Związek między metforminą, podwyższonymi poziomami homocysteiny i kwasu metylomalonowego, oraz pogorszoną klinicznie cukrzycową neuropatią obwodową

Diabetes Care Publikacja przed drukiem, publikacja z dnia 21 października 2009 r. Związek między metforminą, podwyższonymi poziomami homocysteiny i kwasu metylomalonowego, oraz pogorszoną klinicznie cukrzycową neuropatią obwodową Tytuł skrócony: Daryl J. Wile, MD1, Cory Toth, MD2 1. Uniwersytet w Calgary Wydział Medycyny, Calgary, AB, Kanada 2. Wydział Neuronauk Klinicznych na Uniwersytecie w Calgary, Calgary, AB, Kanada Autor: Daryl Wile Email: daryl.wile@albertahealthservices.ca Dodatkowe informacje na temat niniejszego artykułu można uzyskać w dodatku online na stronie http://diabetes.diabetesjournals.org Złożono 28 marca 2009 r. i zaakceptowano 10 października 2009 r. Niniejszy dokument stanowi wersję elektroniczną bez adiustacji artykułu zatwierdzonego do publikacji w piśmie Diabetes. Amerykańskie Towarzystwo Diabetologiczne, wydawca pisma Diabetes, nie ponosi odpowiedzialności za wszelkie błędy lub pomyłki w niniejszej wersji manuskryptu ani w jakiejkolwiek wersji sporządzonej na jej podstawie przez osoby trzecie. Ostateczna wersja zatwierdzona przez wydawcę będzie dostępna w przyszłym wydaniu pisma Diabetes w formie drukowanej oraz online pod adresem http://diabetes.diabetesjournals.org. Prawa autorskie American Diabetes Association, Inc., 2009 1

Cel: Ciężkość neuropatii obwodowej u pacjentów z cukrzycą jest zróżnicowana z niejasnych przyczyn. Długoterminowe stosowanie metforminy kojarzone jest z zaburzeniami wchłaniania witaminy B 12 (kobalamina; Cbl) oraz podwyższonym poziomem homocysteiny (Hcy) i kwasu metylomalonowego (MMA), co może mieć niekorzystny wpływ na nerwy obwodowe. Niniejsze badanie ma na celu wyjaśnienie związku między ekspozycją na metforminę, poziomami Cbl, Hcy i MMA, oraz stopniem ciężkości neuropatii u pacjentów z cukrzycą. Postawiliśmy hipotezę twierdzącą, że ekspozycja na metforminę jest kojarzona z niższymi poziomami Cbl, podwyższonymi stężeniami Hcy i MMA oraz cięższą neuropatią obwodową. Projekt badawczy i metody: Prospektywne badanie kliniczno-kontrolne pacjentów z cukrzycą typu 2 oraz współistniejącą neuropatią obwodową porównujące osoby przyjmujące metforminę przez okres dłuższy niż 6 miesięcy (N=59) z pacjentami bez ekspozycji na metforminę (N=63). Porównania przeprowadzono w oparciu o badania kliniczne (Toronto Clinical Scoring System, Neuropathy Impairment Score), laboratoryjne (Cbl w surowicy, Hcy na czczo, MMA na czczo), oraz elektrofizjologiczne (badania przewodzenia nerwowego). Wyniki: U pacjentów leczonych metforminą stwierdzono obniżone poziomy Cbl i podwyższone poziomy MMA i Hcy na czczo. Badania kliniczne i elektrofizjologiczne zidentyfikowały ciężką neuropatię obwodową u tych pacjentów; skumulowana dawka metforminy była ściśle skorelowana z tymi różnicami klinicznymi i paraklinicznymi między grupami. Wnioski: Ekspozycja na metforminę może stanowić jatrogenną przyczynę zaostrzenia neuropatii obwodowej u pacjentów z cukrzycą typu 2. Po rozpoczęciu, jak również podczas terapii metforminą należy rozważyć okresowe badania przesiewowe na obecność niedoboru Cbl oraz leczenie systemowe w celu wykrycia potencjalnych drugorzędnych przyczyn pogorszenia stopnia neuropatii obwodowej. Cukrzyca to stale rosnące zaburzenie z szeregiem powikłań układowych, w tym cukrzycową neuropatią obwodową (DPN), która dotyka niemal 50% pacjentów z cukrzycą oraz powoduje zaburzenia czuciowe, motoryczne i/lub autonomiczne 1. Kilka mechanizmów patogenicznych przyczynia się do ciężkości DPN, w tym mikroangiopatia, stres oksydacyjny, szlak przemian poliolowych, zaburzenia czynności mitochondriów, niedobór insuliny, oraz produkty końcowe zaawansowanej glikacji i aktywacja ligandu ich receptora 2-5. Dalej na przebieg i ciężkość DPN ma wpływ szereg stanów współistniejących. Niedobór witaminy B 12 (kobalamina; Cbl) może występować razem z cukrzycą. Pomimo, że przeważnie klasycznie utożsamiana jest z podostrym zwyrodnieniem powrózkowym, wystąpić może wyłącznie manifestacja neuropatii obwodowej (PN), zwykle objawiając się jako neuropatia aksonów w oparciu o badania elektrofizjologiczne i patologię 6-8. Zebrane dowody sugerują, że metabolity związane z Cbl kwas