MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 163-169 Barbara Różalska 1, Beata Sadowska 1, Marzena Więckowska-Szakiel 1, Aleksandra Budzyńska 2 Synergizm leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych wobec Candida sp., oceniany zmodyfikowaną metodą gradientowo-dyfuzyjną 1 Zakład Biologii Zakażeń, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, UŁ Kierownik Zakładu: prof. dr hab. B. Różalska 2 Laboratorium Usług Mikrobiologiczno-Technicznych, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, UŁ Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. M. Mikołajczyk-Chmiela Przedstawiono dwie modyfikacje standardowej metody oznaczania wrażliwości drożdżaków z rodzaju Candida na antymikotyki, z użyciem gradientowych testów paskowych (MIC Test Strip). Wykazano przydatność zaproponowanych modyfikacji metody w celu jej użycia do skryningowego badania efektywności połączeń leków i nowych preparatów o działaniu przeciwgrzybiczym. W ostatnich kilkunastu latach obserwuje się znaczący wzrost częstości chorób o etiologii grzybiczej, nie tylko w postaci zakażeń błon śluzowych/skóry, ale także grzybic narządowych i uogólnionych. Zarówno zakres pacjentów z grup ryzyka, jak i spektrum gatunków grzybów oportunistycznych, wciąż się powiększa. Oprócz Candida sp., do grupy ważnych czynników etiologicznych grzybic inwazyjnych należą grzyby pleśniowe z rodzajów: Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicilium, Absidia. Pomimo niewątpliwego postępu w leczeniu grzybic, zależnego w dużej mierze od właściwie dobranej terapii, wciąż istnieje zapotrzebowanie na leki silniej działające i mniej toksyczne (3, 4, 10). Skuteczność dotychczas stosowanych antymikotyków jest ograniczona ze względu, między innymi, na rozwój lekooporności grzybów (10, 13). Stąd możliwość zastosowania dla celów medycznych np. różnych produktów roślinnych budzi coraz większe zainteresowanie. Ich poszukiwanie obejmuje nie tylko identyfikację związków o bezpośrednim działaniu przeciwdrobnoustrojowym, ale także takich, które modulują lekooporność albo hamują ekspresję czynników wirulencji. Wśród związków o aktywności biostatycznej i biobójczej ważne wydają się olejki eteryczne, pod względem chemicznym - złożone mieszaniny substancji, z których przynajmniej jedna wykazuje pożądane działanie (1, 5, 7). Celem pracy było opracowanie metodyki przydatnej do skryningowego badania efektywności połączeń leków i nowych preparatów o działaniu przeciwgrzybiczym. Zastosowano w tym celu modyfikacje standardowej metody oznaczania wrażliwości drożdżaków na antymikotyki z użyciem gradientowych testów paskowych.
164 B. Różalska i inni Nr 2 MATERIAŁ I METODY Podłoża i inne odczynniki chemiczne. Podłoże hodowlane Sabouraud a (BTL, Polska); olejki roślinne: geraniowy (Oleum Geranii) i goździkowy (Oleum Caryophylli) (Pollena Aroma, Warszawa) oraz składniki olejków: cytronelal i cytral (Sigma, USA); emulgatory olejków: 1% Tween 20 (Sigma, USA) w H 2 O dest. i 96% alkohol etylowy (POCH, Polska). Szczepy Candida. Użyto szczepu Candida albicans ATCC 10231 oraz izolatu klinicznego C. glabrata G1. Drożdżaki hodowano na podłożu Sabouraud a (48 godz., 37 C). Zawiesinę komórek (blastospor) o gęstości 0,5 wg skali McFarlanda przygotowywano w H 2 O dest., posługując się pomiarem nefelometrycznym. Ocena wrażliwości Candida na olejki eteryczne w fazie nielotnej - metoda rozcieńczeń w agarze. Przed przystąpieniem do testu, wyznaczono wstępny