Katedra Andrologii i Endokrynologii Płodności Dr n. med. Katarzyna Marchlewska
Nasienie plemniki płyn nasienny (plazma nasienia) - wydzielina pęcherzyków nasiennych (60-70%) - wydzielina prostaty (ok. 30%) - wydzielina jąder, najądrzy, gruczołów opuszkowo-cewkowych (5%) komórki okrągłe (leukocyty, komórki spermatogenezy) całkowita liczba plemników odzwierciedla wydajność produkcji plemników przez jądra oraz drożność dróg wyprowadzających nasienie całkowita objętość płynu nasiennego odzwierciedla aktywność wydzielniczą gruczołów
Warunki wstępne badania nasienia: Informacje dla pacjenta powinny być przekazane ustnie i umieszczone w formie pisemnej w pokoju przeznaczonym do oddawania nasienia. Do analizy musi być dostarczony cały ejakulat. Wstrzemięźliwość płciowa co najmniej 48 h, ale nie dłużej niż 7 dni. W przypadku powtarzania badania wstrzemięźliwość płciowa powinna być taka sama. Badanie powinno być powtórzone przynajmniej dwukrotne w odstępach nie krótszych niż 7 dni i nie dłuższych niż 3 tygodnie.
Różnice w całkowitej liczebności oraz koncentracji plemników w okresie 1,5 roku u 5 zdrowych mężczyzn
Warunki wstępne badania nasienia: Badanie powinno być rozpoczęte przeciągu 1 h od ejakulacji. Nasienie powinno być oddawane w specjalnym pomieszczeniu niedaleko od laboratorium, drogą masturbacji do pojemnika ogrzanego do temp. 20-37 C W przypadku gdy pacjent nie jest w stanie oddać nasienia drogą masturbacji możliwe jest użycie specjalnych prezerwatyw przeznaczonych do tego celu. W przypadku badania mikrobiologicznego pacjent powinien: oddać mocz umyć ręce i penis mydłem dokładnie wypłukać mydło do wytarcia użyć jednorazowego ręcznika oddać ejakulat do jałowego pojemnika
PODSTAWOWE BADANIE NASIENIA: - Ocena makroskopowa nasienia - Ocena mikroskopowa preparatów
ETAPY BADANIA NASIENIA Przez pierwsze 5 minut od ejakulacji: Pojemnik z próbką nasienia umieścić w inkubatorze (37 C) na okres potrzebny do upłynnienia. upłynnienie ocenić makroskopowo i mikroskopowo w trakcie upłynniania umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym (temp. 20-37 C) jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min odczekać z rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min.
ETAPY BADANIA NASIENIA Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od ejakulacji: - czas upłynnienia - wygląd/kolor - lepkość/konsystencja - objętość -ph -preparat bezpośredni (ruchliwość i rozcieńczenie) -żywotność (w przypadku niskiej ruchliwości) -rozmaz do morfologii -ocena liczby
ETAPY BADANIA NASIENIA Po 30 nim ale przed upływem 60 minut od ejakulacji: - test MAR (mixed antiglobulin reaction) - ocena komórek peroksydazo-pozytywnych - immunobead test (preparat) - odwirowanie nasienia Przed upływem 3 godzin od ejakulacji: - przesłanie próbki do badania mikrobiologicznego Później ale tego samego dnia (lub następnego z zamrożonej próbki): - ocena markerów czynności gruczołów dodatkowych - immunobead test
Upłynnianie nasienia: Prawidłowe nasienie jest homogenne i upłynnia się w przeciągu 60 min w temperaturze pokojowej pod wpływem enzymów pochodzących z prostaty (PSA). Norma: do 60 min. (zwykle 15 min.) upłynnienie można ocenić makroskopowo i/lub mikroskopowo w trakcie upłynniania zaleca się umieścić pojemnik na mieszadle rotacyjnym (temp. 20-37 C) jeśli próbka nie upłynni się w przeciągu 30 min. odczekać z rozpoczęciem dalszych analiz kolejne 30 min. Obecność pasm śluzu może utrudniać procedurę liczenia plemników i sugeruje stan zapalny lub zaburzenia upłynnienia.
