XI SZKOŁA TECHNOLOGII FERMENTACJI Łódź, 29 marca - 01 kwietnia 2006 NANOBIOROBOTY: PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE dr. hab. Anna Salek, International Bio-Consulting, Niemcy 1. Wstęp Nanobioroboty (nanobioboty, nanoboty) są to zaprogramowane przez nanotechnologów struktury lub kompozycje elektroniczne (np. bionems), wykonane w nanoskali (1-100 nm) z nowych typów materiałów (np. włókien węglowych lub biopolimerów w formie nanomembran), z udziałem AFM (atomowego mikroskopu) [1]. Nanobioroboty przy samoporządkowaniu się (self-assembly) lub przy tzw. wewnątrzkomórkowym transporcie różnych substancji (aktywatorów lub inhibitorów), współdziałają również z większymi podjednostkami organizmu, tj. z całymi zespołami tkanek. Istnieją podstawy do przypuszczeń, że nanostruktury będą odgrywać nieocenioną rolę w informatyce i w związanych z nią dyscyplinach biologicznych. Wykorzystanie w biologii molekularnej nanodetektorów (nanobiosensorów, szczególnie o powierzchni spreparowanej techniką nanofluidyzacyjną), w roli nanobiorobotów jako nanocząsteczek (nanoparticles, nanokapsułek), służacych do: sterowania oraz kontroli wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych i anabolicznych (step by step in real time), w inżynierii genetycznej (genomics) i w inżynierii atomowej komórki - do konstrukcji nowych hybrydów, a właściwie małych fragmentów DNA (nanodots), uzyskanych drogą transformacji pewnych nanobiomotorów,
2 Anna Sałek jak również użycie nanobiorobotów do wszelkich innych manipulacji genetycznych, np. sekwencjonowania genów i analizy GMO, czy w biochemii białek, podczas tzw. proteomics, stosując technikę lab-on-achip, otwiera kolejne fantastyczne możliwości w biotechnologii, a właściwie w nanobiotechnologii. Czy użycie nanobiomotorów zmierza do tzw. traceability? Publikowana powszechnie wizja eliminacji rolnictwa podczas nie-biologicznej produkcji żywności metodami nanotechnologicznymi (atom-by-atom) jest zbyt ekstremalna i daleko wybiegająca w przyszłość. Realnym są natomaiast innowacje nanobiotechnologiczne w produkcji wód pitnych i napojów oraz w tzw. nutraceuticals /functional food, polegające na wzbogacaniu żywności w wartościowe dodatki (np. środki przeciwutleniające), bądź na wprowadzaniu do organizmu ludzkiego substancji leczniczych w sposób ściśle ukierunkowany oraz bez strat organoleptycznych, czy zdrowotnych (tzw. system drug delivery). Przykładem praktycznego wdrażania nanotechnologicznych osiągnięć mogą być produkty firmy Nestle AG, czy Kraft Foods AG, które koncentrują się na różnych rozwiązaniach, jak personal foods, przygotowanych w formie nanokapsułek i przystosowanych do indywidualnych upodobań konsumentów lub do potrzeb zdrowotnych pacjentów. Innym praktycznym i bardzo obiecującym elementem innowacyjnym w technologii żywności może być zastosowanie tzw. smart foods, tj. elektronicznych identyfikatorów w roli biorobotów-sensorów, umieszczonych w żywności i wykrywających obecność niepożądanych mikroorganizmów czy związków chemicznych, sygnalizując tym samym kontaminację produktu i jego potencjalne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Nanobioroboty, mogą być