zakres stężeń olejku geraniowego, cytronelalu i cytralu hamujących wzrost C. albicans i C. glabrata, stosując metodę mikrorozcieńczeń w bulionie, w modyfikacji własnej (2). Zakres badanych stężeń olejków wynosił 1,56-0,006 % (v/v). W następnym etapie zawężono przedział stężeń i ustalono wartość MIC preparatów w metodzie rozcieńczeń w podłożu agarowym Sabouraud a. W tym celu do upłynnionego podłoża agarowego dodawano przygotowane roztwory olejków w 1% Tween 20, uzyskując ostateczne ich stężenie w zakresie 0,156-0,019% (v/v). Po zastygnięciu podłoża dokonywano powierzchniowego posiewu C. albicans lub C. glabrata. Kontrolę dodatnią (kontrola wzrostu Candida sp.) stanowiły: podłoże Sabouraud a bez dodatku olejku oraz podłoże Sabouraud a z dodatkiem emulgatora olejków. Wszystkie próby wykonywano w trzech powtórzeniach. Po inkubacji (48 godz., temp. 37 o C), dokonywano oceny stopnia intensywności wzrostu Candida sp. w porównaniu z kontrolą. Jako wartość MIC przyjmowano stężenie olejku powodujące całkowite zahamowanie wzrostu. Ocena wrażliwości Candida na olejki eteryczne w fazie lotnej - metoda vapour. Wyznaczono zakres stężeń olejku goździkowego i cytronelalu użytych w fazie lotnej, hamujących wzrost C. albicans i C. glabrata. Zastosowano metodę odwróconej szalki Petri ego (6, 14), ze zmianami własnymi; na wieczku szalki o średnicy 9 cm umieszczano krążek bibuły nasączony 1 ml roztworu badanego olejku w 10% alkoholu etylowym. Uzyskane stężenie olejku w fazie lotnej wynosiło 0,142 0,017% (v/v), w przeliczeniu na objętość przestrzeni nad podłożem z posiewem powierzchniowym Candida sp. Kontrolę pozytywną (kontrola wzrostu Candida sp.) stanowiły: podłoże Sabouraud a z posiewem powierzchniowym i nałożonym na wieczko krążkiem bibuły nasyconym 1 ml emulgatora olejków. Wszystkie próby wykonywano w trzech powtórzeniach. W celu utrzymania stałego stężenia lotnego olejku w czasie inkubacji, szalki oklejano parafilmem i umieszczano w szczelnie zamkniętych pojemnikach. Inkubację prowadzono przez 48 godz. w temp. 37 o C. Jako wartość MIC przyjmowano stężenie olejku powodującego całkowite zahamowanie wzrostu. Wyznaczenie MIC flukonazolu, worikonazolu oraz ocena synergistycznego działania antymikotyków i olejków eterycznych, z zastosowaniem testu paskowego - metoda w modyfikacji własnej. A) Test kontrolny: najmniejsze stężenie antymikotyku hamujące wzrost Candida sp. (MIC) określano standardową metodą gradientowo-dyfuzyjną. Stosowano paski MIC Test Strip (LiofilChem, Włochy) zawierające flukonazol (0,016-256 mg/l) lub worikonazol (0,002-32 mg/l), nałożone na powierzchniowy posiew drożdżaków na podłożu agaro-
Nr 2 Synergizm preparatów aktywnych wobec Candida sp. 165 wym Sabouraud a. Wykonanie testu i interpretację wyników przeprowadzono zgodnie z zaleceniem producenta (wartość MIC wyznaczano jako punkt przecięcia granicy zahamowania wzrostu ze skalą paska, odczytu dokonywano wtedy, gdy po inkubacji wzrost drobnoustrojów był wyraźnie widoczny, a strefa zahamowania wzrostu wyraźnie zarysowana). B) Ocena działania synergistycznego - metoda rozcieńczeń w agarze. Dokonano posiewu powierzchniowego C. albicans i C. glabrata na podłoże agarowe Sabouraud a zawierające olejek geraniowy (½, ¼ MIC), cytral (½ MIC) lub cytronelal (½ MIC). Następnie nałożono paski zawierające flukonazol albo worikonazol. Po inkubacji (48 godz., 37 o C) wyznaczano wartość MIC leków. C) Ocena działania synergistycznego - metoda vapour. Dokonano