metylomalonowy (MMA) oraz homocysteina (Hcy) są bardziej wrażliwymi (MMA, Hcy) i swoistymi (MMA) wskaźnikami wczesnego objawowego niedoboru Cbl niż samo stężenie Cbl w surowicy 9-10. Metformina, biguanid, jest stale zgłaszana jako farmakologiczna przyczyna niedoboru Cbl 11-13. Mechanizm odpowiedzialny za niedobór jest kontrowersyjny; sugerowane czynniki obejmowały hamowanie lub dezaktywację wchłaniania Cbl, zmiany w stężeniu czynnika wewnętrznego, florze bakteryjnej, motoryce przewodu pokarmowego czy strukturze morfologicznej jelita krętego oraz interakcje z receptorem endocytarnym kubuliny 11, 14-15. W ostatnich czasach wykazano, że biguanidy negatywnie wpływają na aktywność błony jelita krętego uzależnioną od wapna, w tym absorpcję kompleksu Cbl-czynnik wewnętrzny 16. Metformina jest zalecana przez Amerykańskie Towarzystwo Diabetologiczne oraz Europejskie Towarzystwo Badań nad Cukrzycą jako początkowe leczenie cukrzycy typu 2 po rozpoznaniu 17. Pomimo jej szerokiego stosowania i znanych działań mających wpływ na Cbl, metformina nie była poddana badaniom jako potencjalna jatrogenna przyczyna lub czynnik powodujący DPN. Potencjalnie odwracalny skutek w postaci niedoboru kobalaminy może zwiększać obciążenie kliniczne dla populacji pacjentów z DPN, których funkcje czuciowe, chód i równowaga już są często pogorszone. Zaprojektowaliśmy prospektywne badanie kliniczno-kontrolne mające na celu ocenę skutków przedłużonego przyjmowania metforminy u pacjentów z cukrzycą typu 2 dopasowanych pod względem czasu trwania i kontroli nad chorobą. W szczególny sposób przebadaliśmy związek między stosowaniem metforminy, poziomami Cbl i jej metabolitów oraz klinicznymi i elektrofizjologicznymi markerami ciężkości PN. Postawiliśmy hipotezę, po pierwsze, że 2

stosowanie metforminy jest kojarzone z biochemicznymi dowodami niedoboru Cbl (obniżone poziomy Cbl w surowicy, podwyższone MMA i Hcy), oraz, po drugie, że stosowanie metforminy jest kojarzone z cięższym stopniem PN. W badaniu kliniczno-kontrolnym wykazano, że spadki poziomu Cbl uzależnione są od dawki i czasu trwania terapii metforminą 18 ; odkrycie to doprowadziło nas do dalszej hipotezy, że nieprawidłowości w składzie biochemicznym i ciężkości neuropatii są skorelowane z łącznym okresem przyjmowania dawki metforminy do momentu badania. PROJEKT BADAWCZY I METODY: Zatwierdzenie etyczne niniejszego badania otrzymano od Ośrodka Postępów Zdrowotnych Uniwersytetu w Calgary. Od grudnia 2002 r. do maja 2007 r. pacjenci z istniejącą cukrzycą typu 2 oraz pierwotną diagnozą PN zostali poddani ocenie w Klinice Chorób Nerwowo-Mięśniowych na Uniwersytecie w Calgary. Pacjenci ci przeszli dalsze oceny kliniczne, laboratoryjne i elektrofizjologiczne występującej u nich neuropatii. Obecność cukrzycy zweryfikowano w oparciu o dwa odrębne wyniki dodatnie: poprzednie dwa wyniki badania glukozy na czczo wynoszące 7,1 mmol/l (126 mg/ dl) lub dwie próby tolerancji glukozy prowadzące do wyniku stężenia glukozy w surowicy po 2 godzinach w ilości 11,1 mmol/l (200 mg/dl) (na podstawie wytycznych Kanadyjskiego Towarzystwa Diabetologicznego). Zarejestrowano wiek, w którym rozpoznano cukrzycę oraz czas trwania objawów DPN. Udokumentowano, w celu udostępnienia dla innych potencjalnych przyczyn PN, przypadki innych chorób układowych, spożycie alkoholu, narażenie na substancje toksyczne i leki w wywiadzie jak i przypadki neuropatii w rodzinie. Dla każdego pacjenta określono okres leczenia metforminą oraz historię dawkowania poprzez studiowanie ich dokumentacji medycznej, przy czym pacjenci ustnie potwierdzali wysokość dawki; dane te wykorzystano do obliczenia łącznej dawki metforminy przyjmowanej od początku życia w przypadku każdego pacjenta. Odnotowano stosowanie innych leków przeciwcukrzycowych. Wszyscy pacjenci zostali poddani testom laboratoryjnym obejmującym wyniki: morfologii, jonogramu, mocznika, kreatyniny, aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy aspartanowej (AST), gamma-glutamylotranspeptydazy (GGT), fosfatazy alkalicznej (ALP), albuminy, bilirubiny całkowitej, międzynarodowego wskaźnika znormalizowanego (INR), hormonu pobudzającego tarczycę, wskaźnika sedymentacji erytrocytów, przeciwciał przeciwjądrowych, przeciwciał skierowanych przeciwko rozpuszczalnym antygenom jądrowym, elektroforezy