działaniu metali ciężkich. Jednocześnie stwierdziłem podwyższenie poziomu kwasu indolilo-3- octowego, zeatyny i kwasu abscysynowego przez egzogenny brassinolid w kulturach traktowanych metalami ciężkimi. Świadczy to o współdziałaniu brassinosteroidów 1 Bajguz A. (2002) Brassinosteroids and lead as stimulators of phytochelatins synthesis in Chlorella vulgaris. J. Plant Physiol., 159: 321-324. 2 Bajguz A. (2011) Suppression of Chlorella vulgaris growth by cadmium, lead and copper stress and its restoration by endogenous brassinolide. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 60: 406-416. 3 Bajguz A. (2000) Blockade of heavy metals accumulation in Chlorella vulgaris cells by 24-epibrassinolide. Plant Physiol. Biochem., 38: 797-801. 4 Bajguz A., Hayat S. (2009) Effects of brassinosteroids on the plant responses to environmental stresses. Plant Physiol. Biochem., 47: 1-8. Strona 19 z 29
z innymi fitohormonami w roślinach w odpowiedzi na stres metalami ciężkimi, które odpowiedzialne są za uruchomienie i przyspieszenie mechanizmów obronnych. Z przeglądu literatury wynika, że jest to jedyne jak dotąd doniesienie na ten temat. Brassinosteroidy 1 i ekdsyteroidy 2, jak wykazały moje doświadczenia, powodują skrócenia cyklu rozwojowego Chlorella vulgaris oraz powiększenie objętości komórek. Pod ich wpływem uaktywniły się nowe formy rozrodcze w cyklu komórkowym Chlorella vulgaris o kilkakrotnie większej średnicy, a mianowicie tzw. komórki giganty i ciała palmeloidowe, co doprowadziło do szybkiego zwiększenia liczby komórek. Największy 2,5-krotny wzrost objętości komórek zachodzi pod wpływem 10-8 M brassinolidem (BL). Prawie 2-krotny wzrost wielkości komórek stwierdziłem stosując 24-epiBL, 28-homoBL oraz 20-hydroksyekdyson i jego pochodne. Niewielkie zmiany w objętości komórek zachodzą w kulturach traktowanych kastasteronem i jego pochodnymi. Prawdopodobnie brassinosteroidy wraz z auksynami i cytokininami pobudzają syntezę i aktywność kinazy, która reguluje proces endoreplikacji DNA oraz kontroluje przejście fazy G2 w M podczas cyklu komórkowego. Wzrostowi poziomu endoreplikacji towarzyszy również wzmożona synteza wszystkich rodzajów RNA i białek. Zwiększenie zawartości DNA jest skorelowane z powiększeniem się zarówno objętości jąder 1 Bajguz A. (2000) Effect of brassinosteroids on nucleic acids and protein content in cultured cells of Chlorella vulgaris. Plant Physiol. Biochem., 38 (3): 209-215. Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. 2 Bajguz A., Koronka A. (2001) Effect of ecdysone application on the growth and biochemical changes in Chlorella vulgaris cells. Plant Physiol. Biochem., 39 (7-8): 707-715. Bajguz A., Dinan L. (2004) Effects of ecdysteroids on Chlorella vulgaris. Physiol. Plant., 121: 349-357. Strona 20 z 29
komórkowych, jak i samych komórek. Zależność taką stwierdziłem w komórkach Chlorella vulgaris traktowanych brassinosteroidami i ekdysteroidami charakteryzującymi się wzrostem zawartości DNA na komórkę, z jednoczesnym 2-2,5- krotnym zwiększeniem ich średnicy. Jednakże nie musi występować bezpośredni związek przyczynowo-skutkowy pomiędzy zawartością DNA a wielkością komórek. Może dochodzić do wzrostu liczby kopii (poprzez endoreplikację) genów, które odpowiadają za przyspieszenie metabolizmu i proliferacji komórek. W toku