posiewu powierzchniowego C. albicans i C. glabrata na podłoże agarowe Sabouraud a. Następnie nałożono paski zawierające flukonazol lub worikonazol. Na wieczko szalek nałożono krążki bibuły nasączone olejkiem goździkowym albo cytronelalem w stężeniu ½ MIC. Po inkubacji (48 godz., 37 o C) wyznaczano wartość MIC leków. WYNIKI I DYSKUSJA Badano wrażliwość Candida albicans i C. glabrata na wybrane leki antymikotyczne, w ich połączeniu z olejkami eterycznymi geraniowym (Oleum Geranii) lub goździkowym (Oleum Caryophylli) oraz w połączeniu z ich najbardziej aktywnymi składnikami (8, 9, 11, 12). Do oceny efektu synergistycznego flukonazolu oraz worikonazolu i olejków (w fazie płynnej lub lotnej), zastosowano standardową metodę paskową - gradientowo-dyfuzyjną, w modyfikacjach własnych. Wartość MIC olejku geraniowego, cytralu i cytronelalu, ustalona w metodzie rozcieńczeń w agarze wynosiła 0,078% (v/v), zarówno wobec C. albicans, jak i wobec C. glabrata. W teście oceniającym ich działanie synergistyczne z flukonazolem bądź worikonazolem zastosowano stężenia subinhibicyjne: 0,039% i 0,019% (v/v). Wartości MIC flukonazolu i worikonazolu wyznaczane z użyciem MIC Test Strip, a także ich wartości uzyskane w teście badania synergizmu z olejkami, przedstawiono w Tabeli I i na Ryc.1. Stwierdzono, że olejek geraniowy użyty w teście rozcieńczeń w agarze w stężeniu ½ MIC wobec C. albicans, spowodował spadek wartości MIC flukonazolu z 16,0 mg/l do 0,064 mg/l oraz worikonazolu z 0,125 mg/l do 0,006 mg/l. Ten sam olejek użyty w stężeniu ¼ MIC wywołał słabszy, ale nie mniej zachęcający efekt. Podobny stopień redukcji wartości MIC antymikotyków uzyskano w badaniu wrażliwości C. glabrata. W tym przypadku, zaobserwowano spadek wartości MIC flukonazolu z 8,0 mg/l do 0,19 mg/l oraz worikonazolu z 0,125 mg/l do 0,006 mg/l. Cytronelal i cytral użyte w stężeniach subinhibicyjnych wykazywały również działanie skuteczne, chociaż słabsze (Tabela I). Wychodząc z założenia, iż w niektórych olejkach eterycznych frakcję najbardziej aktywną przeciwdrobnoustrojowo stanowią związki lotne, dokonano następnej modyfikacji metody. Dla wykazania synergizmu antymikotyków i olejków/składników w fazie lotnej wykorzystano metodę odwróconej szalki Petri ego. Stworzono kontrolowaną ilościowo mikroatmosferę nad podłożem z posiewem powierzchniowym Candida spp. W tym celu nasycono krążek bibuły roztworem olejku/składnika w stężeniu subinhibicyjnym (wyznaczonym wcześniej w tej metodzie) i umieszczono na wieczku szalki. Po inkubacji (48 godz.,
166 B. Różalska i inni Nr 2 Tabela. I. Synergistyczne działanie flukonazolu i worikonazolu z geraniowym olejkiem eterycznym i jego składnikami. Ocena metodą rozcieńczeń w agarze z wykorzystaniem testów paskowych MIC Test Strip. Połączenie związków MIC [mg/l] C. albicans ATCC 10231 C. glabrata G1 FLUKONAZOL (K) 12,0 8,0 + ½ MIC Oleum Geranii 0,064 0,19 + ¼ MIC Oleum Geranii 0,25 0,5 + ½ MIC cytronelal 1,5 0,75 + ½ MIC cytral 2,0 1,5 WORIKONAZOL 0,125 0,125 + ½ MIC Oleum Geranii 0,006 0,006 + ¼ MIC Oleum Geranii 0,016 0,016 + ½ MIC cytronelal 0,047 0,023 + ½ MIC cytral 0,094 0,047 A C B D Ryc. 1. Minimalne stężenie hamujące wzrost Candida albicans ATCC 10231 oceniane testem paskowym na podłożu bez lub z dodatkiem olejku geraniowego (metoda rozcieńczeń w agarze). A - MIC flukonazolu (kontrola); B MIC flukonazolu (½ MIC olejku w podłożu); C - MIC worikonazolu (kontrola); D - MIC worikonazolu (½ MIC olejku w podłożu).