białek surowicy, czynnika reumatoidalnego, mleczanu oraz kwasu foliowego w surowicy. U wszystkich pacjentów zmierzono poziom hemoglobiny A1C. Czułość wykrywania gammopatii w naszym ośrodku wynosi 2 g/l metodą elektroforezy białek surowicy, z przeprowadzeniem badania immunofiksacji, gdy wartości najwyższe znajdują się w zakresie 2-4 g/l. U wszystkich pacjentów stężenia Cbl w surowicy określono za pomocą analizatora do analizy immunologicznej Cobas e (Roche Diagnostics), poziomy Hcy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej natomiast poziomy MMA stosując spektrometrię mas. Niższa wartość graniczna dla Cbl w naszym ośrodku wynosi 210 pmol/l (285 pg/ml); limit górny dla Hcy to 13,7 µmol/l (1,85 mg/l) u dorosłych mężczyzn, 9,9 µmol/l (1,34 mg/l) u dorosłych kobiet poniżej 49 lat, oraz 12,8 µmol/l (1,73 mg/l) u kobiet powyżej 49 lat; tutaj przyjęliśmy konserwatywną granicę górną wynoszącą 3,7 µmol/l (1,85 mg/l) dla wszystkich uczestników. Górny limit prawidłowego poziomu MMA w naszym ośrodku to 0,15 µmol/l. Wszystkie badania krwi zostały przeprowadzone przez Calgary Laboratory Services. Pacjentów wykluczano, jeżeli rozpoznano inne niż cukrzyca i niedobór Cbl potencjalne przyczyny PN, jeżeli pacjenci byli uprzednio leczeni metforminą i przerwali terapię, jeżeli okres leczenia metforminą w chwili oceny był krótszy niż sześć miesięcy, w przypadku wystąpienia jedynie upośledzonej tolerancji glukozy lub zachorowania na cukrzycę w wieku młodzieńczym lub wyraźnego zapotrzebowania na insulinę podczas diagnozy (tj. w przypadku możliwej cukrzycy typu 1). Wreszcie, pacjentów wykluczano, jeżeli nie wyrazili zgody na towarzyszące badania elektrofizjologiczne lub laboratoryjne. Nie wykluczaliśmy pacjentów z niewydolnością nerek przyjmujących metforminę, mimo iż stanowi to przeciwwskazanie do stosowania metforminy ze względu potencjalną kwasicę mleczanową; nie mniej jednak wielu pacjentów nie zaprzestaje przyjmowania metforminy po rozpoznaniu niewydolności nerek 19, a poziomy mleczanu u tych pacjentów nie były znaczące. U wszystkich pacjentów z DPN przeprowadzono pełne standardowe badania neurologiczne, w tym napięcia, siły, głębokich odruchów ścięgien, funkcji czuciowych, testu Romberga, chodu i chodu tandemowego. Chód tandemowy rejestrowano jako liczbę kroków stawianych od pięty do palców wzdłuż linii prostej, które pacjent był w stanie wykonać w stosunku do normalnej wartości progowej wynoszącej sześć. Każdy pacjent został poddany ocenie za pomocą Systemu Oceny Klinicznej Toronto (TCSS) 20 przez niezaślepionego badacza przed pozyskaniem wiedzy na temat wyników laboratoryjnych. System TCSS opracowano jako narzędzie przesiewowe do badań klinicznych na obecność i ciężkość DPN, który podkreśla braki w czuciu; chociaż wprowadza pewną subiektywność w ocenie, został zatwierdzony pod względem gęstości włókien nerwu łydkowego. Oceniliśmy także NIS (Neuropathy Impairment Score), skalę oceniającą słabość grup mięśni głowy i szyi, kończyn górnych i kończyn dolnych, funkcje dotykowe, wibracyjne, położenie stawów oraz test nakłucia palców wskazujących i paluchów u stóp oraz odruchy dla każdego pacjenta 21. Ocenę elektrofizjologiczną przeprowadzono po ocenie klinicznej, natomiast przed uzyskaniem dostępu do wyników badań laboratoryjnych za pomocą Dantec Datapoint (Dantec Dynamics Ltd., Bristol, Wielka Brytania). Nerwy czuciowe i motoryczne nie dominujących kończyn górnych i dolnych zbadano w ciągu 3 miesięcy od oceny klinicznej. Badania szybkości przewodzenia nerwów (NCS) wykonano stosując stymulację nerwu pośrodkowego (nagłówek, łokieć), nerwu łokciowego (nadgarstek, poniżej łokcia, powyżej łokcia), nerwów strzałkowych (kostka, położenia powyżej i poniżej główki kości strzałkowej) oraz piszczelowych (kostka, miejsca w okolicy dołu kolanowego). Dla każdego nerwu 3

