Praktyczne wykorzystanie urządzenia lue Pippin do przygotowywania wysokiej jakości bibliotek do DN-Seq Użytkownicy platform NGS w polskich laboratoriach cenią sobie możliwość automatyzacji określonych etapów pracy podczas przygotowania bibliotek do sekwencjonowania. W ostatnim czasie docierają do nas bardzo pochlebne opinie o elektroforetycznym systemie lue Pippin (Sage Science). Główne zalety tego urządzenia, podkreślane przez badaczy to: Dostęp do kaset o różnej procentowości żelu zapewnia ogromną elastyczność jeśli chodzi o zakresy wielkości bibliotek z jakimi chcemy pracować. o za tym idzie możliwość dopasowania ostatecznej wielkość biblioteki do konkretnej aplikacji i długości odczytów. Nieskomplikowany sposób przygotowania próbek do frakcjonowania i ich odzyskania po elucji, który pozwala na zmniejszenie nakładu pracy i oszczędność czasu. Pracownicy Zakładu Genetyki Medycznej Uniwersytetu Medycznego w Warszawie, którzy techniką NGS posługują na co dzień m. in. w celu identyfikacji genetycznych defektów powodujących niedosłuch, choroby kardiologiczne oraz na potrzeby opisania genetycznego podłoża rozwoju nowotworów, podzielili się z OpenExome swoimi doświadczeniami z użytkowania aparatu lue Pippin. Dr n med. Małgorzata Rydzanicz przykłada ogromną uwagę do jakości bibliotek, które mają zostać poddane sekwencjonowaniu. Twierdzi, że przygotowanie biblioteki o prawidłowej wielkości i czystości jest kluczowe nie tylko ze względu na jakość samego sekwencjonowania, ale również determinuje ostateczny kosz sekwencjonowania pojedynczej próby. Nasza rozmówczyni zapytana o sens stosowania etapu elektroforetycznego frakcjonowania fragmentów DN w próbce odpowiada: Selekcja fragmentów przed wejściem w procedurę przygotowania bibliotek pozwala na ograniczenie insertów DN do ściśle określonej wielkości w bardzo wąskim zakresie, którego osiągnięcie przy użyciu fragmentacji fizycznej (np. sonikacja) lub enzymatycznej (np. tagmentacja) jest niemal niemożliwe. W przypadku kiedy obserwujemy w obrazach elektroforezy gotowych bibliotek obecność dimerów lub/i konkatamerów adapterów ważne jest wyeliminowanie tych sekwencji przed właściwą reakcją sekwencjonowania. Szczególnie niepożądane są dimery adapterów, które będą preferencyjnie hybrydyzować do powierzchni komory przepływowej sekwenatora, a tym samym część wygenerowanych klastrów nie będzie zawierała insertów DN. Podobnie, kiedy zakres wielkości przygotowanej biblioteki sugeruje obecność dużej frakcji o bardzo krótkich insertach (krótszych niż zaplanowana długość odczytów), wyeliminowanie takich fragmentów pozwala na uniknięcie sekwencjonowania adapterów. Dzięki uprzejmości prof. dr hab. med. Rafała Płoskiego, kierownika Zakładu Genetyki Medycznej WUM, przedstawiamy przykłady praktycznego zastosowania elektroforezy preparatywnej na potrzeby przygotowania wysokiej jakości bibliotek do diagnostycznych zastosowań DN-Seq.
Przykład nr 1 elem była poprawa profilu przygotowanej uprzednio biblioteki całoegzomowej, poprzez wyeliminowanie frakcji zawierającej bardzo krótkie inserty (zakres wielkości biblioteki 200-300 pz, gdzie 180 pz to sekwencje adapterowe) oraz frakcji zawierającej długie fragmenty, a tym samym zwiększenie kontroli nad jakością jej hybrydyzacji/klastrowania tej biblioteki na powierzchni komory przepływowej sekwenatora HiSeq 1500 (reakcja sekwencjonowania w trybie sparowanych końców, 2x75 cykli). iblioteka całoegzomowa uzyskana z zastosowaniem zestawu Nextera Rapid apture Exome Enrichment Kit (Illumina), zakres wielkości 200-2000 pz. Selekcja fragmentów w zakresie wielkości 380-420 pz z wykorzystaniem urządzenia lue Pippin (Sage Science). Nałożona ilość DN 1000 ng, średnia wielkość bibliotek po selekcji fragmentów 390 pz. Kaseta żelowa 2% DF Marker V1. - Obraz po nałożeniu na siebie dwóch rożnych próbek, kolor czerwony próbka, kolor niebieski próbka Wielkość fragmentów analizowano z wykorzystaniem ioanalyzer 2100 (gilent), High Sensitivity DN Kit.