Nr 2 Synergizm preparatów aktywnych wobec Candida sp. 167 37 o C) uzyskano efekt synergistyczny antymikotyków i frakcji lotnej olejków przejawiający się kilkakrotnym obniżeniem wartości MIC flukonazolu oraz worikonazolu dla badanych gatunków - C. albicans i C. glabrata. Efekt działania olejków w fazie lotnej był słabszy, niż stwierdzony w metodzie rozcieńczeń w agarze, ale znaczący. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli II i na rycinie 2. Tabela. II. Synergistyczne działanie flukonazolu i worikonazolu z goździkowym olejkiem eterycznym i jego składnikami. Ocena metodą vapour z wykorzystaniem testów paskowych MIC Test Strip. Połączenie związków MIC [mg/l] C. albicans ATCC 10231 C. glabrata G1 FLUKONAZOL (K) 12,0 8,0 + ½ MIC Oleum Caryophylli 1,0 1,5 + ½ MIC cytronelal 2,0 1,5 WORIKONAZOL 0,125 0,125 + ½ MIC Oleum Caryophylli 0,047 0,064 + ½ MIC cytronelal 0,064 0,094 A C B D Ryc. 2. Minimalne stężenie hamujące wzrost Candida glabrata G1 oceniane testem paskowym w obecności fazy lotnej olejku goździkowego (metoda vapour ). A - MIC flukonazolu (kontrola); B MIC flukonazolu (½ MIC olejku w mikroatmosferze); C - MIC worikonazolu (kontrola); D - MIC worikonazolu (½ MIC olejku w mikroatmosferze).
168 B. Różalska i inni Nr 2 Wybór akurat tych antymikotyków do niniejszego badania synergizmu, z zastosowaniem zmodyfikowanej metody paskowej jest uzasadniony faktem, iż azole a szczególnie triazole nowej generacji, uważane są za jedne z najbardziej skutecznych leków przeciwgrzybiczych. Mimo to dane epidemiologiczne wskazują na rosnącą częstość izolowania szczepów opornych na te leki, należących głównie do grupy Candida non-albicans (3, 4). Uzasadnia to potrzebę wzmocnienia ich działania terapeutycznego przez zastosowanie związków wykazujących z nimi działanie synergistyczne lub addytywne. W opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych, oprócz propozycji samodzielnego zastosowania związków naturalnych wchodzących, m.in. w skład układu obronnego roślin i zwierząt, bierze się właśnie pod uwagę ich łączenie z antybiotykami lub antyseptykami (3, 7, 14). W tym kontekście zachodzi potrzeba dysponowania prostą metodą skryningową do poszukiwania wśród związków naturalnych lub syntetycznych tych o pożądanych cechach. Badania przedstawione w prezentowanej pracy, w których wykazano przydatność zmodyfikowanej metody gradientowo- -dyfuzyjnej do oceny synergizmu leków przeciwgrzybiczych i olejków eterycznych oraz ich składników, mieszczą się w powyższym nurcie. Z uwagi na zastosowanie standardowych pasków z gradientem stężeń chemioterapeutyku, zaproponowana metodyka pozwala w sposób wiarygodny zauważyć nawet niewielką zmianę wartości MIC, odzwierciedlającą efekt synergizmu. Można zaproponować zastąpienie podłoża Sabouraud a podłożem Agar RPMI, jeśli przedmiotem badań są grzyby izolowane bezpośrednio z materiału klinicznego. Metodyka opisana powyżej może być równie użyteczna w badaniach dotyczących synergistycznego działania dowolnych antybiotyków, antyseptyków i nowych związków potencjalnie aktywnych wobec bakterii. B. Różalska, B. Sadowska, M. Więckowska-Szakiel, A. Budzyńska The synergism of antifungals and essential oils against