motorycznego pozyskano lub obliczono motoryczną latencję dystalną, potencjał wywołany z mięśnia w następstwie stymulacji elektrycznej nerwu zaopatrującego ten mięsień oraz szybkość przewodzenia. Latencje fali F pozyskano z nerwów pośrodkowych, łokciowych, strzałkowych oraz piszczelowych. Badania NCS czuciowe przeprowadzono z wykorzystaniem nerwów pośrodkowych (palce 2. i 4.), łokciowych (palce 4. i 5.), gałęzi powierzchownej nerwu promieniowego, gałęzi powierzchownych nerwów strzałkowych i łydkowych, wraz z potencjałem czuciowym nerwu (SNAP), latencją początkową oraz szybkością przewodzenia pozyskaną lub obliczoną. Podczas badania NCS temperatury utrzymano na poziomie <32 C dla kończyn górnych oraz <30 C dla kończyn dolnych. Pomimo, że wszyscy włączeni uczestnicy przeszli badania elektrofizjologiczne, niektórzy uczestnicy nie posiadają pełnych danych dla wszystkich pojedynczych nerwów. Po przeprowadzeniu wszystkich testów klinicznych, elektrofizjologicznych i laboratoryjnych, pacjentom z nieprawidłowymi poziomami Cbl, MMA lub Hcy przypisano miesięczne iniekcje domięśniowe Cbl. Biopsje nerwów łydkowych wykonano jedynie w sytuacjach klinicznych, przy podejrzeniu zapalenia naczyń lub innej poważnej przyczyny PN. Za pomocą testu t niezależnych próbek porównano równoważność między grupami pod względem wieku pacjenta, okresu trwania cukrzycy typu 2, okresu trwania objawów PN, A1C, oraz ekspozycji na alkohol; natomiast płeć i proporcje stosowania innych leków przeciwwcukrzycowych za pomocą testu Chi-kwadrat. Elementy wcześniejszych historii chorób (np. niedokrwistość z powodu niedoboru żelaza, sferocytoza wrodzona) zostały sklasyfikowane w szerokim zakresie (np. choroby hematologiczne) oraz zostały podsumowane w Tabeli 1: nie porównywano ich pod względem statystycznym z powodu ich heterogeniczności. Elementy z wywiadu wyszczególniono w załączniku dostępnym tylko online pod adresem http://diabetes.diabetesjournals.org. Pierwotne punkty końcowe stanowiły poziomy Hcy, MMA i Cbl we krwi, kliniczna ciężkość neuropatii (TCSS, NIS) oraz elektrofizjologiczne markery neuropatii; z tych ostatnich wybraliśmy zbadanie czuciowych NCS w kończynie dolnej (szybkość przewodzenia oraz SNAP dla gałęzi powierzchownych nerwów strzałkowych), ponieważ uznaliśmy, iż będą one najlepiej oddawać zaostrzenie spowodowane niedoborem Cbl. Dane te nie były poddane normalnemu rozkładowi (przez test Shapiro-Wilka), a porównań dokonano za pomocą testu U Mann-Whitney a. Proporcje pacjentów z niedoborem Cbl i zwiększeniem Hcy i MMA porównano za pomocą testu Chi kwadrat. Dwuwymiarowe korelacje zmiennych klinicznych i laboratoryjnych z łączną dawką metforminy obliczono za pomocą testu rho Spearmana. W końcu, wykonano analizę regresji liniowej stosując całkowity wynik NIS jako zmienną zależną oraz wiek, czas trwania cukrzycy, A1C i obecność ekspozycji na metforminę jako zmienne wyjaśniające. WYNIKI Z 226 pacjentów z cukrzycą typu 2 i PN oceniono pod względem kwalifikowalności, 104 pacjentów wyłączono; u 55 ekspozycja na metforminę była zbyt krótka (<6 miesięcy), 46 pacjentów przerwało terapię metforminą przed oceną, natomiast trzy osoby nie były w stanie wykonać badań laboratoryjnych lub elektrofizjologicznych. 122 kwalifikowało się do analizy, z czego 59 osób (48%) było leczonych metforminą od ponad 6 miesięcy (średnia łączna ekspozycja 3389,5 g, V = 2560,6 g); pozostali pacjenci nie byli wcześniej leczeni metforminą. Nie zauważono znaczących różnic w zmiennych demograficznych (wiek, płeć) czy ostrości choroby (czas trwania cukrzycy typu 2, A1C, czas trwania objawów PN) między dwoma grupami (Tabela 1). Znacznie wyższa liczba pacjentów w grupie leczonej metforminą była równocześnie leczonych gliburydem, a znacznie mniej insuliną (Tabela 1). Nie było innych zauważalnych różnic pod względem stosowania przypisanych leków, obecności innych chorób układowych czy ekspozycji na alkohol między grupami (Tabela 1; szczegółowe dane dostępne są tylko w załączniku online). Analizę badań laboratoryjnych podsumowano w Tabeli 2. Średnie wartości Cbl w surowicy były znacznie niższe grupie leczonej metforminą (231 vs. 486 pmol/l; U=299,0; p<0,001) z wyraźnym niedoborem u 18 pacjentów (31%) w porównaniu z 2 (3%) w grupie nieleczonej metforminą (p<0,001). Łączna dawka metforminy była odwrotnie skorelowana z Cbl w surowicy (Spearman rho = -0,41; test podwójnie odwrócony p=0,001). Mediana Hcy w surowicy na czczo była znacznie wyższa w grupie leczonej metforminą (11,6 vs. 8,4 µmol/l; U=454,0; p<0,001) wraz ze zwiększeniem Hcy u 15 vs. 1 pacjent (p<0,001). Mediana MMA była znacząco wyższa w grupie leczonej metforminą (0,18 vs. 0,11 µmol/l; U=306,5; p<0,001) oraz zwiększona u 43 z tych pacjentów w porównaniu do 7 pacjentów bez ekspozycji na metforminę (p<0,001). Łączna dawka metforminy była dodatnio skorelowana z Cbl w surowicy na czczo (rho Spearmana = 0,50; test podwójnie odwrócony p<0,001) oraz MMA w surowicy na czczo (rho Spearmana = 0,37; test podwójnie odwrócony p=0,005) (Rycina 1 ). Markery kliniczne i parakliniczne ciężkości neuropatii podsumowano w Tabeli 2. Średni całkowity wynik TCSS był wyższy w grupie leczonej metforminą (10 vs. 5; U=527,0; p<0,001), z silną dodatnią korelacją do wzrastającej dawki łącznej metforminy (rho Spearmana = 0,80; test podwójnie odwrócony p<0,001). Średni całkowity wynik NIS był znacznie wyższy w grupie leczonej metforminą (10 vs. 4; U=408,0; p<0,001) i również z silną dodatnią korelacją do wzrastającej dawki łącznej metforminy (Spearman rho = 0,79; test podwójnie odwrócony p<0,001, Rycina 1). W przypadku nerwu łydkowego lewego (leczeni metforminą N=41; nieleczeni metforminą N=51) oraz powierzchownego nerwu strzałkowego (leczeni metf. N=39; nie leczeni metforminą N=49) wystąpił niższy średni SNAP i wolniejsze średnie przewodzenie w grupie leczonej metforminą; jakkolwiek, pomiary te nie odbiegały od siebie znacząco między grupami po skorygowaniu porównań wielokrotnych (Tabela 2). W analizie regresji liniowej, wykorzystując metodę Enter, wyłonił się istotny model (F4,117 = 47,7, p<0,005) ze skorygowanym R2=,61. Ekspozycja na metforminę (ß=,55, p<0,001) oraz czas trwania cukrzycy (ß =,41, p<0,001) stanowiły w tym modelu jedyne znaczące zmienne wyjaśniające. Diagnostyka kolinearności nie sugerowała problemu z multikolinearnością w tym modelu (VIF<1,5 dla wszystkich włączonych zmiennych). 4

Tabela 1: Charakterystyka pacjentów Charakterystyka Zmienne demograficzne Leczeni metforminą (N = 59) Nieleczeni metforminą (N = 63) Wiek (l) 66,6 +/- 11,9 64,8 +/- 12,0 NS Płeć żeńska (%) 24 (41%) 29 (46%) NS Ostrość choroby Czas trwania cukrzycy (l) 5,5 +/- 3,3 4,7 +/- 2,9 NS Czas trwania objawów neuropatii obwodowej (l) 3,8 +/- 2,1 3,8 +/- 2,4 NS A1C (%) 6,7 +/- 1,0 6,8 +/- 1,1 NS Inna farmakoterapia cukrzycowa Wartość P Stosowanie gliburydu (n(%)) 38 (64%) 22 (35%) <0,001* Stosowanie glikazydu (n(%)) 18 (31%) 15 (24%) NS Terapia insulinowa (n(%)) 7 (12%) 29 (46%) <0,001* Wywiad kliniczny Ekspozycja na alkohol (drinki/tydzień) 3,0 +/- 4,5 2,2 +/- 4,0 NS Krewni 1. stopnia z PN w wywiadzie 4 (5%) 0 Choroby reumatologiczne (ch. zwyrodnieniowa stawów lub zapalenie stawów (%) 7 (12%) 4 (6%) Podwyższona kreatynina z niewydolnością nerek (%) 6 (10%) 7 (11%) Choroba tarczycy 11 (19%) 16 (25%) Choroba hematologiczna (%) 5 (8%) 0 Rak (%) 7 (12%) 7 (11%) Inne choroby (%) 42 (71%) 29 (46%) A1C: hemoglobina A1C; NS: nieistotny na poziomie alfa = 0,05 Prezentowane wartości oznaczają średnie odchylenie standardowe +/- *Istotny na poziomie alfa = 0,05 dla testu Chi-kwadrat Rycina 1: Analiza współzależności. Korelacja między łączną dawką metforminy w życiu z kobalaminą w surowicy (A), homocysteiną na czczo (B), kwasem metylomalonowym (C), całkowitym wynikiem TCSS (D) i całkowitym wynikiem NIS (E). Każdy punkt oznacza osobę. Współczynnikami korelacji (rho Spearmana) były: kobalamina, -0,41; P=0,001; homocysteina, 0,50; P<0,001; kwas metylomalonowy, 0,37; P=0,005; całkowity wynik TCSS, 0,80; P<0,001; całkowity wynik NIS, 0,79; P<0,001. Linie przerywane wskazują na niższy limit prawidłowy (kobalamina) i wyższe limity prawidłowe (homocysteina, kwas metylomalonowy) dla naszego ośrodka. 5

Tabela 2 Markery niedoboru Cbl i ciężkości neuropatii Marker Biochemiczne markery niedoboru kobalaminy Leczeni metforminą (N = 59) Nieleczeni metforminą (N = 63) Wartość P Korelacja z łączną dawką metforminy Wartość P Cbl w surowicy (pmol/l) 231 [343] 486 [863] <0,001* -0,41 0,001** niedobór Cbl (< 210 pmol/l) 18 (31%) 2 (3%) <0,001* Hcy w surowicy na czczo (µmol/l) 11,6 [17,7] 8,4 [24,9] <0,001* 0,50 <0,001** Wzrost Hcy (>13,7 µmol/l) 15 (25%) 1 (2%) <0,001* MMA w surowicy na czczo (µmol/l) 0,18 [0,47] 0,11 [0,14] <0,001* 0,37 0,005** Wzrost MMA (>0,15 µmol/l) 43 (73%) 7 (11%) <0,001* Kliniczne markery ciężkości neuropatii Całkowity wynik TCSS 10 [17] 5 [12] <0,001* 0,80 <0,001** Całkowity wynik NIS 10 [32] 4 [12] <0,001* 0,79 <0,001** Elektrofizjologiczne markery ciężkości neuropatii Lewy nerw łydkowy Amplituda SNAP (µv) 3,0 [11,4] 4,4 [12,9] 0,038 Szybkość przewodzenia