Ćwiczenie 7. Walidacja metody redoksymetrycznego oznaczania kwasu askorbowego w suplementach diety i w moczu osób suplementowanych witaminą C

Ćwiczenie 7 Walidacja metody redoksymetrycznego oznaczania kwasu askorbowego w suplementach diety i w moczu osób suplementowanych witaminą C Literatura 1. Bulska E. Metrologia chemiczna, sztuka prowadzenia pomiarów. Malamut, Warszawa 2008. 2. Namieśnik J., Konieczka P., Zygmunt B. Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów analitycznych. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 2009, Warszawa. 3. Cygański A. Chemiczne metody analizy ilościowej. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 2005. 4. Walidacja metod analizy chemicznej, pod redakcją Pawlaczyk J, Zając M., Wydawnictwo Naukowe Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań 2005. Celem ćwiczenia jest opanowanie zagadnień teoretycznych dotyczących procesu walidacji metod analitycznych oraz praktyczne poznanie procesu walidacji na przykładzie walidacji metody miareczkowania kwasu askorbowego zawartego w preparatach farmaceutycznych. Zakres materiału: podstawy teoretyczne dotyczące walidacji metod analitycznych [definicja walidacji, parametry podlegające walidacji, statystyczne sposoby interpretacji wyników, zagadnienia statystyczne: średnia arytmetyczna, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe, przedziały ufności, test t-student, test jednorodności dwóch wariancji (F-Snedecora). Zasada redoksymetrycznego oznaczania kwasu askorbowego przy użyciu 2,6-dichloroindofenolu oraz biologiczne znaczenie kwasu askorbowego. Zagadnienia z wykładu dotyczącego walidacji metod analitycznych. I. Część teoretyczna Walidacja metody analitycznej Walidacja procedury pomiarowej jest jednym z elementów zapewniających jakość uzyskiwanych wyników pomiaru. Walidacja jest to działanie mające na celu potwierdzenie w sposób udokumentowany, że zostały spełnione założone wymagania dotyczące metody analitycznej. Walidacja ma na celu określenie parametrów analitycznych danej procedury pomiarowej w celu podjęcia decyzji o przydatności danej procedury do zamierzonego zastosowania. Obowiązek walidacji metod analitycznych narzuca na producentów substancji aktywnych i/lub produktów leczniczych Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania. Walidacja jest także wymagana przez urzędy państwowe w ramach rejestracji leków. Szczegółowe wymagania dotyczące walidacji metod analitycznych regulują wytyczne ICH (ang. The Internaltional Conference of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use): ICH Q2 (R1) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. Przed przystąpieniem do procesu walidacji, należy określić przeznaczenie metody analitycznej oraz cechy charakterystyczne (tj. rodzaj oznaczanego składnika, poziom stężeń, rodzaj matrycy, obecność interferentów). Należy także określić, które parametry charakteryzujące metodę powinny być wyznaczone, a następnie wyznaczyć wartość tych parametrów i na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem wyników analitycznych. Do najważniejszych parametrów podlegających procesowi walidacji zaliczamy: liniowość dokładność 1

precyzję (odtwarzalność, powtarzalność) selektywność specyficzność granicę wykrywalności granicę oznaczalności Liniowość metody analitycznej określa możliwość uzyskania wartości mierzonej, jako wprost proporcjonalnej do stężenia analitu. Dlatego wykres powyższej zależności pownien mieć, w określonym przedziale stężeń, przebieg prostoliniowy. Zależność tą nazywamy krzywą wzorcową i wyrażamy wzorem: gdzie: y wartość mierzona x stężenie analitu a nachylenie krzywej wzorcowj b przesunięcie krzywej wzorcowej y = ax + b 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Krzywa wzorcowa y = 0,0099x + 0,0023 R² = 0,999 0 5 10 15 20 25 30 35 witamina C [mg/ml] W celu znalezienia zakresu liniowego krzywej wzorcowej przeprowadza się pomiary próbek roztworów wzorcowych na co najmniej 5 poziomach stężeń (najczęściej wykonując po 3 równoległe pomiary dla każdego poziomu). Dobór stężeń analitu w próbkach roztworów wzorcowych powinien obejmować zakres od 50 do 150% w odniesieniu do wartości oczekiwanej wyników analizy. Dokładność metody określa stopień zgodności wyników uzyskanych z zastosowaniem danej metody analitycznej z wynikami rzeczywistymi (oczekiwanymi). Miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej błędu systematycznego. Dokładność można wyznaczyć przeprowadzając badanie odzysku. Polega to na dodawaniu określonej ilości analitu do próbki, następnie oznaczeniu zawartość dodanego analitu i obliczenie odzysku na podstawie wzoru: R = x i μ i 100% gdzie: x i oznaczona ilość analitu w badanej próbce; µ i znana ilość analitu w badanej próbce Badanie odzysku powinno być przeprowadzone na podstawie co najmniej 9 równoległych oznaczeń na 3 różnych poziomach zawartości oznaczanego składnika (co najmniej po 3 oznaczenia na każdym poziomie stężeń). Metoda jest uznawana za dokładną jeżeli odzysk wynosić 95-105%. 2