eksperymentów stwierdziłem również występowanie auksyn (kwasu indolilo-3-octowego, kwasu indolilo-3-mlekowego, kwasu indolilo-3-pirogronowego i kwasu 4-chloroindolilo-3-octowego) 1, cytokinin (trans- i cis-zeatyny) (Bajguz 2011 2 ) i kwasu abscysynowego 3 w komórkach Chlorella vulgaris. Pod względem ilościowym w glonie Chlorella vulgaris dominował kwas indolilo-3-octowy (IAA) (0,175 fg kom -1 ), nieco mniejszą zawartość wykazał kwas indolilo-3-pirogronowy (IPyA) (0,139 fg kom -1 ), zaś najmniejszą zawartość posiadał kwas indolilo-3-masłowy (IBA) (0,037 fg kom -1 ) oraz kwas 4-chloroindolilo-3-octowy (0,024 fg kom -1 ). Zawartość trans- i cis-zeatyny wynosiła odpowiednio 0,123 i 0,063 fg kom -1. Przeprowadzone badania wykazały, że egzogenne auksyny i cytokininy w stężeniu 10-3 M działają toksycznie na kultury glonu Chlorella vulgaris 1. Powodowały zahamowanie liczby komórek glonu oraz wzrostu zawartości analizowanych metabolitów białek, chlorofili i cukrów. Z kolei auksyny w stężeniach poniżej 10-6 M, a cytokininy w stężeniach poniżej 10-10 M nie wywierały 1 Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. 2 Bajguz A. (2011) Suppression of Chlorella vulgaris growth by cadmium, lead and copper stress and its restoration by endogenous brassinolide. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 60: 406-416, 2011. 3 Bajguz A. (2009) Brassinosteroid enhanced the level of abscisic acid in Chlorella vulgaris subjected to short-term stress. J. Plant Physiol., 166: 882-886. Strona 21 z 29
istotnych zmian we wzroście i rozwoju Chlorella vulgaris. Zastosowane auksyny (IAA, IBA, kwas indolilo-3-propionowy, IPA) wykazały optimum działania w stężeniu 5 10-5 M. Najbardziej stymulujący wpływ wykazał IAA w stosunku do kontroli, z kolei najmniejszą aktywnością charakteryzuje się IBA. Z grupy cytokinin najbardziej stymulujące działanie na wzrost i metabolizm glonu Chlorella vulgaris stwierdzono pod wpływem zeatyny w stężeniu 10-8 M. Nieco mniejszą aktywnością charakteryzuje się kinetyna, która w stężeniu 10-7 M spowodowała 2-krotny przyrost liczby komórek i wzrost zawartości białek, cukrów oraz chlorofili. Z kolei najsłabszą stymulację wzrostu glonów posiada 10-6 M 1,3-difenylomocznik (DPU). Zastosowane cytokiny wykazały większą aktywność biologiczną w stosunku do auksyn. Pod wpływem cytokinin następuje wzrost liczebności komórek Chlorella vulgaris oraz zawartości analizowanych metabolitów w stężeniach znacznie mniejszych (10-8 -10-6 M), jednocześnie ich aktywność biologiczna jest większa niż auksyn. W związku z tym szereg aktywności przedstawia się następująco: zeatyna > kinetyna > DPU > IAA > IPA > IBA. Stwierdziłem również działanie synergistyczne pomiędzy: 1) brassinosteroidami a auksynami oraz 2) brassinosteroidami a cytokinami na wzrost i rozwój glonu. Niezależnie od zastosowanej mieszaniny brassinosteroidu z auksynami lub cytokininami stwierdziłem przyrost liczby komórek glonu oraz zawartości chlorofilu, cukrów i białek powyżej poziomu stymulacji w kulturach traktowanych pojedynczym hormonem: auksyną, cytokininą lub brassinosteroidem. Najsilniejsze współdziałanie fitohormonów stwierdziłem w kulturach traktowanych mieszaniną brassinosteroidu z cytokininami, zaś słabsze w mieszaninie brassinosteroidu z auksynami. Strona 22 z 29