sensorycznego lewego nerwu łydkowego (m/s) Amplituda SNAP lewego powierzchownego nerwu strzałkowego (µv) Szybkość przewodzenia sensorycznego lewego powierzchownego nerwu strzałkowego (m/s) 33,3 [15,0] 33,0 [15,7] 0,69 2,5 [7,1] 3,6 [7,8] 0,12 34,2 [18,4] 36,8 [18,8] 0,071 Cbl: kobalamina; Hcy: homocysteina; MMA: kwas metylomalonowy; TCSS: skala Toronto Clinical Scoring System; NIS: skala Neuropathy Impairment Score; SNAP: potencjał czuciowy nerwu; Przedstawione wartości oznaczają medianę [zakres] *Istotny na poziomie skorygowanym Bonferroni alfa = 0,05 (markery niedoboru kobalaminy: alfa = 0,0083; markery ciężkości neuropatii: alfa = 0,0083) z zastosowaniem testu U Mann-Whitney a 0 Istotny na poziomie skorygowanym Bonferroni alfa = 0,05 (markery niedoboru kobalaminy: alfa =0,0083) z zastosowaniem dokładnego testu Fisher a **Współczynnik korelacji podwójnie odwrócony na poziomie skorygowanym Bonferroni alfa = 0,05 (alfa = 0,01) za pomocą testu rho Spearmana WNIOSKI: Znaleźliśmy dowody na to, że u pacjentów z cukrzycą typu 2, PN oraz ponad 6-cio miesięczną ekspozycją na metforminę występowały niższe poziomy Cbl w surowicy, wyższe poziomy Hcy i MMA w surowicy oraz wyższe wyniki w badaniach NIS i TCSS wskazując na cięższą klinicznie postać PN w porównaniu do podobnych pacjentów bez ekspozycji na metforminę. Nieprawidłowości te było mocno skorelowane z łączną ekspozycją na metforminę. Analiza regresji liniowej obejmująca wiek, czas trwania cukrzycy, A1C i ekspozycję na metforminę celem prognozy stanu klinicznego (całkowity wynik NIS), pokazała, że ekspozycja na metforminę jak i czas trwania cukrzycy stanowiły znaczące zmienne wyjaśniające. Nie byliśmy w stanie wykazać znaczących różnic między grupami pod względem SNAP nerwów łydkowych czy powierzchownych strzałkowych, czy też szybkości przewodzenia. Niedobór Cbl kojarzony z metforminą może przyczyniać się do obciążenia klinicznego DPN; możliwy do poprawienia. Niedobór ten oraz towarzyszący wzrost Hcy w surowicy zademonstrowano w randomizowanym badaniu z grupą kontrolną 22, a związek ten uzależniony jest od dawki uzależniony jest od dawki i długości okresu leczenia metforminą (18); aczkolwiek rzadko omawiano potencjalne następstwa kliniczne 11, 16 i nie zostały one uprzednio oficjalnie zbadane. Zatem obecne odkrycia posiadają istotną wagę dla dotychczasowego piśmiennictwa na temat niedoboru Cbl związanego z metforminą. Biorąc pod uwagę występowanie cukrzycy typu 2 oraz stosowanie metforminy, skutki te będą się potencjalnie rozprzestrzeniać. Bieżące odkrycia nie powinny zniechęcać do leczenia metforminą pacjentów z cukrzycą i upośledzeniem neurologicznym; w dodatku do jej działania kontrolującego metabolizm, wykazano, że metformina wywiera korzystny wpływ na tworzenie końcowych produktów zaawansowanej glikacji w nerwach obwodowych 23 oraz może zapobiegać apoptozie pojawiającej się w procesach neurodegeneracji 24. Zamiast tego, zalecamy badania przesiewowe pod kątem objawów niedoboru Cbl u pacjentów z cukrzycą przyjmujących długotrwałe leczenie metforminą. Amerykańska Akademia Neurologii zaleca badania poziomu Cbl i metabolitów (MMA z lub bez Hcy) w surowicy jako testy o wysokim znaczeniu diagnostycznym w dystalnej polineuropatii symetrycznej 10 ; znaczenie to może być jeszcze większe w obecnej 6

populacji zważając na jej skłonność do występowania współistniejącego niedoboru Cbl. Pozostaje do określenia optymalna częstotliwość badań przesiewowych, lecz podstawowe testy przy rozpoczęciu terapii metforminą oraz w odstępach nie mniejszych niż 1-2 lata wydają się być rozsądnym rozwiązaniem, gdyż działanie metforminy obniżające poziomy Cbl w surowicy może wystąpić nawet po okresie tak krótkim jak trzy miesiące 15. Nie jest jasne, czy suplementacja Cbl będzie zapobiegać pogorszeniu stanu klinicznego w tej grupie, jednak niesie ona ze sobą niskie ryzyko toksyczności. Obecna terapia składa się z leczenia zastępczego iniekcjami domięśniowymi Cbl oraz możliwego długoterminowego leczenia kobalaminą i kwasem foliowym; doustna suplementacja Cbl może być równie skuteczna, co terapia domięśniowa, jednak nie zbadano jeszcze długookresowych wyników u pacjentów z DPN 25. Doustna suplementacja wapnem była także skuteczna w odwracaniu niedoboru biodostępnej Cbl u pacjentów leczonych metforminą 