Nasienie nieupłynnione: - dodanie równej objętości PBS w wersji Dulbecco (Dulbecco s Posphate Buffered Saline) i wymieszanie pipetą - mechaniczne mieszanie strzykawką z igłą o średnicy wewnętrznej 0.84 0.69 mm - trawienie roztworem 10 IU/ml bromeliny w Dulbecco-PBS UWAGA: Należy odnotować w wyniku użycie określonej metody i uwzględnić rozcieńczenie przy ocenie liczby plemników Preparat o dużym stopniu nieupłynnienia może upośledzać zdolność plemników do zapłodnienia Obecność ciałek żelatynowych
Lepkość: Długość nitki nie powinna przekroczyć 2 cm podwyższona lepkość Prawidłowa lepkość
UWAGA Preparat o podwyższonej lepkości może utrudniać - ocenę ruchu - ocenę koncentracji /całkowitej liczby plemników - wykrycie plemników opłaszczonych przeciwciałami - pomiary markerów biochemicznych W celu zmniejszenia lepkości próbki stosujemy takie same metody jak przy próbce nasienia nieupłynnionego.
Wygląd / kolor: Prawidłowe nasienie ma wygląd homogenny, nieprzezroczysty, szaro-opalizujący Hematospermia Azoo/Oligozoospermia Żółta: żółtaczka, używanie niektórych witamin np. z grupy B
Objętość: Plazma nasienia produkowana jest głównie w gruczołach dodatkowych. Większość wydzielana jest z pęcherzyków nasiennych a jedynie od 0,5 and 1 ml pochodzi z gruczołu krokowego. Metoda wagowa: Norma: 1,5 ml Zważyć pojemnik przed oddaniem nasienia i zapisać masę Zważyć pojemnik razem z nasieniem i zapisać masę Obliczyć masę próbki Obliczyć objętość próbki przy założeniu, że gęstość właściwa ejakulatu wynosi 1 g /ml (1,043-1,102 g/ml) Metoda objętościowa: nasienie może być oddane do specjalnego cylindra miarowego o szerokim otworze objętość odczytuje się ze skali z dokładnością do 0,1 ml
UWAGA Ocena objętości nasienia poprzez aspirację próbki nasienia do skalowanej pipety/strzykawki, lub przelanie do skalowanego cylindra/probówki nie jest zalecane!!! Utrata próbki rzędu 0.3 0.9 ml!!! Niska objętość ejakulatu: - utrata części próbki - zablokowanie dróg wyprowadzających nasienie - wrodzony obustronny brak nasieniowodów (niedorozwój pęcherzyków nasiennych) - częściowy wytrysk wsteczny - niedobór androgenów Wysoka objętość ejakulatu: - wysięk w przypadku aktywnego zapalenia gruczołów dodatkowych
GRUCZOŁ KROKOWY ph: PĘCHERZYKI NASIENNE Wydzielina kwaśna Wydzielina zasadowa Ocenę należy przeprowadzić po upłynnieniu nasienia ale nie później niż 60 min od ejakulacji Wartość referencyjna: 7,2 Jeśli ph < 7,0 przy azoosprmii może to oznaczać obustronną niedrożność nasieniowodów Zakres papierków wskaźnikowych : 6.0 do 10.0 lub 6.5 do 10.0
Ocena mikroskopowa preparatów: Preparat nasienia musi być bardzo dokładnie wymieszany przed wykonaniem każdej analizy!! Do mieszania polecana jest jednorazowa pipetka Pasteura o szerokim ujściu (1,5 mm). Należy delikatnie zaaspirowaś próbkę około 10 razy. Nie stosować vortexu, ponieważ powoduje uszkodzenia plemników. Wstępna ocena preparatu bezpośredniego (pow. 100x): występowanie pasm śluzu agregacja lub aglutynacja plemników obecność komórek innych niż plemniki tj. leukocytów, niedojrzałych komórek spermatogenezy, komórek nabłonkowych
Ocena ruchu plemników: Kategorie ruchu: PR - ruch postępowy (niezależnie od szybkości) NP - ruch niepostępowy Głębokość 20µm IM - brak ruchu 10 µl 22 mm Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników Wartość referencyjna: 40% PR + NP lub 32% PR
Ocena ruchliwości: NP
200 200 PR 30% 50% NP - 5% 15% IM - 65% 35% Średnia = (65+35):2 = 50 Różnica = 65 35 = 30 Wynik do powtórzenia
