Część teoretyczna: Mikrobiologia II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Ćwiczenie 10 I. MIKROFLORA WODY Mikroflora autochtoniczna to drobnoustroje naturalnie bytujące i rozmnażające się w środowisku wodnym. Właściwe bakterie wodne to autotrofy i heterotrofy, zdolne do wzrostu nawet w obecności śladowych ilości substancji odżywczych. W grupie mikroorganizmów najbardziej typowych dla środowiska wodnego znajdują się ruchliwe bakterie należące do rodzajów: Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Selenomonas, Spirillum oraz bakterie nitryfikacyjne, siarkowe i żelaziste. Ponadto zaliczamy tu grzyby z rodzajów Mucor, Leptomitus, Sąprolegnia Mikroflora allochtoniczna przedostaje się do wody zarówno z powietrza, gleby, jak i ze ściekami przemysłowymi i komunalnymi. Spotyka się je najczęściej w wodach powierzchniowych. Ze względu na znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorganizmy można podzielić na saprofityczne (nieszkodliwe, wyżej wymienione autotrofy i heterotrofy), patogenne (chorobotwórcze) i szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu. Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody z przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone na następnego żywiciela. Drogą wodną przenoszone są: cholera przenoszona przez przecinkowca cholery (Vibrio cholerae, w wodzie powierzchniowej przeżywa do kilku tygodni, w wodociągowej kilka dni), dur brzuszny powodowany przez pałeczkę duru brzusznego (Salmonella Typhi), czerwonka - pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i Shigella sonnei) tularemia - Pasteurella (Francisella) tularensis. Mogą być także tą drogą przenoszone brucelloza, żółtaczka zakaźna, gorączka błotna oraz enterowirusy (wirusy Polio). Podczas analiz mikrobiologicznych wody niemożliwe jest badanie wszystkich organizmów chorobotwórczych, dużo łatwiej jest analizować tzw. mikroorganizmy wskaźnikowe, które dostają się do wody z wydalinami ludzkimi lub zwierzęcymi. Badania mikroflory jelitowej ustaliły stałe występowanie trzech różnych rodzajów bakterii wskaźnikowych, świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub ściekami: - pałeczki okrężnicy Escherichia coli, - paciorkowców kałowych z typowym gatunkiem Enterococcus faecalis, - beztlenowców przetrwalnikujących Clostridium perfringens. Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy (tab. 2) świadczy o fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii chorobotwórczych. 1
Tabela 1. Wymagania mikrobiologiczne dla wody pitnej i na potrzeby gospodarcze Wskaźniki jakości wody sieciowych dezynfekowana Podawana do sieci W sieci sieciowych niedezynfekowana Podawana do sieci W sieci lokalnych, studni publicznych i studni zakładowych Liczba bakterii grupy coli typu kałowego w 100 ml Liczba bakterii grupy coli w 100 ml Liczba kolonii bakterii na agarze po 24h, 37ºC w 1 ml Liczba kolonii bakterii na agarze po 72h, 20 C w 1 ml 0 0 0 0 0 0 1 1 2 2 10 20 20 40 40 50 100 100 200 x X nie oznacza się Tabela 2. Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia Rodzaj oznaczenia Objętość próbki [ml] Dopuszczalna ilość bakterii Escherichia coli lub bakterie grupy coli 100 0 typu kałowego (termotolerancyjne) Bakterie grupy coli 100 0 Paciorkowce kałowe 100 0 Clostridium sp. redukujące siarczyny 20 0 Ogólna liczba bakterii w temp. 37ºC 1 10 Ogólna liczba bakterii w temp. 20ºC 1 100 Zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami, sanitarna ocena wody polega na określeniu liczby bakterii psychrofilnych oraz mezofilnych w 1 ml badanej wody oraz ustaleniu tzw. miana coli. Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii z grupy coli. Miano coli jest wartością niemianowaną. Jeśli miano coli wynosi 10 to znaczy, że w 10 ml znajduje się co najmniej 1 komórka bakterii z grupy pałeczki okrężnicy. Wartość miana coli jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody! Za bakterie z grupy coli uważa się gramujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu, w ciągu 48h hodowli w temp. 35-37 C. Tryptofan redukują do indolu. Należą do niej bakterie z rodzaju Escherichia, Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter. 2
Określanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych powtórzeniach. Wodę wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1 ml wody i przenosząc na płytkę Petriego. Dodatkowo posiewu dokonuje się często z rozcieńczenia 10-1. Wodę powierzchniową wysiewa się z rozcieńczeń 10-3 i 10-5 ; ścieki miejskie z rozcieńczeń 10-6 i 10-8. Następnie płytki odwraca się do góry dnem i jedną z nich wstawia do cieplarki o temp. 20 C, drugą do cieplarki o temp. 37 C. Czas hodowli w pierwszym przypadku dla bakterii psychrofilnych wynosi 72 h, a w drugim dla bakterii mezofilnych wynosi 24 h. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową Bakterie grupy coli można wykryć metodą fermentacyjno-probówkową, a wynik podać jako miano coli. Wykrywanie tych bakterii oparte jest na zdolności do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz gazu. W przypadku, kiedy dopuszczalne miano coli wynosi: 100 (np. woda pitna) wysiewa się = 50 ml i 5x10 ml, 50 wysiewa się = 5x10 ml i 1 ml oraz 0,1 ml 10 wysiewa się = 2x10 ml i 1 ml oraz 0,1 ml. Posiewów dokonuje się na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową (podłoże Eijkmana, LPB), a następnie inkubuje w temp. 37 C przez 24 lub 48 godzin. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w próbówce Durhama, zmętnienie pożywki i zmianę jej barwy z fioletowej na żółtą. Jeśli po 24 godzinach powyższe zmiany nie wystąpią, wówczas próbki inkubuje się dalej i ponownie odczytuje po 48 h. Pojawienie się bardzo małej ilości gazu, przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia, uważa się za wynik wątpliwy. Hodowle, których wyniki po 24 godzinach inkubacji uznano za wątpliwe, poddaje się badaniu potwierdzającemu, a następnie inkubuje dalej do 48 h. W przypadku wątpliwości wykonuje się posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na wytwarzanie indolu. Badania potwierdzające należy wykonać przesiewając bakterie jałowa ezą z podłoża laktozowego na pożywkę Endo. Inkubacje należy prowadzić w temp. 37 C w ciągu 24 godzin. Bakterie grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym (fuksynowym) połysku. W przypadku obecności chociażby jednej takiej kolonii na pożywce Endo, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni. 3
Próba na indol Probówki zawierające wodę peptonową z tryptofanem szczepi się 1 ml badanej wody bezpośrednio lub z rozcieńczenia. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 C nanosi się po ściance kilka kropel odczynnika Ehrlicha, który w obecności indolu barwi się na różowo. Część praktyczna: Wszystkie doświadczenia należy wykonać w warunkach jałowych! 1. Odczyt z posiewów mikroflory powietrza (metoda sedymentacyjna Kocha) a) policzyć ilość kolonii bakteryjnych wyrosłych na szalce z agarem i dane umieścić w tabeli zbiorczej (ćwiczenia) to samo wykonać dla agaru brzęczkowego b) obliczyć średnie wartości koloni dla bakterii i dla grzybów c) obliczyć ze wzoru Omeliańskiego ilość bakterii i grzybów w jtk w 1 m 3 powietrza d) obliczenia wraz z ich omówieniem umieścić w sprawozdaniu 3. 2. Odczyt mikroflory gleby a) policzyć ilość kolonii na poszczególnych podłożach (p. Pochona promieniowce, p. Martina grzyby strzępkowe, agar odżywczy OLB i bakterie przetrwalnikujące b) znając ilość kolonii i rozcieńczenia z których zostały wykonane posiewy obliczyć ilość poszczególnych drobnoustrojów w 1 g gleby c) wyniki (każda grupa) wypisać w zbiorczej tabeli (na ćwiczeniach) d) obliczenia, tabelę zbiorczą oraz omówienie wyników umieścić w sprawozdaniu 3. 3. Określanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych w wodzie (wodociągowej, studziennej i rzecznej) a) praca w trzech grupach b) do doświadczenia potrzebne są słoik z 99 i probówka z 9 cm 3 sterylnego płynu do rozcieńczeń, trzy rodzaje wody, 4 sterylne, puste szalki Petriego, agar odżywczy, pipety automatyczne, sterylne końcówki 4
c) posiewy wykonać wg schematu Mikrobiologia II rok Towaroznawstwo i Dietetyka 1 cm 3 badanej próbki wody 1 cm 3 1 99 cm 3 10-2 9 cm 3 10-3 1 cm 3 1 cm 3 1 1 cm 3 1 cm 3 2 Psychrofile, 20ºC, 72h Mezofile, 32ºC, 24h Psychrofile, 20ºC, 72h Mezofile, 32ºC, 24h Posiewy metodą wgłębną d) podpisane szalki odłożyć do inkubacji we wskazane miejsce 4. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową na podłożu Eijkmana (LPB) dla wody wodociągowej i rzecznej a) praca w dwóch grupach b) do doświadczeń przygotowano szereg probówek, jak dla wody pitnej 1x50 cm 3 i 5x, c) doświadczenie wykonać według schematu 50 cm 3 próbki badanej wody 50 cm 3 podłoże LPB (Eijkmana) d) podpisane probówki odłożyć do inkubacji we wskazane miejsce 5