Precyzja metody charakteryzuje rozrzut uzyskanych wyników oznaczeń wokół wartości średniej. Miarą precyzji jest względne odchylenie standardowe lub współczynnik zmienności W z (jeżeli wartość ta zostanie wyrażona w procentach). Precyzję określa się dla próbek na danym stałym poziomie stężeń. Precyzja obejmuje takie pojęcia jak: powtarzalność i odtwarzalność (wewnątrzlaboratoryjną i zewnątrzlaboratoryjną). Powtarzalność określa precyzję wyników uzyskiwanych w tych samych warunkach, czyli w danym laboratorium, za pomocą danej metody, dla danej próbki przez jednego analityka w krótkich odstępach czasu. Wartość odchylenia standardowego można obliczyć poprzez przeprowadzenie 6 niezależnych oznaczeń analitu w próbkach wzorcowych na poziomie stężenia odpowiadającego stężeniu w próbce rzeczywistej. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna dotyczy wyników uzyskanych daną metodą, w danym laboratorium, w dłuższych odstępach czasu, jak również przy badaniach prowadzonych przez więcej niż jednego analityka. Odtwarzalność zewnątrzlaboratoryjna pozwala natomiast ocenić, czy dana metoda prowadzi do tych samych wyników w innym laboratorium, z różnymi analitykami, na innej aparaturze z zachowywaniem parametrów wymaganych w opisie metody. Selektywność oznacza stopień, w jakim inne substancje obecne w próbce wpływają na sygnał analityczny. Pojęcie selektywności jest związane z oceną, na ile otrzymany wynik analityczny powstał wyłącznie w wyniku obecności analitu, a nie w wyniku obecności innych substancji o podobnych cechach chemicznych lub fizycznych. Oceny selektywności można dokonać na podstawie analizy roztworów substancji wzorcowej niezawierającej i zawierającej potencjalne substancje interferujące. Granica wykrywalności (LOD) - jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, która może być stwierdzona, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością za pomocą danej metody. Granica oznaczalności (LOQ) jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, jaka może być ilościowo oznaczona za pomocą danej metody z odpowiednią precyzją i dokładnością. Oczywistym jest, że analityk powinien stosować metody analityczne i procedury pomiarowe właściwe do celu prowadzonych badań. Preferowane są metody opublikowane w normach międzynarodowych lub krajowych. Zalecenie takie wynika przede wszystkim z faktu, iż metody znormalizowane przeszły procesy walidacji i są uznane za optymalne dla uzyskania wiarygodnych wyników. Do procedur, które wymagają walidacji zaliczamy procedury nie posiadające statusu normy czyli: - opracowania własne - procedury pochodzące z literatury naukowej metody o statusie normy ale, gdy: - są stosowane poza zakresem określanym przez normę, - metoda uległa zmianom, które mogą mieć wpływ na wynik oznaczenia (np. wymiana aparatu, inny rodzaj próbek), - kontrola jakości wykazała zmienność jej parametrów w czasie. Kwas askorbowy/witamina C w organizmach żywych Witaminy są grupą związków niezbędnych dla rozwoju i funkcjonowania organizmów żywych. Jedną z najważniejszych witamin dla człowieka jest kwas askorbowy zwany witaminą C. Ponieważ organizm człowieka nie ma zdolności wytwarzania kwasu askorbowego, musi go otrzymywać wraz z pożywieniem. Witamina C podawana doustnie jest dobrze wchłaniania. Z fizjologicznej dawki wynoszącej do 180 mg na dobę wchłania się w 70-80%. Profilaktycznie dorośli powinni przyjmować od 100-500mg witaminy C 3