Candida spp. evaluated by a modified gradient-diffusion method. SUMMARY The usefulness of modified method of MIC Test Strip, for determining the synergistic effect of essential oils in the liquid or volatile phase with fluconazole and voriconazole, was evaluated. Geranium oil used against C. albicans in agar dilution test, at a concentration of ½ MIC caused a drop in the value of fluconazole MIC from 12.0 mg/l to 0.064 mg/l and voriconazole from 0.125 mg/l to 0.006 mg/l. A similar effect of drug combinations with essential oils was obtained in the case of C. glabrata study. Volatile Clove oil and cytronelal, applied in submic concentrations, also caused a reduction of fluconazole and voriconazole MICs. Thus, utility of this simple methods developed by us for testing the effectiveness of combinations of known drugs and new compounds with antifungal activity, has been confirmed. PIŚMIENNICTWO 1. Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils a review. Food Chem Toxicol 2008; 46: 446-75.
Nr 2 Synergizm preparatów aktywnych wobec Candida sp. 169 2. Budzyńska A, Więckowska-Szakiel M, Kalemba D, Sadowska B, Różalska B. Weryfikacja parametrów metodycznych oznaczania aktywności przeciwbakteryjnej olejków eterycznych. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 281-7. 3. Denning DW, Hope WW. Therapy for fungal diseases: opportunities and priorities. Trends Microbiol 2010; 18: 195-202. 4. Dzierżanowska D, Dzierżanowska-Fangrat K. Nowoczesne leczenie inwazyjnych zakażeń grzybami z rodzaju Candida wytyczne IDSA 2009. Zakażenia 2009; 5: 53-62. 5. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extract. J Appl Microbiol 1999; 86: 985-90. 6. Inouye S. Comparative study of antimicrobial and cytotoxic effects of selected essential oils by gaseous and solution contacts. Int J Aromather 2003; 1: 33-41. 7. Kalemba D, Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr Med Chem 2003; 10: 813-29. 8. Kędzia A. Ocena działania przeciwbakteryjnego olejku goździkowego (Oleum Caryophylli). Postępy Fitoterapii 2007; 2: 66-70. 9. Kędzia A. Przeciwgrzybicze działanie olejku geraniowego (Oleum Geranii). Postępy Fitoterapii 2010; 4: 217-21. 10. Kontoyiannis DP, Lewis RE. Antifungal drug resistance of pathogenic fungi. Lancet 2002; 359: 1135-44. 11. Maruyama N, Takizawa T, Ishibashi H i inni. Protective activity of geranium oil and its component, geraniol, in combination with vaginal washing against vaginal candidiasis in mice. Biol Pharm Bull 2008; 31: 1501-6. 12. Pinto E, Vale-Silva L, Cavaleiro C, Salgueiro L. Antifungal activity of the clove essential oil from Syzygium aromaticum (Eugenia caryophyllus) on Candida, Aspergillus and dermatophyte species. J Med Microbiol 2009; 58: 1454-62. 13. Rogers TR. Antifungal drug resistance: limited data, dramatic impact. Int J Antimicrob Agents 2006; 27: 7-11. 14. Tullio V, Nostro A, Mandras N i inni. Antifungal activity of essential oils against filamentous fungi determined by broth microdilution and vapour contact methods. J Appl Microbiol 2007; 102: 1544-50. Otrzymano: 29 IV 2011 r. Adres Autora: 90-237 Łódź, ul. Banacha 12/16, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Uniwersytetu Łódzkiego