NANOBIOROBOTY: PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE 3 pomocnymi elementami zagadnień z zakresu tzw. risk assessment, food & safety oraz monitoringu higieny produkcji żywności. 2. Rozwinięcie Nowe tendencje badawcze w nanotechnologii, mogące zrewolucjonizować wiele dziedzin życia, a w tym technologię żywności i rolnictwo, obejmują: BioNEMS (bionanomechaniczne systemy), w skład których wchodzą różnego rodzaju biomotory, sensory, pompy, rotory, itp. przyrządy, sztucznie skonstruowane lub naturalnie odzyskiwane [6, 9, 10]. Procesy nanobiotechnologiczne, w skład których wchodzą wszelkie manipulacje zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe (np. bioinżynieria DNA lub białek błony komórkowej), self-assembly, fabrykacja tkanek i określonych bio-produktów [6]. Systemy nanokapsułek, przenoszące suplementy dla potrzeb funkcjonalnej żywności oraz niebezpieczne leki (w medycynie drug delivery lub smart drugs, np. przy leczeniu nowotworów) [2-5, 7]. Specyficzne nanobiomotory likwidujące skażenia środowiska mikroorganizmami patogennymi (systemy zwane cleanerami ) [8, 11]. Rys. 1. Cleaners Kolektor mikroorganizmów Rys. 1. Systemy nanobiorobotów zwane Cleaner ami (czyściciele). Wg Roberta Freitas [8]. Bioseparacja i diagnostyka oparta na selektywnej identyfikacji powierzchni komórkowych mikroorganizmów, w tym patogenów
4 Anna Sałek żywności (zastosowanie systemu specyficznych receptorów, immunologicznego powinowactwa) [7, 8]. Nowe typy materiałów opracowanych specjalnie dla nanotechnologii, jak kompozycje biopolimerowe (np. powiązane ze specyficznym DNA), nanomembrany oraz włókna węglowe, silikonowe lub tytanowe, stosowane już od pewnego czasu przez europejskie i amerykańskie firmy do nanofiltracji w browarnictwie i do odsalania wód morskich. Nowe techniki / technologie konstrukcji nanobiomotorów oraz chipów, jak mikro-, nanofluidyzacja i fotolitografia, opierające się na wykorzystaniu AFM (atom force mikroskopy) [7, 8, 9, 10]. Rys. 2. Rys. 2. Atom Force Microskopy (AFM): system do fotolitografii powierzchni chipów [7]. Technikę i produkcję bio-chipów, np. lab-on-a-chip, wykorzystaną w kompleksowej analizie badanego systemu biologicznego [6]. Najbardziej intereseujące z punktu widzenia procesów fermentacyjnych wydaje się być zastosowanie powyższych nowinek do analizy wody technologicznej i monitoringu przebiegu fermentacji in real time, z uwagi na ewentualną
NANOBIOROBOTY: PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE 5 obecność trujących związków chemicznych, resztek antybiotyków, toksyn czy obcych mikroorganizmów, zakłócających prawidłową technologię i jakość piwa. Z kolei, z uwagi na materiał do słodowania ważna jest szybka i bezbłędna analiza obecności GMO oraz charakterystyka fizjologiczno-genetyczna drożdży browarniczych, korygowana na bieżąco, tj. podczas respiracji, fermentacji i innych procesów katabolicznych oraz anabilicznych w czasie produkcji. Ostatnie osiągnięcia naukowe z dziedziny biologii komórkowej przyczyniły się do wyczerpującego zrozumienia funkcji i mechanizmu działania biomolekularnych motorów w mikroorganizmach, przeważnie eukariotycznych oraz w tkankach organizmów wyższych. Pewna grupa biomotorów, spełniająca rolę ośrodków energetycznych, przetwarza różne substancje chemiczne (np. fosforowe, jak ATP) głównie na energię mechaniczną. Inny rodzaj biomaszyn jest zdolny do replikacji materiału genetycznego i syntezy białek, np. polimerazy DNA i szereg enzymów zaangażowanych w translacji białek [1, 9]. Fakt ten stworzył możliwości wykorzystania naturalnych nonorobotów, np. pochodzenia białkowego, m.in. jako nanomaszyn w sfabrykowanych układach typu lab-on-a-chip, jak również w roli biosensorów i aktywnych