Najnowsze metody analityczne stosowane w analizie specjacyjnej Danuta Barałkiewicz, Anetta Hanć, Izabela Komorowicz, Karol Sęk Pracownia Analizy Spektroskopowej Pierwiastków, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
Specjacja wg. IUPAC, 2000 r. SPECJACJA (ang. speciation) jest to występowanie różnych fizycznych i chemicznych form danego pierwiastka, indywiduów (ang. species) w badanym materiale ANALIZA SPECJACYJNA (ang. speciation analysis) to identyfikacja form fizycznych i chemicznych pierwiastka i ich ilościowe oznaczanie w badanym obiekcie. FRAKCJONOWANIE (ang. fracionation) w ramach badania specjacji określa się jedynie grupy związków danego pierwiastka (-ów) o określonych właściwościach D.Templeton, A. Ariese, R. Cornelis, L. G. Danielsson, H. Muntau, H. P. van Leeuwen, R. Łobinski, Pure Appl. Chem., 72, 8 (2000) 1453-1470.
Dlaczego specjacja? Toksyczność MeHg, EtPb, As +3, Cr +6 Biodostępność Fe +3, Fe +2, SeCyst, SeMet Metabolizm AsB, AsC,
Udział poszczególnych pierwiastków w analizie specjacyjnej
Podejście analityczne AAS ICP OES DETEKCJA: ICP MS Elektrochromatografia HR ICP MS Elektroforeza kapilarna ROZDZIELANIE: IDENTYFIKACJA: HPLC GC ESI MS/MS MALDI - żelowa - anionowymienna - kationowymienna - w układzie faz odwróconych NMR Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ICP-MS Gaz reakcyjny Plazma HPLC -żelowa (SEC) Analizator Detektor mas Soczewki skupiające DRC -jonowymienna (IEC) - z odwróconym układem faz (RP)
Analiza specjacyjna arsenu Toksyczność: As (III) > As (V) > MMA > DMA > AsB, AsC hiperpigmentacja, zmiany skórne, rogowacenie naskórka, zaburzenia układu krążenia, nowotwory skóry, pęcherza moczowego, nerek i wątroby. zakwalifikowany przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem do grupy I (substancje rakotwórcze dla człowieka) As(III) GSH Błona komórkowa Żółć As(III) Metylotransferaza S-adenozynometioniny GSH As(III lub V) Jednometylowa pochodna MMA MMA Mocz Metylotransferaza S-adenozynometioniny DMA Dimetylowa pochodna DMA
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 Analiza specjacyjna arsenu system do specjacji Chromera kolumna anionowymienna 4,6mm 150mm, 5 µm faza stacjonarna styren/diwinylobenzen, grupy funkcyjne trimetyloamoniowe -N+(CH 3 ) 3 faza ruchoma NH 4 NO 3 /NH 4 H 2 PO 4, prędkość przepływu 1mL/min czas analizy 10 min obj. nastrzyku próbki 50 µl temperatura pracy kolumny pokojowa możliwe interferencje - 40 Ar 35 Cl +, gaz reakcyjny (DRC) - NH 3 przepływ gazu reakcyjnego 0,1mL/min korekcja matematyczna -0,00024* 35 Cl FORMY SPECJACYJNE ARSENU Związki nieorganiczne Kwas arsenowy (III) As (III) As(OH) 3 Kwas arsenowy (V) As (V) AsO(OH) 3 Kwas monometyloarsenowy Związki organiczne MMA (V) CH 3 AsO(OH) 2 Kwas dimetyloarsenowy DMA (V) (CH 3 ) 2 AsO(OH) Arsenobetaina AsB (CH 3 ) 3 As + CH 2 COOH Arsenocholina AsC (CH 3 ) 3 As + CH 2 CH 2 OH Tlenek trimetyloarsenowy Kwas 4- aminofenyloarsenowy TMAO (CH 3 ) 3 AsO p-asa C 6 H 4 NH 2 AsO(OH) 2 Tetrametyloarsen Me 4 As + (CH 3 ) 4 As + Arsenolipidy AsL (CH 3 ) 3 As + CH 2 CHOHCOOH Arsenocukry AsS
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 IEC-ICP-MS Analiza specjacyjna arsenu
IEC-ICP-MS Analiza specjacyjna arsenu w próbkach wodnych (odcieki ze składowiska odpadów) Roztwór wzorcowy Próbka rzeczywista M.Ponthieu i in. Water Research 41 (2007) 3177-3185. Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
Analiza specjacyjna chromu