Wykazałem również regulacyjny wpływ światła i innych fitohormonów na zmiany ilościowe brassinosteroidów (6-deoksotyfasterolu, 6-deoksoteasteronu, 6-deoksokastasteronu, teasteronu, tyfasterolu, kastasteronu i brassinolidu) w Chlorella vulgaris 1. Intensywność światła była regulatorem biosyntezy brassinosteroidów w kulturach glonu Chlorella vulgaris. Wraz ze wzrostem natężenia oświetlenia (0-100 μmola m -2 s -1 PAR) zwiększała się ich endogenna zawartość. Z kolei wysokie natężenie oświetlenia (500 μmola m -2 s -1 PAR) spowodowało obniżenie się zawartości brassinosteroidów, zaś w ciemności nie stwierdzono obecności brassinolidu, co oznacza że wyłącznie światło inicjuje przemianę kastasteronu w brassinolid. Równocześnie stwierdziłem, że barwa światła (białe, niebieskie, czerwone) była regulatorem biosyntezy brassinosteroidów w Chlorella vulgaris, tzn.: 1) niezależnie od zastosowanego rodzaju światła szlaki późnego i wczesnego C6 utleniania przebiegają równolegle, przy czym dominującym był również szlak wczesnego C6 utleniania; 2) jedynie światło białe było aktywatorem przemiany kastasteronu w brassinolid; 3) światło czerwone i niebieskie spowodowało zablokowanie przemiany kastasteronu w brassinolide. Egzogenne podanie brassinolidu kulturom Chlorella vulgaris wyłącznie rosnącym na świetle czerwonym, spowodowało odblokowanie tej przemiany. Pod wpływem kwasu indolilo-3-octowego i trans-zeatyny stwierdziłem w kulturach glonu wzrost zawartości endogennych brassinosteroidów, wchodzących w szlak biosyntezy typu C28. Najsilniej stymulująco działała trans-zeatyna, nieco słabiej kwas indolilo-3-1 Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. Strona 23 z 29
octowy, co świadczy o współdziałaniu fitohormonów na poziomie regulacji ich biosyntezy. Zbadałem również wpływ światła o różnej intensywności (10, 50, 100 i 500 μmola m -2 s -1 PAR) na liczbę komórek i zawartość w nich chlorofili, cukrów i białek w kulturach kontrolnych i traktowanych brassinosteroidami 1. Glony hodowane przy oświetleniu 10 μmola m -2 s -1 PAR wykazały ograniczony przyrost liczby komórek oraz nieznaczną stymulację zawartości ww. składników chemicznych komórki. W ciągu pierwszych 24 godzin hodowli dochodziło do 50% stymulacji wzrostu i rozwoju glonu w porównaniu do kultur glonu w momencie rozpoczęcia doświadczenia. Natomiast począwszy od 36 godziny trwania eksperymentu zaobserwowano fazę stagnacji, wzrost glonu był nieznaczny i wynosił 6-7%. Z kolei kultury Chlorella vulgaris traktowane brassinolidem w stężeniu 10-8 M charakteryzowały się stymulacją wzrostu i zawartości chlorofili, cukrów i białek przeciętnie o 50-164%. Wraz ze wzrostem intensywności oświetlenia od 50 do 100 μmola m -2 s -1 PAR stwierdzono stymulację wzrostu i rozwoju glonu. Z kolei światło o intensywności 500 μmola m -2 s -1 PAR było czynnikiem ograniczającym przeciętnie o 15% wzrost liczby komórek glonu oraz zawartości chlorofili, cukrów i białek, którego zniesienie było możliwe dopiero po dodaniu brassinosteroidu. Wykazałem także antystresową rolę brassinosteroidów w kulturach Chlorella vulgaris, które zostały narażone na niekorzystne działanie światła czy temperatury 1. Niska (5-15 C) i wysoka (35-40 C) temperatura była czynnikiem ograniczającym wzrost 1 Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. Strona 24 z 29