bionanomembran o strukturze nanobioplimeru, połączonego ze sztucznym fragmentem DNA (Rys. 6). Nanobiomotory w postaci nanokapsułek są transporterami, przenoszącymi substancje wzbogacające, barwniki i witaminy, użyteczne w fukcjonalnej żywności, jak również leki, stosowane w profilaktyce (szczepionki, przeciwciała) oraz w medycynie (antybiotyki, leki przeciwnowotworowe). Biomolekularne motory mogą formować w nanoskali podstawy nowych nanokonstrukcji oraz dokonywać aktywnej ich strukturyzacji i wszelkich manipulacji,
6 Anna Sałek wg techniki Feymana bottom-up i atomowej mikroskopii (AFM) [8]. W nanobiotechnologii skoncentrowano się na molekularnych motorach [1, 9]: typu liniwego (linearne), jak miozyna i kinezyna, generujących siłę ruchu wewnątrzkomórkowych struktur, zwanych filamentami (Rys. 3) oraz na motorach liniowych będących enzymami przemieszczającymi się wzdłuż nici DNA i RNA Rys. 3. Nanobiomotor typu liniowego: miozyna. na motorach typu rotacyjnego, wytwarzających energię obrotową wewnątrz dużych kompleksów białkowych, do których zaliczana jest syntaza ATP Rys. 4. Nanobiomotor typu rotacyjnego: syntaza ATP. Aktualnie biotechnologowie przygotowują się do zastosowania wyżej wymienionych biologicznych bionanomotorów w praktyce medycznej,
NANOBIOROBOTY: PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE 7 profilaktycznej, żywieniowej oraz w różnych procesach przemysłowych. Do kontrukcji i działania tych nanomaszyn, wykorzystuje się najnowsze osiągnięcia genomiki, proteomiki, transkriptomiki, technologii chipów, syntezy sztucznych chromosomów oraz inżynierii naturalnych biobotów. Większość prac dotyczy różnego typu nanomaszyn, jednakże przeznaczonych dla medycyny, np. nanobioroboty jako wektory w terapii genowej lub przy leczeniu schorzeń nowotworowych [2, 3, 4, 5, 7, 8]. Dla technologów żywności interesujące jest użycie technik genetycznych i nanotechnologicznych, zmierzających do budowy nanomaszyn, w szczególności: zaprzęgniętych do tworzenia mikroorganizmów funkcjonalnych pod względem przemysłowym, tzn. generujących produkcję pożądanych cząsteczek białkowych, witamin, hormonów, enzymów oraz wyzwalających dodatkową energię, reperujących zmiany typu drobnych mutacji, jak również transportujących w obie strony poprzez błonę komórkową różnego rodzaju związki chemiczne; nanomaszyn w formie zróżnicowanych nanokapsułek, przenoszących do organizmu lub funkcjonalnej żywności substancje wzbogacające i zapobiegających chorobom, jak np. witaminy, aminokwasy, białka odpornościowe, NNKT, związki energetyczne i niezbędne minerały, przeciwutleniacze, barwniki oraz niektóre substancje ochronne (przeciwbakteryjne); zespołu nanomotorów, likwidujących zanieczyszczenia środowiska technologicznego obcymi mikroorganizmami i chemikaliami (cleaners); specyficznych nanomotorów, zw. smart drugs, wyposażonych w odpwiednie receptory oraz inhibitory, działających wybiórczo w stosunku do mikroorganizmów i ich toksyn, skażających środowisko produkcyjne;
8 Anna Sałek nanobiorobotów jako biosensorów w procesach biotechnologicznych, wykorzystujących m.in. technikę lab-on-a-chip, bioplimery, włókna węglowe, połączone z sztucznym fragmentem DNA na bazie silikonowej [Rys.5 i 6]: hν Fluorescencja Hybryd Baza silikonowa cdna DNA próbki Rys. 5. Hybrydyzacja (genetyczna rekombinacja lub identyfikacja) na biochipie [6, 8, 9]. Rys. 6. Bionanoroboty. Różne konfiguracje protein i sztucznego DNA [NASA Institute, USA].
