Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l w przechowywanych koncentratach erytrocytarnych i płytkowych

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 85 93 PATRYCJA ŁOPACZ 1, AGNIESZKA WRÓBEL 1, JADWIGA SAK-BUDZISZ 1, ELŻBIETA LACHERT 2, KRYSTYNA MAŚLANKA 1, EWA BROJER 1 Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l w przechowywanych koncentratach erytrocytarnych i płytkowych Evaluation of the concentration of IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α and scd40l cytokines in stored erythrocyte and platelet concentrates 1 Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologiczej IHiT w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab.n.med. Ewa Brojer 2 Zakład Zapewnienia Jakości i Organizacji Służby Krwi IHiT w Warszawie Kierownik: Dr Elżbieta Lachert STRESZCZENIE Głównym źródłem cytokin biorących udział w powstawaniu gorączkowych niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych są leukocyty. W obecnej pracy oceniono stężenia cytokin: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l w supernatantach otrzymanych z przechowywanych: koncentratów krwinek czerwonych (KKCz), ubogoleukocytarnych koncentratów krwinek czerwonych (UKKCz), koncentratów krwinek płytkowych z aferezy (KKP-Af.), w świeżo mrożonym osoczu (FFP) oraz w osoczu zdrowych osób (kontrola/norma). Cytokiny badano we wszystkich składnikach krwi: w dniu ich preparatyki (dzień 0), a następnie w KKCz i UKKCz raz w tygodniu, aż do 42 dnia, a w KKP-Af. każdego dnia, aż do 6 dnia ich przechowywania. KKCz i UKKCz przechowywano w temperaturze 4 o C, a KKP w temperaturze 20 22 o C. W osoczu zdrowych osób, w dniu pobrania krwi, stwierdzono następujące stężenia badanych cytokin: scd40l 645,9 pg/ml, IL-8 9,1 pg/ml, a IL-1β 1,0 pg/ml. W dniu preparatyki poszczególnych składników krwi stężenia tych cytokin mieściły się w granicach normy. W ostatnim dniu ważności składników krwi, w porównaniu do stężenia badanych cytokin w dniu pobrania krwi stwierdzono: a) w KKCz 10-krotny wzrost stężenia IL-1β (p=0,006), 2,5-krotny wzrost scd40l (p=0,295) i prawie 3-krotny wzrost IL-8 (p=0,002), b) w KKP-Af. - 5-krotny wzrost stężenia scd40l (p=0,002) i 3-krotny wzrost IL-8 (p=0,002). W UKKCz i FFP stężenia IL-1β, IL-8 i scd40l przez cały okres przechowywania były w granicach normy. U żadnej z osób zdrowych ani w żadnym z przechowywanych składników krwi nie wykryto IL-6 i TNFα, a dodatkowo w KKP-Af. nie wykrywano także IL-1β. Podwyższone stężenia niektórych cytokin w długo przechowywanych składnikach krwi mogą być rozważane jako potencjalna przyczyna niehemolitycznych odczynów poprzetoczeniowych. SŁOWA KLUCZOWE: IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, scd40l Przechowywane składniki krwi SUMMARY Leukocytes are the main source of cytokines responsible for febrile non-haemolytic transfusion reactions. The aim of our study was evaluation of the concentration of cytokines: IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α and scd40l in stored blood components. Cytokines were measured in the supernatants from stored: packed red blood cells (RBCs), leucoreduced RBCs (L- RBCs), apheresis platelet concentrates (PCs Aph.) and in fresh frozen plasma (FFP). Plasma samples from random donors were used as a control. The samples from all the units were analysed on collection day (Day 0) and next in RBCs and L-RBCs once a week until Day 42 and in PCs Aph. every day until Day 6. RBCs components were stored at 4 o C and platelet concentrates at 20-22 o C. On the day of collection the concentrations of cytokines in control donor plasma samples were as follows: scd40l 645.9 pg/ml, IL-8 9.1 pg/ml, a IL-1β 1.0 pg/ml. On the Day 0 the concentrations of those cytokines in blood components were within the limits for control plasma. On the last day of storage the following concentrations were determined comparing to storage Day 0: a) for RBCs a 10 fold higher concentration of IL-1β (p=0,006), a 2.5 fold