na dobę, w kilku dawkach. Po podaniu bardzo dużych dawek lek jest wydalony w postaci niezmienionej w moczu i kale. Witamina C jest uważana za jeden z najaktywniejszych antyoksydantów: chroni organizm przed wpływem wolnych rodników, które są odpowiedzialne za patogenezę wielu chorób przyczynia się do stabilizacji i ochrony błony komórkowej, co wspomaga system immunologiczny organizmu. Witamina C jest związkiem niezbędnym dla organizmu. Bierze udział w syntezie kolagenu i substancji międzykomórkowej jest niezbędna do rozwoju chrząstki, kości, zębów a także w leczeniu ran. Bierze udział w przekształcaniu kwasu foliowego do kwasu folinowego, ułatwia wchłanianie żelaza z przewodu pokarmowego i uczestniczy w powstawaniu hemoglobiny i dojrzewaniu erytrocytów. Przenika szybko do tkanek, wiąże się z białkami osocza w ok 25%. Niedobór kwasu askorbowego objawia się wolnym gojeniem ran, bladością skóry i błon śluzowych, zaburzeniami w przemianie kwasów tłuszczowych, osłabieniem naczyń włosowatych i możliwością powstawania mikrowylewów w różnych narządach, zmniejszeniem odporności na infekcje oraz występowaniem szkorbutu (obrzęki i krwawienie z dziąseł oraz wypadanie zębów). Natomiast nadmiar witaminy C wydalany jest z moczem. Witamina C występuje w dwóch formach, przy czym właściwości witaminy zachowują obie formy: forma zredukowana kwas askorbowy i forma utleniona kwas dehydroaskorbowy. Kwas askorbowy ma właściwości silnie redukujące, ponieważ ugrupowanie pomiędzy C-2 i C-3, zwane endiolowym, łatwo oddaje dwa protony i dwa elektrony, przechodząc w ugrupowanie diketonowe kwasu dehydroaskorbowego. Przemiana kwasu askorbowego w kwas dehydroaskorbowy jest odwracalna. Obie substancje są wysoce niestabilne i łatwo ulegają dalszym nieodwracalnym przemianom, prowadzącym do utraty ich aktywności biologicznej jako witaminy C. Czynnikami katalizującymi proces utleniania kwasu askorbinowego są: podwyższona temperatura, obecność tlenu, środowisko obojętne lub alkaliczne, promieniowanie UV, enzymy oksydacyjne oraz jony metali (miedzi, żelaza, srebra). Kwas askorbowy jest stabilny w środowisku kwaśnym, np. przy ph = 3 proces utleniania zachodzi dwa razy wolniej niż przy ph = 4,5, natomiast w środowisku zasadowym utlenianie zachodzi bardzo szybko. II. Część doświadczalna Zasada oznaczenia Metoda oznaczenia oparta jest na redukcji barwnika 2,6-dichloroindofenolu przez kwas askorbowy. Kwas askorbowy oznaczany jest przez miareczkowanie analizowanej próbki, mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, w środowisku kwaśnym (zapobiega to utlenieniu kwasu askorbowego tlenem z powietrza). Rolę wskaźnika w oznaczeniu spełnia sam titrant - 2,6-dichloroindofenol, który w formie utlenionej ma barwę granatową, a w wyniku redukcji przyjmuje barwę różową. W związku z tym, po przekroczeniu PK miareczkowania od kropli nadmiaru titranta, miareczkowany roztwór dotychczas bezbarwny zabarwia się na różowo. Reakcja przebiega w sposób ilościowy, w stosunku 1:1. 4

(1) 1. Walidacja wybranych parametrów miareczkowej metody oznaczania kwasu askorbowego w suplementach diety 1.1. Selektywność metody W celu określenia czy metoda jest selektywna należy zmiareczkować trzy preparaty farmaceutyczne, zawierającymi w swoim składzie kwas askorbowy. Otrzymane wyniki należy porównać z wartościami deklarowanymi przez producenta. Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 1 (sprawozdanie). Suplementy diety: 1. Calcium C, tabletki musujące, Pliva jony wapnia w postaci mleczanu wapnia 177mg kwas askorbowy 60mg otrzymaną do analizy tabletkę należy zważyć (zapisać dokładną masę), a następnie rozetrzeć w moździerzu, odważyć 40mg preparatu z dokładnością do 0,1mg (zapisać dokładną masę odważki), naważkę przenieść ilościowo, do kolby stożkowej, dodać 8ml 0,02% roztworu kwasu szczawiowego i dokładnie wymieszać, dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, aż do trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć sześciokrotnie dla każdego suplementu diety Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w tabletce x = K V M m [mg] gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; M całkowita masa preparatu (1 tabletka) [g]; m odważka preparatu [g] Sprawdzenie selektywności metody W celu sprawdzenia czy metoda jest selektywna należy sprawdzić dokładności i precyzję stosowanej metody dla otrzymanej serii wyników. W tym celu należy obliczyć błąd względny, odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności. 5

