Ćwiczenie 4. Elektrochemiczny czujnik glukozy (na prawach rękopisu) Czujniki są prostymi urządzeniami, które dają informacje o parametrach obiektu czy też otoczenia bez wstępnego przygotowania próbek. Można je podzielić na dwie podstawowe grupy: fizyczne i chemiczne. Podstawą tego podziału jest rodzaju sygnału wejściowego powodującego zmiany parametrów sensora. Czujniki chemiczne są urządzeniami, w których informacja chemiczna (obecność, próg detekcji, itp.) jest przekształcana na użyteczny sygnał analityczny (według IUPAC). Sensory chemiczne zbudowane są z minimum dwóch części: części receptorowej i aktuatorowej. Część receptorowa oddziałuje bezpośrednio z analizowanym czynnikiem. W wyniku tego oddziaływania zmianie ulegają jej parametry. Zmiany te przekształcane są przez część aktuatorową w sygnał analitycznie użyteczny. Sensory chemiczne dzielmy w zależności od rodzaju sygnału wyjściowego. I tak można wyróżnić chemiczne sensory: optyczne, elektrochemiczne, rezystancyjne, czułe na zmianę masy, termometryczne, itp. Wśród chemicznych sensorów można wyróżnić jeszcze jedną grupę tzn. biosensory. Grupa ta zawiera dodatkowo część biologiczną (rys. 1), którą stanowią różnego rodzaju materiały biologiczne. W wyniku oddziaływania tych materiałów biologicznych z oznaczaną substancją powstają różnego rodzaju sygnały pośredni, które są sygnałem wejściowym różnego rodzaju sensorów (rys. 1). Tkanka cz ą stki elektrodowoaktywe Elektrody jonoselektywne A t nali Mikroorganizm Organ ęe lla Kwas nukleinowy Kom órka receptorowa Enzym Przeciwcia ła Materia ł y biologiczne zmiana ph ciep ło zmiana masy ś ło wiat Sygna ł po ś redni FET ISFET Elektrody ph - metryczne Termistor Piezoelektryk Fotodetektor Sensor Sygnał wyjś ciowy Zasada dzia ł ania biosensora Rys. 1. Schemat biosensora. W zależności od metody detekcji sygnału pośredniego biosensory można podzielić na amperometryczne, potencjometryczne, konduktometryczne, termistorowe czy też
z tranzystorem. Wśród biosensorów najważniejsze są czujniki elektrochemiczne określane jako elektroda jonoselektywna lub układ takich elektrod. Jeśli elektrodę jonoselektywną pokryje się warstewką materiału zawierającego enzym, powodującego przebieg określonej reakcji enzymatycznej, wówczas elektrodę taką nazywa się elektrodą enzymatyczną. Elektrody enzymatyczne według IUPAC należą do elektrod uczulanych, tj. są wykonane z materiału biologicznego wyodrębniającego i przetwarzającego oraz z właściwej elektrody jonoselektywnej. W wyniku reakcji enzymatycznej zachodzącej w na elektrodzie powstaje produkt powodujący zmianę potencjału elektrody jonoselektywnej. Klasycznym przykładem elektrody enzymatycznej jest elektroda służąca do oznaczania mocznika. Cząsteczki mocznika dyfundujące z objętości roztworu przez pierwszą błonę półprzepuszczalną do powierzchni elektrody ulegają w warstwie żelu zawierającego enzym ureazę rozkładowi enzymatycznemu zgodnie z reakcją enzymatyczną: ureaza CO NH H O H CO NH ( ) 4 Powstałe w wyniku reakcji jony amonowe ( NH ) dyfundują przez drugą półprzepuszczalną błonę do powierzchni elektrody szklanej powodując zmianę jej potencjału (rys. ). elektroda szklana 4 błona półprzepuszczalna warstwa enzymu ureazy (1). błona półprzepuszczalna mocznik jon amonowy Rys.. Schemat warstw w enzymatycznym czujniku mocznika. W czujnikach enzymatycznych produktami powodującymi zmiany potencjału elektrochemicznego elektrody, są na ogół jony nieorganiczne, np. jodkowe lub produkty gazowe, np. amoniak. Ten rodzaj elektrod jonoselektywnych służy do oznaczania substratu. Elektrody enzymatyczne mogą również służyć do oznaczania koncentracji danego enzymu. W tym przypadku elektroda jonoselektywna pokryta jest warstwą materiału zawierającego substrat. Substrat ten reaguje z oznaczanym enzymem. W wyniku tej reakcji powstaje produkt, który wpływa na wartość potencjału elektrochemicznego elektrody. Czujniki enzymatyczne można podzielić, ze względu na rodzaj metody elektrochemicznej zastosowanej do detekcji sygnału pośredniego, na: potencjometryczne, amperometryczne i konduktometryczne. Najczęściej stosuje