86 P. ŁOPACZ i wsp. higher concentration of scd40l (p=0,295), a 3 fold higher concentration of IL-8 (p=0,002), b) for PCsAph. a 5 fold higher concentration of scd40l (p=0,002) and a 3 fold higher concentration of IL-8 (p=0,002). For stored L-RBCs the IL-1β, IL-8 and scd40l cytokine concentrations were within the limits for control plasma. No IL-6 and TNF-α were found in any of donor samples and in any of stored blood components. Additionally, IL-1β in PCs Aph. was also not found. The higher concentrations of some cytokines in stored blood components may be considered a likely cause of nonhaemolytic transfusion reactions. KEY WORDS: IL-1β IL-6 IL-8 TNF-α scd40l Stored blood components WPROWADZENIE Udział rozpuszczalnych bioaktywnych związków, takich jak cytokiny, w powstawaniu gorączkowych niehemolitycznych odczynów po przetoczeniu składników krwi jest dobrze znany [1, 2, 3, 4]. Głównym źródłem prozapalnych cytokin, między innymi interleukin (IL) IL-1α, IL-1β, IL-6, czynnika martwicy nowotworu TNF-α (ang. Tumor Necrosis Factor) są zaktywowane leukocyty, a zwłaszcza monocyty. Cytokiny mogą być uwalniane zarówno przez leukocyty biorcy, jak i przez leukocyty dawcy obecne w przetaczanej krwi. Świadczą o tym między innymi badania Shanwell i wsp. [5], którzy wykazali, że przechowywanie ubogoleukocytarnych składników krwi znacznie ogranicza ilość uwalnianych cytokin. W ostatnich latach problem obecności cytokin w przetaczanych składnikach krwi znalazł się w centrum zainteresowania w związku z badaniami dotyczącymi wyjaśnienia patogenezy TRALI (ang. Transfusion Related Acute Lung Injury). Wykazano, że istotną rolę w patogenezie tego odczynu odgrywają nie tylko przeciwciała antyleukocytarne obecne w przetaczanej krwi lub w krążeniu chorego, ale też bioaktywne lipidy i cytokiny [6]. Bardzo ważny jest stan kliniczny chorego, ponieważ zaobserwowano, że odczyny przebiegające z dusznością, w tym TRALI występują częściej u chorych w stanie krytycznym [7]. Obecnie wiadomo, że w patogenezie TRALI, głównymi komórkami efektorowymi są neutrofile. Stąd zainteresowanie badaczy nie tylko cytokinami prozapalnymi, ale także chemokinami takimi jak IL-8, które ułatwiają przemieszczanie się neutrofili do śródbłonka naczyń włosowatych płuc [8]. Badania in vitro Sillimana i wsp. [9] wykazały pobudzenie neutrofili i ich aktywację, która prowadzi do produkcji reaktywnych form tlenu uszkadzających naczynia włosowate płuc, co w efekcie przecieku płynów ustrojowych może powodować obrzęk płuc główny objaw kliniczny zespołu TRALI. Przypuszcza się, że w patogenezie TRALI istotną rolę może odgrywać glikoproteina CD40 obecna na powierzchni komórek śródbłonka, monocytów i makrofagów. Ligand dla tej glikoproteiny (CD40L), pochodzący z płytek krwi, jest czynnikiem prozapalnym i znajduje się w przetaczanych składnikach krwi w formie rozpuszczalnej (scd40l) [10]. W piśmiennictwie spotyka się prace, które podają różne stężenia cytokin takich jak IL-1β, IL-6, IL- 8, TNF-α i scd40l w przechowywanych składnikach krwi [11, 12, 13, 14, 15, 16]. Celem obecnej pracy była analiza stężeń w/w cytokin w koncentratach krwinek czerwonych i płytkowych, otrzymanych i przechowywanych zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami [17, 18]. MATERIAŁ Badania stężenia cytokin przeprowadzono w następujących składnikach krwi: a) 3 koncentratach krwinek czerwonych (KKCz) z kożuszkiem leukocytarno-płytkowym, otrzymanych metodą manualną z pełnej krwi, pobranej do pojemnika z roztworem konserwującym CPDA-1, b) 3 ubogoleukocytarnych koncentratach krwinek czerwonych (UKKCz), otrzymanych metodą automatyczną w systemie Atreus i przechowywanych w roztworze wzbogacającym SAGM, c) 3 koncentratach krwinek płytkowych otrzymanych metodą aferezy (KKP-Af.) (Cobe Trima),

Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l 87 d) 10 jednostkach świeżo mrożonego osocza (FFP ang. fresh frozen plasma) uzyskanego po odwirowaniu krwi pełnej i usunięciu kożuszka leukocytarno-płytkowego, e) w osoczu 21 zdrowych osób (badanie kontrolne/norma). Badane składniki krwi pochodziły od zdrowych dawców krwi i były otrzymane zgodnie z obowiązującymi w Polsce procedurami [17, 18]. Liczba leukocytów i krwinek płytkowych w składnikach krwi była oceniana w analizatorze hematologicznym Sysmex K-4500. Wszystkie składniki krwi były badane w dniu pobrania krwi (dzień 0) i przez cały okres ich ważności. Próbki krwi z KKCZ i UKKCz badano co tydzień aż do 42 dnia, a KKP codziennie, aż do 6 dnia. KKCz i UKKCz przechowywano w temperaturze 4 o C, a KKP w temperaturze 20 22 o C w inkubatorze do przechowywania płytek z ciągłym mieszaniem. METODY Badania cytokin, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l, wykonano w supernatantach otrzymanych poprzez odwirowanie 2 ml danego składnika krwi przy 600 g przez 30 min. Stężenia cytokin badano techniką ELISA przy użyciu gotowych zestawów firmowych (Bender MedSystems GmbH, Wiedeń, Austria). Ogólna zasada metody. Badania wykonywano na 96-dołkowej płytce plastikowej, opłaszczonej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko oznaczanej ludzkiej cytokinie. Po dodaniu badanej próbki (lub standardu danej cytokiny), powstawał kompleks oznaczanej cytokiny z wiążącym ją przeciwciałem monoklonalnym. Następnie dodawano kolejne przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko badanej cytokinie, sprzężone z biotyną. Po 2-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano streptawidynę sprzężoną z enzymem peroksydazą chrzanową HRP (ang. horse radish peroxidase), inkubowano 60 minut w temperaturze pokojowej i dodawano substrat dla HRP (TMB ang. tetramethyl-benzidine). Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej reakcję enzymatyczną zatrzymywano poprzez dodanie 1M kwasu fosforowego. Ekstynkcję próbki mierzono w spektrofotometrze przy długości fali 450 nm i referencyjnej 620 nm. Wyniki badań opracowywano przy użyciu programu komputerowego GEN 5 (BioTek), który wykreślał krzywe standardowe na podstawie 7 rozcieńczeń standardów oznaczanej cytokiny. Stężenia cytokin w pg/ml odczytywano z wykreślonej krzywej. OBLICZENIA STATYSTYCZNE Dane wyrażono jako wartości średnie wyliczone z pomiarów dokonanych w 3 jednostkach KKCz, UKKCz i KKP-Af. w poszczególnych dniach badania. Różnicę statystyczną pomiędzy stężeniami cytokin w dniu pobrania krwi i ostatnim dniem przechowywania danego składnika krwi oceniono obliczając współczynnik regresji liniowej. Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie. WYNIKI Średnie stężenia poszczególnych cytokin w osoczu zdrowych osób (Tabela 1) przyjęto jako badanie kontrolne/normę. Stanowiły one podstawę do porównania ze stężeniem cytokin w przechowywanych składnikach krwi. W osoczu zdrowych osób najwyższe było stężenie scd40l 645,9 pg/ml. Średnie stężenie IL-8 wynosiło 9,1 pg/ml, a IL-1β 1,0 pg/ml. U żadnej z badanych osób nie wykryto IL-6 i TNF-α. W świeżo mrożonym osoczu (Tabela 2) stężenia IL-1β, IL-8 i scd40l nie różniły się od stężenia tych cytokin w osoczu kontrolnym. Nie wykryto w nim też IL-6 i TNF-α. Obu tych cytokin nie wykrywano także w żadnym badanym składniku krwi w ciągu całego okresu przechowywania.