i rozwój glonu, przy czym traktowanie kultur brassinolidem spowodowało podwyższenie aktywności Chlorella vulgaris. Najbardziej optymalną dla rozwoju glonu okazała się temperatura 25-30 C. W kulturach Chlorella vulgaris rosnących w warunkach stresowych oraz traktowanych brassinolidem odnotowałem przyspieszenie syntezy enzymatycznych antyutleniaczy (dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, peroksydazy askorbinianowej i reduktazy glutationowej) oraz nieenzymatycznych antyutleniaczy (askorbinianu czy glutationu). Bodziec cieplny był także jednym z czynników determinujących syntezę specyficznych cząsteczek ochronnych białek szoku termicznego. Brassinolid selektywnie stymulował syntezę odpowiednich polipeptydów. Pod wpływem brassinolidu w komórkach glonu, poddanych działaniu temperatury 30 C, stwierdziłem pojawienie się sześciu polipeptydów o masie cząsteczkowej: 30, 40, 45, 70, 90 i 100 kda, z tego trzy nowe: 30, 40 i 100 kda w stosunku do kontroli; w temperaturze 35 C nowe polipeptydy o masie cząsteczkowej 27, 43 i 60 kda. Natomiast w kulturach glonu rosnących w temperaturze 40 C pojawiły się dodatkowo polipeptydy 35 i 105 kda. Brassinolid zwiększał poziom niektórych polipeptydów, np. o masie 70 kda, zaś inne indukował de novo, tj. 27, 35, 43 i 60 kda 1. Jednocześnie związek ten stymulował syntezę endogennego kwasu abscysynowego (hormonu stresu, jednego z kluczowych elementów w mechanizmach obronnych) w kulturach Chlorella vulgaris narażonych na stres termiczny 2. 1 Bajguz A. (2007) Wpływ brassinosteroidów na kultury glonu Chlorella vulgaris poddane działaniu wybranych fitohormonów i czynników stresowych. Wyd. UwB, Białystok, ISBN 978-83-7431-130-4, ss. 193. 2 Bajguz A. (2009) Brassinosteroid enhanced the level of abscisic acid in Chlorella vulgaris subjected to short-term stress. J. Plant Physiol., 166: 882-886. Strona 25 z 29
Oddziaływanie ekdysteroidów na rośliny znalazło się również w polu mojego zainteresowania. Są to związki naturalnie występujące w roślinach, o strukturze chemicznej podobnej do brassinosteroidów 1. W toku badań wykazałem stymulujące działanie kilku ekdysteroidów (20-hydroksyekdysonu i jego pochodnych) na wzrost i biochemizm glonu Chlorella vulgaris; zbadałem zmiany ilościowe endogennych białek, cukrów, chlorofilu i karotenoidów, fosforu organicznego i nieorganicznego 2. Ponadto stwierdziłem antystresową rolę ekdysteroidów w kulturach Chlorella vulgaris traktowanych ołowiem, poprzez udział w mechanizmach detoksykacyjnych, m.in. przez przyspieszenie biosyntezy fitochelatyn 3. W eksperymentach własnych wykorzystywałem także jedną z najmniejszych roślin naczyniowych wolfię bezkorzeniową (Wolffia arrhiza) należącą do rodziny rzęsowate (Lemnaceae). Efektem przeprowadzanych doświadczeń na tej roślinie jest m. in. artykuł opublikowany w Phytochemistry (2005 r.) 4, a dotyczący wpływu brassinosteroidów oraz zahamowania wzrostu wolfii poprzez działanie inhibitora biosyntezy brassinosteroidów brassinazolu, co może świadczyć o przypuszczalnym występowaniu tych fitohormonów w tej roślinie. Rozszerzone wyniki badań dodatkowo zaprezentowałem w postaci kilku komunikatów na zjazdach naukowych. W niedalekiej przyszłości planuję kontynuację podjętego tematu badań, tzn. izolację endogennych 1 Bajguz A. (2000) Ekdysteroidy w roślinach. Kosmos, 49 (1-2): 169-178. 