się metodę potencjometryczną. Enzymatyczne czujniki potencjometryczne można z kolei podzielić w zależności od rodzaju zastosowanej elektrody jonoselektywnej, np.: amonowa, jodkowa, fluorkowa, itp., gazowa, elektroda redoks czy też tranzystor polowy czuły na jony wodorowe lub amonowe (ISFET, HEMFET). Innym stosowanym kryterium podziału elektrod enzymatycznych jest liczba enzymów w warstwie: czujniki monoenzymatyczne (najliczniejsza grupa) i polienzymatyczne. Występują również czujniki mieszane enzymatyczno-bakteryjne lub enzymatyczno-tkankowe. Nową grupą biosensorów, które mają duże znaczenie w ocenie stanu środowiska naturalnego oraz w medycynie są bioczujniki immunologiczne (immunosensory) 1. Biosensory te służą do oznaczania różnych substancji posiadających znaczenie immunologiczne. Substancjami tymi są proteiny, surowice, hormony, herbicydy i inne. Immunosensory charakteryzują się na ogół dużą czułością, dużą szybkością odpowiedzi, małym zakresem detekcji oraz dają możliwość automatyzacji. Biosensory znajdują zastosowanie przede wszystkim w medycynie. Jednym z biosensorów bardzo powszechnie stosowanym są czujniki glukozy (cukier prosty). Pomiar stężenia glukozy ma istotne znaczenie nie tylko w medycynie. Jednakże zdecydowanie najważniejszą rolę odgrywają one w życiu ludzi chorych na cukrzycę. Według danych US NIH (Instytut Zdrowia USA) w 00 roku w Stanach Zjednoczonych było około 15,9 mln. diabetyków. Węglowodany (cukry) są to związki organiczne szeroko rozpowszechnione zarówno w świecie zwierzęcym jak i roślinnym. Związki te pełnią rolę substancji strukturalnych jak również metabolicznych. Najważniejszym węglowodanem jest glukoza. W roślinach syntezowana jest ona z dwutlenku węgla i wody w procesie fotosyntezy i gromadzona w roślina jako skrobia lub jest przekształcana w błonnik szkieletu roślinnego. Również zwierzęta mogą syntezować niektóre węglowodany z tłuszczu. Jednak większa część węglowodanów zwierzęcych jest pochodzenia roślinnego. Większość węglowodanów zawartych w pokarmach wchłania się do krwioobiegu jako glukoza lub też jest w nią przekształcana w wątrobie. W organizmie z glukozy mogą powstawać wszystkie inne cukry. Glukoza jest bardzo ważnym źródłem energii w tkankach ssaków (z wyjątkiem przeżuwaczy) oraz uniwersalnym paliwem dla płodu. 1 Immunologia to nauka zajmująca się wpływem czynników chorobotwórczych na odporność organizmu.
W cząsteczce glukozy (rys. ) występują asymetryczne atomy węgla wobec tego występują izomery konfiguracyjne D i L. Obecność asymetrycznych atomów w cząsteczce glukozy nadaje jej również aktywność optyczną. Znaczenie fizjologiczne ma glukoza D(-). Jej źródłem są soki owoców i hydrolizaty skrobi, sacharozy, maltozy i laktozy. Rys. 3. Wzór strukturalny glukozy. Określanie poziomu glukozy jest bardzo ważne w medycynie, biotechnologii i przemyśle spożywczym. Dokładność i szybkość określenia poziomu tej substancji jest szczególnie istotne w przypadku osób chorych na cukrzycę. Stężenie glukozy w analicie można określać metodami optycznym lub elektrochemicznymi. Zdecydowanie szerzej stosowane są różne metody elektrochemiczne takie jak amperometria czy też cykliczna woltamperometria. Jako czujniki do oznaczania glukozy stosuje się między innymi amperometryczne sensory uczulane enzymatycznie. Czujnik ten stanowi elektroda tlenowa zawierająca odpowiedni enzym w części receptorowej. Enzymem tym jest β-oksydaza glukozowa, która katalizuje następującą reakcję utleniania glukozy: C H O O H O C H O H () 6 1 6 6 1 7 O Czujniki te cechuje przede wszystkim wysoka selektywność w stosunku do glukozy. Na powierzchni elektrody tlenowej znajduje się warstwa immobilizowanego (unieruchomionego) enzymu. Tak skonstruowaną elektrodę tlenową uczuloną enzymatycznie zanurza się w roztworze nasyconym tlenem z powietrza i rejestruje prąd początkowy. Po wprowadzeniu do badanego roztworu glukozy część tlenu dyfundującego do katody jest zużywana w reakcji utlenienia glukozy z wykorzystaniem immobilizowanego enzymu zgodnie z reakcją (). W wyniku tego procesu zmniejsza się koncentracja tlenu w roztworze i maleje strumień jego dyfuzji w kierunku powierzchni katody. Gdy procesy na elektrodzie osiągną stan ustalony, wówczas rejestruje się prąd końcowy. Obserwowany spadek natężenia prądu jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy. Wykonując pomiary natężenia prądu dla różnych koncentracji glukozy wyznacza się krzywą kalibracyjną. Na podstawie znajomości krzywej kalibracyjnej oznacza się stężenie glukozy w badanej próbce. Często przed pomiarem należy daną próbkę rozcieńczyć.
Określenia poziomu glukozy można również dokonać stosując elektrodę jodkową. Jeśli elektroda ta stanowi istotną część sensora wówczas reaguje ona na obecność produktu reakcji (), tzn. nadtlenku wodoru, który w reakcji następczej utlenia jony jodkowe według równania: O J H J H O. (3) H W wyniku tej reakcji zmienia się koncentracja jonów jodkowych w membranie zawierającej jod i jony jodkowe co powoduje zmianę sygnału elektrochemicznego elektrody. Do oznaczeń tych można stosować również inne elektrody redoks. Cel ćwiczenia: 1. Zapoznanie się z metodami pomiaru glukozy.. Przygotowanie roztworów. 3. Wykonanie krzywej kalibracji. 4. Wyznaczenie koncentracji glukozy w podanym roztworze. Literatura. 1. Cygański A., Podstawy metod elektroanalitycznych, WNT Warszawa (1999).. Dowolny podręcznik do Chemii fizycznej.