88 P. ŁOPACZ i wsp. Tabela 1. Poziom cytokin w osoczu zdrowych dawców krwi. Table 1. Cytokine level in healthy donors plasma. Cytokina Stężenie cytokiny (pg/ml) średnia ± odchylenie standardowe Zakres wartości (pg/ml) minimalna/maksymalna IL-1β 1,0 ± 0,9 0 / 2,4 IL-6 0 0 IL-8 9,1 ± 2,5 2,3 / 14,3 TNF-α 0 0 scd40l 645,9 ± 659,9 0 / 2464,0 Tabela 2. Poziom cytokin w osoczu świeżo mrożonym (FFP). Table 2. Cytokine level in fresh frozen plasma. Cytokina Ilość cytokiny (pg/ml) Średnia ± odchylenie standardowe Zakres wartości (pg/ml) minimalna/maksymalna IL-1β 0,6 ± 0,8 0 / 1,8 IL-6 0 0 IL-8 9,1 ± 1,9 5,5 / 11,3 TNF-α 0 0 SCD40L 495,3 ± 576,9 0 / 1654,0 12 10 IL-1beta (pg/ml) 8 6 4 KKCz UKKCz 2 0 0 7 14 21 28 35 42 dni Ryc. 1. Średnie stężenie IL-1β (pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi Fig. 1. Average concentration of IL-1β (pg/ml) in stored blood components (linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób) Na rycinie 1 przedstawiono średnie stężenie IL-1β w obu rodzajach KKCz. W dniu pobrania KKCz i UKKCz nie wykrywano tej cytokiny, ale po 7 dniach przechowywania tych składników krwi stężenie IL-1β zaczęło wzrastać i osiągnęło poziom podobny jak w osoczu kontrolnym. W UKKCz stężenie IL-1β pozostawało na poziomie kontroli do końca przechowywania. W KKCz natomiast od 28 dnia przechowywania obserwowano gwałtowny wzrost stężenia IL-1β, a w 42 dniu badania stężenie tej cytokiny było 10-krotnie wyższe (9,7 pg/ml) niż w dniu 0 (p=0,006). W KKP-Af. nie wykrywano IL-1β w ciągu całego okresu przechowywania.

Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l 89 70 60 50 IL-8 (pg/ml) 40 30 KKCZ UKKCZ KKP-Af. 20 10 0 0 7 14 21 28 35 42 dni Ryc. 2. Średnie stężenie IL-8 (pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi Fig. 2. Average concentration of IL-8 (pg/ml) in stored blood components (linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób) Poziom IL-8 w badanych składnikach krwi w kolejnych dniach ich przechowywania przedstawiono na Rycinie 2. Jej stężenie w dniu pobrania krwi było najwyższe w KKCz (średnio 23,1 pg/ml). Od 21 dnia przechowywania KKCz stężenie tej cytokiny zaczęło wzrastać (30,5 pg/ml), a w ostatnim dniu ważności tego składnika osiągnęło 3-krotnie wyższą wartość (średnio 64,3 pg/ml), w porównaniu ze stężeniem w dniu pobrania (p=0,002). Średnie stężenie IL-8 w UKKCz w ciągu całego okresu przechowywania było na poziomie stężenia tej cytokiny u zdrowych osób. W koncentratach płytkowych w dniu aferezy stężenie IL-8 było w granicach normy (średnia 5,8 pg/ml). W 6 dniu przechowywania KKP-Af. stężenie tej cytokiny było 3-krotnie wyższe (średnia 15,6 pg/ml) niż w dniu pobrania krwi (p=0,002), ale nadal kształtowało się w górnych granicach normy. Średnie stężenie scd40l w badanych składnikach krwi przedstawiono na Rycinie 3. W KKCz stężenie tej cytokiny w dniu pobrania krwi było prawie 4-krotnie wyższe (8134 pg/ml) niż w osoczu kontrolnym, natomiast w UKKCz i KKP-Af. było w granicach normy. W trakcie przechowywania KKCz poziom scd40l nadal wzrastał i po 14 dniach osiągnął najwyższe stężenie 27 192 pg/ml, po czym stężenie nieznacznie spadało i w 42 