200 200 PR 37% 28% NP - 3% 6% IM - 60% 66% Średnia = (60+66):2 = 63 Różnica = 66 60 = 6 Wynik prawidłowy PR 32%; NP 4%; IM 63%
Żywotność plemników Żywotność plemników ocena integralności błony komórkowej powinna zawsze być wykonywana w próbkach nasienia z nieprawidłowym ruchem plemników (<40% PR), ale może być wykonywana rutynowo dla każdej próbki nasienia
Żywotność plemników: - Test eozyna/nigrozyna - Test eozynowy - Test wodny (HOS Test) X 1000 Wartość referencyjna: 58 % plemników żywych X 400 Ocena: Oceniamy 2 x przynajmniej 200 plemników
Test eozyna/nigrozyna - zmieszać po 50 µl nasienia i roztworu eozyna-nigrozyna - wykonać rozmaz - oceniać od razu po wyschnięciu, lub później po zatopieniu w odpowiednim (bezwodnym) medium, pod imersją (1000x) Plemniki żywe - główki białe - jasnoróżowe Plemniki nieżywe - główki czerwone - ciemnoróżowe
Test eozynowy - pobrać po 5 µl (lub po 10 µl) nasienia i roztworu eozyny na szkiełko mikroskopowe, dokładnie wymieszać -przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22mm) (lub 24x40 mm) - po 30 min. oceniać pod powiększeniem 200 lub 400 x (najlepiej w mikroskopie kontrastującym fazy) Plemniki żywe - główki niezabarwione - jasnoróżowe Plemnik nieżywy - główki czerwone - ciemnoróżowe
Test hipoosmotyczny (HOS test) - alternatywa do testów barwionych - używany gdy należy uniknąć barwienia plemników (plemniki do ICSI) - pobrać po 100 µl nasienia i roztworu hipotonicznego - inkubować w 37ºC przez 5 min (ICSI) lub 30 min (badania nasienia) - pobrać 10 µl na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym (22x22 mm) i oceniać pod powiększeniem 200x lub 400x najlepiej w mikroskopie kontrastującym fazy Plemnik nieżywy -brak efektu puchnięcia witki Plemniki żywe - różne typy puchnięcia witki
Agregacja przyleganie (na zasadzie adhezji) komórka nabłonkowa nieruchomych plemników do siebie oraz przyleganie ruchomych plemników do pasm śluzu i innych nieruchomych elementów nasienia ciałka resztkowe plemniki
Aglutynacja tworzenie zlepów poprzez przyleganie ruchliwych plemniki do siebie w charakterystyczny sposób: główka-główka, witkawitka i mieszany
Typ A główka do główki B witka do witki (główki wolne) C koniec witki do końca witki Stopień D mieszana (razem głowka-głowka i witkawitka) A B C D 1 izolowana <10 plemników 2 średnia 10 50 plemników 3 duża > 50 plemników 1 2 3 4 4 masywna, brak wolnych plemników E plątanina (główki i witki zaplątane; głowki w aglutynacie witek)) E
Ocena liczby plemników: Badanie wstępne: -Określenie właściwego rozcieńczenia (preparat bezpośredni) -Pow. 400x (HPF high power field) 50g NaHCO 3 +10ml 35% formaliny uzupełnić wodą dest. do 1000ml 4 nl 10 µl 22 mm
1. Określenie właściwego rozcieńczenia korzystamy z preparatu bezpośredniego używanego do oceny ruchu oglądamy jeden z preparatów bezpośrednich oceniamy liczbę plemników w polu widzenia na podstawie przynajmniej 5 pól mikroskopu (HPF high power filed; 200x lub 400x) Jedno pole widzenia to zwykle ok. 16 nl objętości próbki nasienia przy powiekszeniu 200x - ok. 4 nl objętości próbki nasienia przy powiększeniu 400x 4 nl 22 mm 10 µl pow. 400x
3 mm 1 mm Kamera Neubauera Głębokość 100 µm 4 5 4 4 nl 25 nl 100 plemników 22 mm 20 nl 500 plemników 4 nl 100 plemników 20 nl 500 plemników 100 nl 2500 plemników Rozcieńczenie: 1:5 (1+4) 100 nl 500 plemników
Liczba plemników w polu widzenia (pow. 400x) Rozcieńczenie Numery pól do zliczania plemników < 2 2-15 16-100 > 101 1:2 (1 + 1) 1:2 (1 + 1) 1:5 (1 + 4) 1:20 (1 + 19) wszystkie 9 pól pole nr 5,4,6 pole nr 5,4,6 pole nr 5,4,6 C = (N/n) x (1/20) x wsp. rozcieńczenia C = (N/n) x (1/100) x 2 N liczba zliczonych plemników n - liczba rzędów