NANOBIOROBOTY: PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA W DIAGNOSTYCE 9 LITERATURA [1] Balzani V., Credi A., Venturi M.: Molecular Devices and Machines, Book, (2003). [2] Cavalcanti A., Freitas R., Kretly L.C.: Nanorobotics control design: A practical approach tutorial, ASME Design Engineering Technical Conferences, (Salt Lake City, USA, September/October 2004). [3] Cavalcanti A., Rosen L. et al.: Nanorobotic challenges in biomedical applications, design and control, IEEE ICECS Int. Conf. On Electronics, Circuits System, (Tel-Aviev, Israel, December 2004). [4] Cavalcanti A., Freitas R.: Nanorobotics control design: A collective behavior approach for medicine, IEEE Transactions on Nanobioscience, 4, (2005), 133-140. [5] Cavalcanti A.: Robots in surgery, Euro Nano Forum 2005, Nanotechnology and the Health of the EU Citizen in 2020, Plenary Lecture, (Edinburgh, UK, September 2005). [6] DNA-based molecular construction, International Workshop, (Jena, Germany, May 2002). [7] Dufrene Y.F.: Using nanotechniques to explore microbial surfaces, Nature Reviews. Microbiology, 2, (2004), 451-460. [8] Freitas R. A. Jr.: The future of Nanofabication and Molecular scale devices in nanomedicine, Nanomedicine, Book Charpter MIT-OIS, (July 2002). [9] Goodsell D.S.: Bionanotechnology. Lessons from Nature, Book, J. Wiley-Liss, (2004). [10] Niemeyer C.M., Mirkin C.A.: Nanobiotechnology. Concepts, Application and Perspectives, Book J. Wiley-VCH, (2004). [11] Svidinenko Y.: Bacteria Hunter The Worm Medicine Nanorobotic Device, Oslik (Oslik), (2006.01.26). NANOBIOROBOTS: OUTLOOK OF APPLICATION IN DIAGNOSTICS Abstract Recent advances in understanding how biomolecular motors work has raised the possibility that they might find various applications as nanomachines. Also, due to the progress in the field of nanotechnology - nanorobots manufacturing has been growing gradually. From such achievements in molecular electronics (molecular nanotechnology), as well as recent results in biotechnology and genetics, the first operating biological robots are expected to appear in the coming 5 years. In terms of time it means a very near better future with significant improvements also in food technology or functional food. The use of nanorobots in biotechnology has provided additional tools for molecular biology enabling minimally invasive intervention during genetic manipulation or even long distance tele-control-regulation of cell synthesis and metabolism (including industrial microorganisms) by such devices in part of sensors as well as nanoparticles / nanocapsules. Now, we became fasci-
10 Anna Sałek nated with the prospect of visualising (under AFM) in real time, i.e. the single-molecule dynamics of the polymerase motors or receptors binding on the surface of cell membranes. Successful nanorobotic system must be able to respond efficiently in real time diagnosis or monitoring to changing aspects of microenvironments of food, not previously examined, from a control perspective by detecting of food-borne pathogens and spoilage microorganisms before it s packaged. Delivery to our organisms (through functional food) some dietary supplements and active ingredients (as vitamins, flavours, natural colours, antioxidants) is realised via encapsulated nanobiomotors / particles, with a diameter of less than 30 nm, called miscelles. The automation and manufacturing of nanorobots (nano-fabrication) is a challenging in many fields. Realising revolutionary applications of nanorobots to health, environmental and food technology problems raises new control challenges. The design and the development of complex nanomechatronic systems (NEMS), encapsulation or construction of lab-on a-chip with high performance (using for example nanobiopolymer membranes, gold-sensors, silicon or carbon nanotubes technology) should be addressed via simulation to help pave the way for future applications of nanorobots in biotechnological problems, promising as a method for chemical and biological detection.