dniu wynosiło średnio 19 565 pg/ml (2,5 razy wyższe niż w dniu 0, p=0,295). W przechowywanych UKKCz poziom scd40l nie zmieniał się i pozostawał w granicach badań kontrolnych (od 243 477 pg/ml). W KKP-Af. w 6 dniu badania stężenie scd40l było już prawie 5-krotnie wyższe (średnio 12 553 pg/ml) w porównaniu do stężeń tej cytokiny w dniu aferezy (p=0,002). Liczba leukocytów w KKCz w dniu 0 wynosiła średnio 9,3 10 3 /µl, a w czasie przechowywania ulegała stopniowemu zmniejszaniu i w 42 dniu była już 3-krotnie niższa (średnio 3,5 10 3 /µl). W pozostałych składnikach krwi: UKKCz, KKP-Af. oraz FFP liczba leukocytów w ciągu całego okresu badań kształtowała się < 1 10 3 /µl (Rycina 4).

90 P. ŁOPACZ i wsp. 30000 25000 20000 scd40l (pg/ml) 15000 10000 KKCZ UKKCZ KKP-Af. 5000 0 0 7 14 21 28 35 42 dni Ryc. 3. Średnie stężenie scd40l(pg/ml) w przechowywanych składnikach krwi Fig. 3. Average concentration of CD40L (pg/ml) in stored blood components (linią przerywaną jest zaznaczony zakres stężeń tej cytokiny w osoczu zdrowych osób) 10 9 8 Liczba WBC (x 10 3 /ul) 7 6 5 4 3 2 1 KKCz UKKCz KKP-Af. 0 0 7 14 21 28 35 42 dni Ryc. 4. Średnia liczba leukocytów w przechowywanych składnikach krwi Fig. 4. Average number of leucocytes in stored blood components DYSKUSJA Ocena stężenia cytokin w przechowywanych składnikach krwi jest interesująca z punktu widzenia bezpieczeństwa przetoczeń krwi, ponieważ wiadomo, że niehemolityczne gorączkowe odczyny poprzetoczeniowe mogą być wynikiem nie tylko interakcji przeciwciał antyleukocytarnych chorego z leukocy-

Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l 91 tami obecnymi w przetaczanej krwi, ale także przetoczenia krwi z wysokim poziomem takich cytokin prozapalnych jak IL-1β, IL-6 czy TNF-α [2,3,4,11,16]. Natomiast w odczynach poprzetoczeniowych przebiegających z dusznością zaczęto zwracać uwagę na IL-8 oraz scd40l [10, 16]. W Polsce do celów klinicznych stosowane są zarówno koncentraty krwinek czerwonych nie poddawane leukoredukcji jak i ubogoleukocytarne. Autorzy pracy zbadali stężenia w/w cytokin w obu rodzajach koncentratów krwinek czerwonych oraz w koncentratach krwinek płytkowych z aferezy. Zgodnie z zaleceniami zawartymi w Medycznych zasadach przetaczania krwi [17,18], opracowanymi na podstawie wytycznych dyrektyw WE i Rady Europy, liczba leukocytów w ubogoleukocytarnych składnikach krwi była niższa niż 1 10 6. Natomiast w KKCz, który uzyskano po usunięciu osocza bez usuwania kożuszka leukocytarnego, liczba leukocytów była prawie 9-krotnie wyższa. Fakt ten miał prawdopodobnie wpływ na zwiększone stężenie cytokin w KKCz, co będzie omawiane poniżej. Najczęściej stosowaną metodą oznaczania cytokin są techniki enzymatyczne (ELISA), a ostatnio unowocześniona ich wersja z użyciem biotyny i streptawidyny, zastosowana przez autorów niniejszej pracy. Grupą kontrolną dla badanych cytokin było oznaczenie ich stężenia w osoczu zdrowych dawców krwi. Stężenia IL-1β, IL-8 i scd40l w osoczu kontrolnym obserwowane w naszych badaniach mieściły się w granicach stężeń tych cytokin podanych przez producenta testu. W osoczu dawców, ani w żadnym ze składników krwi, w czasie całego okresu przechowywania nie wykryliśmy IL-6 i TNF-α. Analogiczne dane w odniesieniu do osocza zdrowych osób prezentują Lin i wsp.