Przykład: rozcieńczenie 1+4 (1:5) C = (N/n) x (1/20) x 5 C = (N/n) x (1/4) Suma: 215 + 224 = 439 Różnica: 224 215 = 9 215 plemników w 6 rzędach 224 plemników w 6 rzędach C = (215 + 224) /(6 +6) x (1/4) C = 9,1 x 10 6 /ml
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników Ok. 4 plemniki < 1 mln/ml 4 nl 22 mm Ok. 2 plemniki < 0,5 mln/ml rozcieńczenie 1+1 (1:2) 2x C = (N/n) x (1/100) x 2 C = (N/n) x (1/50) Gdzie N liczba zliczonych plemników n liczba zliczonych siatek (9+9=18)
Postępowanie w przypadku bardzo niskiej liczby plemników Jeśli w preparacie przyżyciowym nie znaleziono plemników należy: próbkę odwirować przy 3000g przez 15 min. cały osad rozprowadzić na szkiełku podstawowym przykryć szkiełkiem nakrywkowym (zalecane 20 x 50 mm) oglądać cały preparat w poszukiwaniu plemników. Pow. 200x Oceniamy ok.1200 pól widzenia jeśli nie znaleziono żadnego plemnika jest to azoospermia jeśli znaleziono plemniki jest to kryptozoospermia
Budowa morfologiczna plemników: Norma: 4% o prawidłowej budowie (Kruger strict criteria) Metody barwienia: -Papanicolaou -Shorr -Diff-quick
Budowa morfologiczna plemników: Główka regularny zarys, owalna z wyraźnie zaznaczonym akrosomem zajmującym od 40-70% powierzchni ; dopuszcza się obecność 2 małych wakuoli w regionie akrosomalnym, których powierzchnia nie przekracza 20% powierzchni główki; region postakrosomalny nie może zawierać wakuoli Wstawka smukła, regularna w zarycie o podobnej długości jak główka; główna oś wstawki powinna byś przedłużeniem długiej osi główki; przywieszka cytoplazmatyczna nie powinna przekraczać 1/3 wielkości główki Witka jednakowa grubość na całej długości, cieńsza od wstawki, długość 45 m (ok. 10 długości główki); może wykazywać wygięcia, jednak nie pod ostrym kątem sugerującym złamanie witki region akrosomalny 40 70% powierzchni główki szerokość główki 2.5 3.5 um długość główki 4 5 um szerokość wstawki poniżej 1 um długość wstawki ok. 5 7 um długość witki ok. 45 um um
Prawidłowa budowa morfologiczna plemników:
Nieprawidłowości w budowie plemników: Barwienie Papanicolaou
- Komórka nabłonkowa N - - - - + - - - Makrofag degenerujący? Granulocyt obojętnochłonny + - - - - - Spermatyda + - - + - Granulocyt obojętnochłonny Bakterie
makrofag spermatocyty cytoplazma spermatyda dzieląca się spermatyda degenerująca spermatyda dzieląca się spermatyda spermatyda degenerujące spermatydy dzielący się spermatocyt spermatocyt cytoplazma fagocytujący makrofag
monocyt granulocyty obojętnochłonne + + + + + + + + + + + + degenerujący leukocyt
Ocena komórek okrągłych : Komórki nabłonkowe cewki moczowej Komórki prostaty Komórki spermatogenezy Leukocyty
Leukocyty: - neutrofile 50 60 % - makrofagi 20 30 % - limfocyty 2 5 % Komórki preoksydazo-dodatnie (granulocyty obojętnochłonne) Immunocytochemiczne barwienie na obecność antygenu CD45 (wszystkie leukocyty)
Wartości referencyjne w badaniu nasienia WHO 2010 Objętość ejakulatu 1,5 ml 2 ml ph 7,2 Koncentracja plemników 15 mln/ml 20 mln/ml Całkowita liczba plemników 39 mln/ejakulat 40 mln/ejakulat Ruch plemników 40% kat. PR+NP lub; 32 % kat. PR (WHO 2010) 50% kat. a i b lub; 25 % kat. a (WHO 1999) Morfologia plemników 4 % o prawidłowej budowie (WHO 2010) 14 % o prawidłowej budowie (WHO 1999) 30 % o prawidłowej budowie (WHO 1992) Żywotność plemników 58% żywych 50% żywych
1. WHO manual: https://www.who.int/reproductivehealth/publications/infertility/ 2. Cooper T i wsp., Human Reproductive Update, 2009 3. Asian Journal of Andrology, 2010, 12