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 Analiza specjacyjna chromu system do specjacji Chromera kolumna pracująca w układzie odwróconych faz 3x3 CR C8 PerkinElmer faza stacjonarna C8 (fazy związane) faza ruchoma 1 mm TBAOH + 0,6 mm EDTA + 2% MeOH; ph=6,9 prędkość przepływu 1,5 ml/min czas analizy 3,5 min obj. nastrzyku próbki 50 µl temperatura pracy kolumny pokojowa możliwe interferencje 40 Ar 12 C, 36 Cl 16 O gaz reakcyjny (DRC) NH 3 przepływ gazu reakcyjnego 0,50 ml/min korekcja matematyczna -0,063703* 35 Cl FORMY SPECJACYJNE CHROMU Związki nieorganiczne Chromiany Cr (VI) CrO 4 2- Dichromiany Cr (VI) Cr 2 O 7 2- Wodorochromiany Cr (VI) HCrO 4 - Wodorotlenek chromu (III) Cr (III) Cr(OH) 3 Heksa-akwachrom (III) Cr (III) [Cr(H 2 O) 6 ] 3+ Kompleksy z kwasami fulwowymi humusowymi Związki organiczne Cr (III) - Amino kompleksy Cr (III) -
Analiza specjacyjna chromu Schemat procedury rozdziału chromatograficznego form specjacyjnych chromu Przygotowanie eluentu Kondycjonowanie kolumny chromatograficznej eluentem (raz dziennie przez 30 min, przepływ 1 ml/min) ARGON KOMPUTER Przygotowanie próbki do analizy: próbkę przesączyć następnie rozcieńczyć eluentem w stsunku 1:1 A B Rozdział chromatograficzny w układzie odwróconych faz i zastosowaniem techniki par jonowych (3,5 min) POMPA C8 SPEKTROMETR MAS (ICP-MS) Płukanie kolumny (15 min 100% woda, 15 min 95/5 woda/metanol)
Analiza specjacyjna chromu Aby przeprowadzić analizę specjacyjną chromu w jednej próbce, potrzeba: 50µL próbki; 5,25 ml eluentu oraz dodatkowo raz dziennie 30 ml eleuentu na kondycjonowanie kolumny Cr-EDTA - Cr 2 O 7 2-
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 Podejście analityczne AAS ICP OES DETEKCJA: ICP MS Elektrochromatografia HR ICP MS Elektroforeza kapilarna ROZDZIELANIE: IDENTYFIKACJA: HPLC GC ESI MS/MS MALDI - żelowa - anionowymienna - kationowymienna - w układzie faz odwróconych NMR
Fitochelatyny (γ-glu-cys)n-gly gdzie n=2-11 należą do grupy peptydów wytwarzanych przez rośliny w odpowiedzi na stres związany z wysokim stężeniem jonów metali w komórce. + H N - CH - CH - CH - C - NH- CH- C - NH - CH - C 3 2 2 = - C- 0 0 - Glu Cys Gly 0 0 = Glutation - CH 2 - SH = 2 - = 0 0 -
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 SEC-ICP-MS łubin Schemat przygotowania do analizy próbek korzeni łubinu poddanych ekspozycji na Cd, Pb i CdPb przez 96h. korzeń, łodyga, liść mycie w wodzie podwójnie destylowanej zamrażanie w ciekłym azocie, przechowywanie w -80 C ekstrakcja 30 mm Tris-HCL (ph 7.4) wytrząsanie w łaźni ultradźwiękowej 15 min. podwójne wirowanie 15 min. filtracja roztworu z nad osadu sączek strzykawkowy 0.45µm
HPLC-ESI-IT-MS n groch Schemat procedury przygotowania próbki do oznaczania związków tiolowych techniką HPLC-ESI-IT-MS n. korzeń, łodyga, liść mycie w wodzie podwójnie destylowanej ESI-IT-MS zamrażanie w ciekłym azocie, przechowywanie w -80 C ekstrakcja 5% SSA w temp. 0 C podwójne wirowanie w temp. 4 C filtracja roztworu znad osadu sączek strzykawkowy 0.45µm
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ESI-IT-MS n Widma mas otrzymane w wyniku analizy ekstraktów korzeniowych grochu kontrola
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ESI-IT-MS n Widma mas otrzymane w wyniku analizy ekstraktów korzeniowych grochu kadm i ołów
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ESI-IT-MS n Widma fragmentacyjne MS 4 jonów molekularnych [M+H]+ o wartościach parametru m/z równych 540, 772 i 1004 odpowiadające PC 2, PC 3 i PC 4 otrzymane z zastosowaniem pułapki jonowej jako analizatora mas PC 2 PC 3 PC 4