[3]. Natomiast Fujihara i wsp. [19] i Shanwell i wsp. [5] stosując ilościowe testy ELISA o zwiększonej czułości (R&D) wykrywali bardzo niskie stężenia IL-6 i TNF-α w 42-dniowych KKCz. Inni badacze [cyt. wg 2] wykrywali także niskie stężenia IL-6 i TNF-α w 5-dniowych KKP. W obecnej pracy poddaliśmy analizie ograniczoną liczbę składników krwi, jest więc możliwe, że przebadanie większej ich ilości pozwoliłoby wykazać, że w niektórych z nich poziom IL-6 i TNF-α jest wyższy od przeciętnej. Przy pomocy stosowanych przez nas testów wykrywaliśmy bowiem obie te cytokiny w niektórych składnikach krwi, po których wystąpiły niehemolityczne odczyny gorączkowe. Podobnie jak Muylle i wsp. [11] wykrywaliśmy także obie te cytokiny w znacznych stężeniach w osoczu chorych, u których po przetoczeniach krwi wystąpiły odczyny gorączkowe. IL-6 i TNF-α, a także omawiana niżej IL-1β należą do grupy endogennych pirogenów, które indukują gorączkę poprzez zwiększenie stężenia prostaglandyny E 2 w podwzgórzu mózgowym [20]. Stężenie IL-1β i IL-8 w UKKCz utrzymywało się przez cały okres przechowywania w granicach normy, natomiast w KKCz w końcowym okresie ważności tego składnika stężenie IL-1β wzrosło 10- krotnie. Stężenie IL-8 w KKCz było już w pierwszych 3 tygodniach przechowywania 2-krotnie wyższe niż poziom tej cytokiny w osoczu kontrolnym, a w ostatnim tygodniu badania wzrosło jeszcze 3- krotnie. W KKP-Af. nie wykrywaliśmy IL-1β, natomiast stężenie IL-8 chociaż wzrosło w porównaniu z dniem aferezy, to nadal utrzymywało się w górnych granicach normy. Podobne do naszych obserwacje dotyczące stężenia IL-1β w KKCz i UKKCz przedstawiają Shanwell i wsp.[5] oraz Stack i wsp. [12]. W KKP-Af. Wadhwa i wsp. [14] także nie wykrywali IL-1β, natomiast inni badacze [cyt. wg 2] stwierdzali bardzo niskie stężenia tej interleukiny. W przypadku IL-8, podobnie jak w naszych badaniach, cytowani już wyżej badacze [5, 12] stwierdzali w KKCz jej zwiększone stężenie w 42 dniu przechowywania krwi. W KKP-Af. zwiększone stężenie IL-8 w 5 dniu ich przechowywania potwierdzają także Fujihara i wsp.[19] oraz Wadhwa i wsp.[14]. Cytowani badacze oceniali stężenia cytokin przy użyciu zestawów ELISA firmy Quantikine, R&D Systems. W chwili obecnej brak jest obserwacji, czy i jakie stężenia IL-8 w przetoczonych składnikach krwi mogą wywoływać odczyny poprzetoczeniowe przebiegające z dusznością, w tym TRALI. Obserwowany wzrost stężenia wyżej opisanych cytokin może być spowodowany nie tylko aktywacją leukocytów, ale także ich rozpadem. Potwierdzeniem tego faktu może być obserwowany przez nas spadek liczby leukocytów w czasie przechowywania KKCz, który koreluje ze wzrostem stężenia IL-1β i IL-8. Podobne obserwacje, ale dotyczące zlewanych KKP, przedstawiają Aye i wsp. [13], którzy przy