Przykład nr 2 elem pracy było przygotowanie DN genomowego człowieka na potrzeby analizy NGS szlakiem NebNext Ultra DN Library Prep Kit for Illumina (New England of iolabs). Pozyskiwano insert o wielkości 1000 pz, a finalną bibliotekę sekwencjonowano w kierunku wykrywania zbalansowanych aberracji chromosomowych. Właściwą reakcję sekwencjonowania prowadzono na platformie MiSeq (Illumina) w trybie sparowanych końców (2x150 cykli). D 1 ug genomowego DN poddano fragmentacji przy wykorzystaniu sonikatora ovaris M220, docelowa wielkość fragmentów 800-1500 pz. Selekcja fragmentów przed wejściem w procedurę konstruowania biblioteki genomowej. Za pomocą urządzenia lue Pippin (Sage Science) z pofragmentowanego DN wyselekcjonowano fragmenty w zakresie wielkości 900-1400 pz, średnia wielkość fragmentów 1100 pz. Nałożono 800 ng DN. Kaseta żelowa 1,5% DF Marker R2. iblioteka genomowa dla insertu o wielkości 1100 pz. Przesuniecie próbki względem próbki jest wynikiem ligacji sekwencji adapterowych do insertu (+ 120 pz). D Obraz po nałożeniu trzech rożnych próbek. Kolor czerwony próbka, kolor niebieski próbka, kolor zielony próbka.
Przykład nr 3 iblioteka całogenomowa przygotowana z DN oczyszczanego ze bloczka parafinowego z wykorzystaniem zestawu NebNext Ultra DN Library Prep Kit for Illumina (New England of iolabs). Po izolacji DN uzyskano znikome ilości materiału genetycznego (10 ng) o wysokim stopniu degradacji próbki. Uzyskano bibliotekę DN zanieczyszczoną dimerami i konkatamerami adapterów, niepożądane sekwencje wyeliminowano z wykorzystaniem elektroforezy preparatywnej w lue Pippin uzyskując czystą bibliotekę gotową do sekwencjonowania. iblioteka całogenomowa, w obrazie elektroforezy kapilarnej widoczne dimery adapterów (strzałka zielona) oraz konkatamery adapterów (strzałka niebieska). iblioteka po eliminacji niepożądanych sekwencji za pomocą urządzenia lue Pippin, zakres cięcia obejmował główny pik (22-320 pz). Nałożono 180 ng DN. Kaseta 1,5% DF Marker R2. Wielkość fragmentów analizowano z wykorzystaniem ioanalyzer 2100 (gilent), High Sensitivity DN Kit.
adaczom, którzy nie zetknęli się dotychczas z urządzeniem luepippin wyjaśniamy, że jest to należący do grupy aparatów Pippin DN system do elektroforetycznego rozdziału i elucji fragmentów DN zgodnie z zadanym przez użytkownika zakresem długości fragmentów. lue Pippin dedykowany jest do pracowni sekwencjonowania następnej generacji (NGS), ponieważ usprawnia obowiązkowy dla większości szlaków przygotowania bibliotek NGS etap selekcji fragmentów DN składających się na docelową bibliotekę. lue Pippin w porównaniu do tradycyjnego ręcznego przygotowania żeli agarozowych i elucji DN z wycinanych prążków, pozwala na uzyskiwanie w krótszym czasie wyższej jakości próbek przeznaczonych do analiz NGS. Ekstrakcja przebiega poprzez przełączenie ścieżki elektroforezy do kanału, który zbiera eluowaną frakcję do komory wypełnionej buforem. Wyselekcjonowanie frakcje DN pobierane są przy użyciu pipety laboratoryjnej.