LA ICP MS ICP MS LA Ar PLAZMA WYSOKOTEMPERATUROWA Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
LA ICP MS MATERIAŁ BADAWCZY rośliny grochu po 96h inkubacji 0,1mM roztworami: Pb(NO 3 ) 2, CdCl 2, CuSO 4, ZnSO 4 blaszka liścia przekrój poprzeczny przez łodygę przekrój poprzeczny przez strefę włośnikową korzenia Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
LA ICP MS rozmieszczenie Cd i Cu w przekroju poprzecznym korzenia grochu 0,3 0,2 0,1 0 63Cu/13C 1 50 99 148 197 246 295 344 393 442 491 KONTROLA Intensywność sygnału [cps] 200 111Cd/13C 111Cd/13C 0,1mM roztwór CdCl 2 150 100 50 0 1 50 99 148 197 246 295 344 393 50 0,1mM roztwór CuSO 4 63Cu/13C 40 30 20 10 0 200 1 50 99 148 197 246 295 344 393 442 491 540 150 63Cu/13C 111Cd/13C 100 0,1mM roztwór CuSO 4 + CdCl 2 50 0 1 50 99 148 197 246 295 344 393 442 491 Czas [s] epiderma + kora pierwotna endoderma epiderma + kora pierwotna
PODSUMOWANIE Pojedyncza metoda bardzo rzadko pozwala na całkowite rozwiązanie problemu analitycznego związanego z badaniem specjacji. Należy łączyć informacje uzyskane z różnych metod analitycznych.
Pobieranie, akumulacja i transport metali w roslinach 1 2 3 4 5 1. Przemieszczanie się metali przez błonę komórkową do wnętrza 2. Metal adsorbowany na powierzchni korzeni komórki 3 Unieruchomienie w wakuoli frakcji metali zaabsorbowanej w korzeniach 4 Transport metali przez błonę komórkową do naczyń przewodzących korzenia 5 Przeniesienie metali z korzeni do części nadziemnych łodyga, liście
SEC-ICP-MS Analiza specjacyjna Cd i Pb w próbkach roślinnych Schemat procedury przygotowania próbki do analizy SEC z detekcją ICP-MS w układzie on-line korzeń, łodyga, liść mycie w wodzie podwójnie destylowanej KOMPUTER zamrażanie w ciekłym azocie, przechowywanie w -80 C ARGON ekstrakcja 30 mm Tris-HCL (ph 7.4) A B wytrząsanie w łaźni ultradźwiękowej 15 min. POMPA podwójne wirowanie 15 min. KOLUMNA SEC SPEKTROMETR MAS (ICP MS) filtracja roztworu z nad osadu sączek strzykawkowy 0.45µm
SEC-ICP-MS Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
Analiza specjacyjna chromu Przygotowanie Eluentu: roztwór TBAOH+EDTA doprowadzić do ph=6,9, następnie dodać metanol do 2% v/v, eluent przesączyć przez sączek o średnicy otworów 0,45 µm Kondycjonowanie kolumny chromatograficznej: płukanie kolumny eluentem przez 30 min w przepływie 1 ml/min Przygotowanie wzorca: wzorzec roboczy rozcieńczyć eluentem, wzorzec przesączyć przez sączek strzykawkowy (0,45µm) Rozdzielanie chromatograficzne przebiega w warunkach izokratycznych z wykorzystaniem techniki par jonowych Płukanie kolumny: Po zakończeniu pracy, kolumnę należy płukać Przez 15 min wodą a następnie 15 min 95/5 woda/meoh
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ESI-IT-MS/MS Widma mas otrzymane w wyniku analizy ekstraktów korzeniowych grochu
HPLC-ESI-IT-MS/MS Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009
Sympozjum Zielona Chemia Nowe Wyzwania Analityki, Ślesin 11 13 maja 2009 HPLC-ESI-IT-MS/MS Widma mas otrzymane w wyniku analizy ekstraktów korzeniowych grochu
HPLC-UV-Vis z derywatyzacją za kolumną groch Schemat procedury przygotowania próbki do oznaczania związków tiolowych techniką HPLC-UV-Vis z derywatyzacją za kolumną. korzeń, łodyga, liść mycie w wodzie podwójnie destylowanej zamrażanie w ciekłym azocie, przechowywanie w -80 C ekstrakcja 5% SSA w temp. 0 C podwójne wirowanie w temp. 4 C filtracja roztworu znad osadu sączek strzykawkowy 0.45µm
HPLC-UV-Vis z derywatyzacją za kolumną