92 P. ŁOPACZ i wsp. użyciu ilościowych testów ELISA (R&D) stwierdzali w 5-dniowych niefiltrowanych KKP znacznie wyższe stężenia tych cytokin w porównaniu do filtrowanych KKP. Ponadto w niefiltrowanych zlewanych KKP wykrywali oni IL-6 i TNF-α, które nie były przez nas stwierdzane w KKP z aferezy. Spośród badanych w obecnej pracy cytokin, zarówno w osoczu jak i w przechowywanych KKCz i KKP-Af., w najwyższym stężeniu występowała cytokina scd40l. W KKCz już w dniu pobrania krwi stężenie tej cytokiny było 4-krotnie wyższe niż w osoczu zdrowych osób, a w trakcie przechowywania wzrosło jeszcze 2-krotnie. Było to związane prawdopodobnie z dużą liczbą płytek krwi (ok.3x10 5 /µl) obecnych w KKCz. Pięciokrotny wzrost stężenia tej cytokiny był także obserwowany w KKP-Af., w 6 dniu przechowywania płytek. W trakcie przechowywania UKKCz poziom scd40l nie zmieniał się i pozostawał w granicach normy. Jak wiadomo, w czasie preparatyki UKKCz, w systemie Atreus usuwane są leukocyty i większość płytek krwi. Khan i wsp. [10] podobnie jak my wykazali wyższe stężenie scd40l w 42-dniowych KKCz i 5- dniowych KKP-Af., w porównaniu do dnia pobrania tych składników. Interesujące jest także spostrzeżenie tych autorów, że KKP z aferezy zawierają wyższe stężenia scd40l aniżeli KKP przygotowane z pełnej krwi. Cytowani autorzy wysuwają hipotezę, że scd40l, które kumuluje się w czasie przechowywania składników krwi może aktywować ludzkie neutrofile wykazujące ekspresję CD40 i indukować ich cytotoksyczną aktywność, czego efektem jest niszczenie śródbłonka naczyń włosowatych płuc i możliwość wystąpienia TRALI u predysponowanych chorych. Ponadto Khan i wsp.[10] wykazali, że chorzy, u których wystąpił odczyn TRALI otrzymali po przetoczeniu KKP dwukrotnie więcej scd40l niż chorzy, u których odczyn nie wystąpił. Udowodnili więc, że wysokie stężenie tej cytokiny w niektórych przetaczanych składnikach krwi może być jednym z czynników prowadzących do wystąpienia TRALI. Wyniki te w sposób istotny uzupełniają dotychczasową wiedzę o udziale cytokin w tym powikłaniu, tym niemniej dalsze badania nad tym zagadnieniem są konieczne. Nasza praca, w której także podjęliśmy się oznaczania stężeń scd40l w składnikach krwi podczas przechowywania, wydaje się być istotnym kierunkiem badań i powinna być kontynuowana na większym materiale. Obecnie w przygotowaniu jest praca dotycząca stężenia IL-1β, IL-6, IL-8 i scd40l w KKCz i KKP, po których wystąpiły odczyny poprzetoczeniowe przebiegające z dusznością, w tym TRALI. Praca wykonana w ramach projektu badawczego własnego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (nr NN 401 215734). PIŚMIENNICTWO 1. Brand A Passenger leukocytes, cytokines, and transfusion reactions. Engl J Med 1994; 331: 670-671. 2. Heddle NM Pathophysiology of febrile nonhemolytic transfusion reactions. Curr Opin Hematol 1999; 6: 420-426. 3. Lin JS, Tzeng CH, Hu HY i wsp. Cytokine release in febrile non-haemolytic red cell transfusion reactions. Vox Sang 2002; 82: 156-160. 4. Heddle N The role of cytokines in acute reactions to platelet transfusions. In. Compendium of American Association of Blood Bank, 1998; 4: 268-272. 5. Shanwell A, Kristiansson M, Remberger M, Ringden O Generation of cytokines in red cell concentrates during storage is prevented by prestorage white cell reduction. Transfusion 1997; 37: 678-684. 