2 Bajguz A., Koronka A. (2001) Effect of ecdysone application on the growth and biochemical changes in Chlorella vulgaris cells. Plant Physiol. Biochem., 39 (7-8): 707-715. Bajguz A., Dinan L. (2004) Effects of ecdysteroids on Chlorella vulgaris. Physiol. Plant., 121: 349-357. 3 Bajguz A., Godlewska-Zylkiewicz B. (2004) Protective role of 20-hydroxyecdysone against lead stress in Chlorella vulgaris cultures. Phytochemistry, 65 (6): 711-720. 4 Bajguz A., Asami T. (2005) Suppression of Wolffia arrhiza growth by brassinazole, an inhibitor of brassinosteroid biosynthesis and its restoration by endogenous 24-epibrassinolide. Phytochemistry, 66: 1787-1796. Strona 26 z 29
steroidów w wolfii bezkorzeniowej, ich analizę ilościową w roślinie rosnącej w różnorodnych warunkach środowiskowych. Współuczestniczyłem również w badaniach dotyczących wpływu auksyn, cytokinin, gibereliny GA3 1, poliamin 2, kwasu salicylowego 3 i kwasu jasmonowego 4 na zmiany w metabolizmie Chlorella vulgaris oraz Wolffia arrhiza w których stwierdziliśmy stymulujący wpływ ww. związków na kultury glonu. W badaniach dotyczących wpływu kwasu jasmonowego na kultury wolfii bezkorzeniowej poddanej działaniu kadmu i ołowiu stwierdziliśmy, że kwas jasmonowy jest substancją stymulującą wzrost tej rośliny, zaś w przypadku niekorzystnego oddziaływania metali ciężkich (kadmu i ołowiu) przyspiesza mechanizmy obronne zwiększając poziom enzymatycznych oraz nieenzymatycznych antyoksydantów. Badania wykazały, że kwas jasmonowy modyfikuje wpływ ołowiu na kultury wodne Wolffia arrhiza oraz jego biosorpcję ze środowiska. W wysokich stężeniach (10-4 M) kwas jasmonowy wzmaga toksyczność metalu, natomiast w niskim stężeniu (10-6 M) fitohormon stymuluje wzrost rośliny, akumulację metabolitów (białek, monosacharydów, barwników fotosyntetycznych) oraz aktywuje enzymatyczne i nieenzymatyczne antyoksydanty 5. 1 Falkowska M., Pietryczuk A., Piotrowska A., Bajguz A., Grygoruk A., Czerpak R. (2011) The effect of gibberellic acid (GA3) on growth, metal biosorption and metabolism of the green algae Chlorella vulgaris (Chlorophyceae) Beijerinck exposed to cadmium and lead stress. Pol. J. Environm. Stud. 20: 53-59. 2 Czerpak R., Bajguz A., Piotrowska A., Dobrogowska R., Matejczyk M., Wiesławski W. (2003) Biochemical activity of diand polyamines in the green alga Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). Acta Soc. Bot. Pol., 72 (1): 19-24. 3 Czerpak R., Bajguz A., Piotrowska A., Polecka M. (2001) Effect of izomers of hydroxybenzoic acid on the growth and metabolism of Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). Acta Soc. Bot. Pol., 70 (4): 253-259. Czerpak R., Bajguz A., Gromek M., Kozłowska G., Nowak I. (2002) Activity of salicylic acid on the growth and biochemism of Chlorella vulgaris Beijerinck. Acta Physiol. Plant., 24 (1): 45-52. 4 Piotrowska A., Bajguz A., Czerpak R., Kot K. (2010) Changes in the growth, chemical composition and antioxidant activity in aquatic plant Wolffia arrhiza (L.) Wimm. (Lemnaceae) exposed to jasmonic acid. J. Plant Growth Regul., 29: 53-64. 5 Piotrowska A., Bajguz A., Czerpak R., Kot K. (2010) Changes in the growth, chemical composition and antioxidant activity in aquatic plant Wolffia arrhiza (L.) Wimm. (Lemnaceae) exposed to jasmonic acid. J. Plant Growth Regul., 29: 53-64. Strona 27 z 29