16. Dalsze badania powinny lepiej zdefiniować różnice w profilu elektrofizjologicznym tych grup. Potencjalne powikłania ośrodkowego układu nerwowego wskutek niedoboru Cbl, w tym mielopatia i upośledzenie kognitywne, należy rozważyć jako czynniki przyczyniające się do stanu klinicznego. Związek między niedoborem Cbl, podniesionymi poziomami Hcy i MMA oraz PN jest kontrowersyjny i należy go udowodnić, lecz zarówno niedobór Cbl jak i podwyższone poziomy jej metabolitów w surowicy są kojarzone z obecnością sensoryczno-motorycznej PN 7. Nasze ustalenia są przedstawione z pewnymi ograniczeniami. Pomimo, że zidentyfikowaliśmy pacjentów prospektywnie, nie zostali oni losowo wybrani z populacji chorych na cukrzycę typu 2 z DPN lub bez. Nasz rozmiar próby nie był oparty na wcześniej określonej analizie mocy. Nie dokonaliśmy identyfikacji odrębnej grupy pacjentów z bezobjawową DPN. Wyłączyliśmy pacjentów z cukrzycą typu 1 ze względu na oczekiwaną ograniczoną ekspozycję na metforminę oraz potencjalnie wyraźne mechanizmy patofizjologiczne. Pomimo, że poziom A1C nie różnił się znacznie między grupami w czasie ewaluacji, nie zbadaliśmy środków kontroli metabolicznej z upływem czasu. Badacze zostali zaślepieni jeśli chodzi o wyniki badan laboratoryjnych aż do zakończenia badań klinicznych i elektrofizjologicznych, lecz nie jeśli chodzi o stosowanie leczenia metforminą. Pacjenci leczeni metforminą byli częściej poddani terapii gliburydem, a rzadziej terapią insulinową; insulina może przynosić korzyści u pacjentów z cukrzycą i PN z powodu mechanizmów innych niż korekcja glikemiczna 3. Obecne mogą pozostawać także niewykryte różnice między grupami; dodatkowe czynniki takie jak niewystarczająca zawartość w diecie mogą częściowo tłumaczyć niskie poziomy Cbl u naszych pacjentów leczonych metforminą oraz możliwe, że u pacjentów przyjmujących metforminę może występować cięższa postać cukrzycy pomimo podobnego okresu przebiegu cukrzycy typu 2 i podobnych poziomów A1C w obu grupach. U wszystkich uczestników poziom kwasu foliowego był prawidłowy, lecz nie dokonano pomiaru pirydoksyny. Testy laboratoryjne w kierunku niedokrwistości złośliwej (za pomocą testu Schillinga) nie były dostępne podczas tego badania, a zatem występowanie tej alternatywnej przyczyny niedoboru Cbl w naszej populacji nie jest znane. Naszą analizę regresji wielorakiej należy interpretować ostrożnie, gdyż nie wszystkie zmienne potencjalnie istotne dla całkowitego wyniku NIS zostały zmierzone w naszej populacji, a nasi uczestnicy zostali przypisani do grup w sposób nielosowy. Bieżące ustalenia sugerują związek między metforminą, podwyższonymi metabolitami Cbl i zaostrzeniem DPN, lecz konieczne są dalsze prace celem udowodnienia bezpośredniego związku przyczynowego i jego mechanizmu. Metformina może przyczyniać się do zaostrzenia PN z powodu innych nieznanych mechanizmów; dalsze badania patogenezy DPN powinny koniecznie skupiać się na jasnym zrozumieniu jej roli. Pomimo wymienionych ograniczeń, uważamy, że ekspozycja na metforminę stanowi potencjalny czynnik jatrogenny powodujący zaostrzenie PN w opisywanej populacji. Rozpoznanie tego gotowego do identyfikacji i potencjalnie uleczalnego komponentu choroby może polepszyć jakość życia tej jakże dużej populacji pacjentów z cukrzycą. PODZIĘKOWANIA Dr. Cory Toth otrzymuje środki pieniężne od fundacji Alberta Heritage Medical Research Foundation (badania powikłań cukrzycowych dotyczących układu nerwowego). Fundacja ta nie ma wpływu na projekt, prowadzenie badania, gromadzenie danych, zarządzanie, analizę czy interpretację danych, przeglądu czy zatwierdzenie manuskryptu. UJAWNIANIE Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych praw konkurencyjnych. 7