6. Silliman CC, Fung YL, Ball JB, Khan SY Transfusion related acute lung injury (TRALI: current concept and misconceptions. Blood Rev 2009; 23: 235-255. 7. Rana R, Fernandez-Perez ER, Khan SA i wsp. Risk factors and outcome of transfusion-related acute lung injury in the critically ill: a retrospective study. Transfusion 2006; 46: 1478-1483. 8. Fung YL, Silliman CC The role of neutrophils in the pathogenesis of transfusion-related acute lung injury. Tranf.Med. Rev 2009; 23: 266-283. 9. Silliman CC, Bjornsen AJ, Wyman TH i wsp. Plasma and lipids from stored platelets cause acute lung injury in an animal model. Transfusion 2003; 43: 633-640.

Ocena stężenia IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α i scd40l 93 10. Khan SY, Kelher RM, Heal JM i wsp. Soluble CD40 ligand accumulates in stored blood components, primes neutrophils through CD40 and is a potention cofactor in the development of transfusion-related acute lung injury.blood 2006; 108: 2455-2462. 11. Muylle L, Joos M, Wouters E, De Bock R, Peetermans ME. Increase tumor plasma of stored platelet concentrates: relationship between TNFα and IL-6 levels and febrile transfusion reactions. Transfusion 1993; 33: 195-199. 12. Stack G, Baril L, Napychank P, Snyder EL. Cytokine generation in stored, white cell-reduced, and bacterially contaminated units of red cells. Transfusion 1995; 35: 199-203. 13. Aye MT, Palmer DS, Giulivi A, Hashemi S. Effect of filtration of platelet concentrates on the accumulation of cytokines and platelet release factors during storage. Transfusion 1995; 35: 117-124. 14. Wadhwa M, Seghatchian MJ, Lubenko A i wsp. Cytokine levels in platelet concentrates: quantitation by bioassays and immunoassays. British Journal of Haematology 1996; 93: 225-234. 15. Glenister KM, Sparrow LL Level of platelet-derived cytokines in leukoreduced red blood cells is influenced by the processing method and type of leukoreduction filter. Transfusion 2010; 50: 185-189. 16. Shaiegan M, Poufatollah AA, Namiri M, Babaee G. Generation of IL-8 and TNF-alpha in platelet concentrates during storage. Arch.Iran Med., 2006; 9: 51-64. 17. Rosiek A Pobieranie krwi i zabiegi aferezy, w: Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiazujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Red. Łętowska M, IHiT, Warszawa 2010, 4-1 4-4. 18. Antoniewicz-Papis J, Dzieciątkowska A Preparatyka krwi i jej składników w: Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania jej składników i wydawania, obowiazujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Red. Łętowska M, IHiT, Warszawa 2010, 6-1 6-102. 19. Fujihara M, Takahashi TA, Ogiso C, Hosoda M, Ikebuchi K, Sekiguchi S Generation of interleukin 8 in stored apheresis platelet concentrates and the preventive effect of prestorage ultraviolet B radiation. Transfusion 1997; 37: 468-475. 20. Gołąb J, Jakóbisiak M, Zagożdżon R, Obłąkowski P. Cytokiny w: Immunologia Red. Gołąb J, PWN, Warszawa 2002, 198-244. Praca wpłynęła do Redakcji 01.02.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 24.03.2011 r. Adres Autorów: Patrycja Łopacz Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Ul. Chocimska 5 00-975 Warszawa e-mail: plopacz@ihit.waw.pl