PIŚMIENNICTWO 1. Boulton AJ, Vinik AI, Arezzo JC, Bril V, Feldman EL, Freeman R, Malik RA, Maser RE, Sosenko JM, Ziegler, D. Diabetic neuropathies: a statement by the American Diabetes Association. Diabetes Care 28(4):956-962, 2005 2. Huang TJ, Price SA, Chilton L, Calcutt NA, Tomlinson DR, Verkhratsky A, Fernyhough P. Insulin prevents depolarization of the mitochondrial inner membrane in sensory neurons of type 1 diabetic rats in the presence of sustained hyperglycemia. Diabetes 52(8):2129-2136, 2003 3. Toth C, Brussee V, Zochodne DW. Remote neurotrophic support of epidermal nerve fibres in experimental diabetes. Diabetologia 49(5):1081-1088, 2006 4. Toth C, Rong LL, Yang C, Martinez J, Song F, Ramji N, Brussee V, Liu W, Durand J, Nguyen MD, Schmidt AM, Zochodne DW. Receptor for advanced glycation end products (RAGEs) and experimental diabetic neuropathy. Diabetes 57(4):1002-1017, 2008 5. Zochodne DW. Diabetic polyneuropathy: an update. Curr Opin Neurol 21(5):527-533, 2008 6. Healton EB, Savage DG, Brust JC, Garrett TJ, Lindenbaum J. Neurologic aspects of cobalamin deficiency. Medicine (Baltimore) 70(4):229-245, 1991 7. Saperstein DS, Wolfe GI, Gronseth GS, Nations SP, Herbelin LL, Bryan WW, Barohn RJ. Challenges in the identification of cobalamin-deficiency polyneuropathy. Arch Neurol 60(9):1296-1301, 2003 8. Fine EJ, Soria E, Paroski MW, Petryk D, Thomasula L. The neurophysiological profile of vitamin B 12 deficiency. Muscle Nerve 13(2):158-164, 1990 9. Kumar N. Nutritional neuropathies. Neurol Clin 25(1):209-255, 2007 10. England JD, Gronseth GS, Franklin G, Carter GT, Kinsella LJ, Cohen JA, Asbury AK, Szigeti K, Lupski JR, Latov N, Lewis RA, Low PA, Fisher MA, Herrmann DN, Howard JF Jr, Lauria G, Miller RG, Polydefkis M, Sumner AJ. Practice Parameter: Evaluation of distal symmetric polyneuropathy: Role of laboratory and genetic testing (an evidence-based review). Neurology 72(1): 1-8, 2009 11. Tomkin GH, Hadden DR, Weaver JA, Montgomery DAD. Vitamin-B 12 status of patients on long-term metformin therapy. BMJ 2(5763):685-687, 1971 12. Gilligan MA. Metformin and vitamin B 12 deficiency. Arch Int Med 162(4):484-485, 2002 13. Liu KW, Dai LK, Jean W. Metformin-related vitamin B 12 deficiency. Age Ageing 35(2):200-201, 2006 14. Caspary WF, Zavada I, Reimold W, Deuticke U, Emrich D, Willms B. Alteration of bile acid metabolism and vitamin- B 12 -absorption in diabetics on biguanides. Diabetologia 13(3):187-193, 1977 15. Buvat DR. Use of metformin is a cause of vitamin B 12 deficiency. Am Fam Physician 69(2):264, 2004 16. Bauman WA, Shaw S, Jayatilleke E, Spungen AM, Herbert V. Increased intake of calcium reverses vitamin B 12 malabsorption induced by metformin. Diabetes Care 23(9):1227-1231, 2000 17. Nathan DM, Buse JB, Davidson MB, Heine RJ, Holman RR, Sherwin R, Zinman B. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy: a consensus statement from the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes. Diabetes Care 29(8): 1963-1972, 2006 18. Ting RZW, Szeto CC, Chan MHM, Ma KK, Chow KM. Risk factors of vitamin B 12 deficiency in patients receiving metformin. Arch Int Med 166(18):1975 1979, 2006 19. Emslie-Smith AM, Boyle DI, Evans JM, Sullivan F, Morris AD; DARTS/MEMO Collaboration. Contraindications to metformin therapy in patients with Type 2 diabetes--a population-based study of adherence to prescribing guidelines. Diabet Med 18(6):483-488, 2001 20. Bril V, Perkins BA. Validation of the Toronto Clinical Scoring System for diabetic polyneuropathy. Diabetes Care 25(11):2048-2052, 2002 21. Dyck PJ, Litchy WJ, Lehman KA, Hokanson JL, Low PA, O Brien PC. Variables influencing neuropathic endpoints: the Rochester Diabetic Neuropathy Study of Healthy Subjects. Neurology 45(6):1115 1121, 1995 22. Wulffelé MG, Kooy A, Lehert P, Bets D, Ogterop JC, Borger van der Burg B, Donker AJ, Stehouwer CD. Effects of shortterm treatment with metformin on serum concentrations of homocysteine folate and vitamin B 12 in type 2 diabetes mellitus: a randomized placebo-controlled trial. J Int Med 254(5):455 463, 2003 23. Tanaka Y, Uchino H, Shimizu T, Yoshii H, Niwa M, Ohmura C, Mitsuhashi N, Onuma T, Kawamori R. Effect of metformin on advanced glycation endproduct formation and peripheral nerve function in streptozotocin-induced diabetic rats. Eur J Pharmacol 376(1-2):17-22, 1999 24. El-Mir MY, Detaille D, R-Villanueva G, Delgado-Esteban M, Guigas B, Attia S, Fontaine E, Almeida A, Leverve X. Neuroprotective role of antidiabetic drug metformin against apoptotic cell death in primary cortical neurons. J Mol Neurosci 34(1):77-87, 2008 25. Butler CC, Vidal-Alaball J, Cannings-John R, McCaddon A, Hood K, Papaioannou A, Mcdowell I, Goringe A. Oral vitamin B 12 versus intramuscular vitamin B 12 for vitamin B 12 deficiency: a systematic review of randomized controlled trials. Fam Pract 23(3):279-285, 2006 8