Błąd względny różnica pomiędzy wynikiem pomiaru a wartością rzeczywistą, podzielona przez wartość rzeczywistą, i wyrażona w %. Metoda jest uznawana za dokładną, jeżeli błąd względny wynosi nie więcej niż 0,1%. x μ E wz = 100% μ Gdzie: x wartość średnia z pomiarów; μ wartość rzeczywista Odchylenie standardowe (S) i wspólczynnik zmienności (W z ) odchylenie standardowe stanowi ocenę błędu przypadkowego, jest miarą rozrzutu wokół średniej. Im mniejsza jest wartość odchylenia standardowego, tym mniejszy jest rozrzut wyników i większa precyzja pomiaru. Metoda jest uznawana za precyzyjną, jeżeli współczynnik zmiennośći W z mieści się w granicy 5%. S = i=n i=l (x i x ) 2 n 1 W z = S 100 % x Gdzie: S odchylenie standardowe; W z współczynnik zmienności; n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wynik z pojedynczego pomiary; x wartość średnia Metoda jest uznawana za selektywną, jeżeli obecności innych substancji w próbce nie wpływa na dokładność i precyzję oznaczenia składnika głównego. Metodę uznaje się za selektywną jeżeli spełnione są poniższe warunki: błąd względny (E wz ) nie wynosi więcej niż 10% dla tabletki zawierającej poniżej 100mg kwasu askorbowego, błąd względny (E wz ) nie wynosi więcej niż 5% dla tabletki zawierającej powyżej 100mg kwasu askorbowego, współczynnik zmienności (W z ) mieści się w granicy 5%. 1.2. Liniowość metody W celu sprawdzenia liniowości metody w wybranym zakresie stężeń należy wykonać miareczkowanie pięciu mieszanin modelowych (I-V) o różnej zwartości kwasu askorbowego oraz wyznaczyć paramety krzywej wzorcowej i przeprowadzić statystyczną analizę uzysanych wyników. Do sporządzenia krzywej wzorcowej posłużą mieszaniny modelowe o rzeczywistej zawartości kwasu askorbowego od 50% do 150%, względem wartości deklarowanej (200mg w 0,6g masy tabletkowej). Kwas askorbowy [g] Placebo [g] Całkowita masa preparatu, M [g] Mieszanina modelowa I 0,1086 0,4959 0,6045 Mieszanina modelowa II 0,1555 0,4461 0,6016 Mieszanina modelowa III 0,2050 0,4054 0,6104 Mieszanina modelowa IV 0,2461 0,3758 0,6219 Mieszanina modelowa V 0,2909 0,3355 0,6264 odważyć kolejno około 40mg mieszaniny modelowej (I-V) z dokładnością do 0,1mg (zapisać dokładną masę odważki), 6

odważkę przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100ml, rozpuścić w niewielkiej ilości 0,02% roztworu kwasu szczawiowego, dopełnić roztworem kwasu szczawiowego do kreski, 8ml otrzymanego roztworu przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, dla każdej mieszaniny modelowej (I-V) wykonać po trzy miareczkowania. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w mieszaninie modelowej (I-V) x = K V śr 100 8 [mg] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; 100/8 współczynnik rozcieńczeń. Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 2 (sprawozdanie) i na ich podstawie, korzystając z poniższych wzorów, należy obliczyć parametry prostej y = ax + b (a, b, r). Należy zbadać również istotność wartości współczynnika korelacji r oraz współczynników a i b. Otrzymane wyniki należy umieścić w tabeli 3 (sprawozdanie). Na wykresie należy przedstawić zależność objętości zużytego titranta od rzeczywistej zawartość kwasu askorbowego w próbce. Wyznaczanie parametrów krzywej wzorcowej: a) Wyznaczenie współczynnika korelacji liniowej i zbadanie istotności współczynnika korelacji n i=l (x i x ) (y i y ) r = n (x i x ) 2 (y i y ) 2 i=l n i=l Gdzie: r współczynnik korelacji; x i - rzeczywista zawartość kwasu askorbowego w pojedynczym pomiarze; x - średnia zawartość kwasu askorbowego w badanych próbkach; y i objętość zużytego titranta na pojedyncze oznaczenie x i ; y - średnia zawartość zużytego titranta na zmiareczkowanie próbek x, Jeżeli r < 0,999 można podejrzewać wystąpienie funkcji nieliniowej. Aby sprawdzić czy zależność y = ax + b jest rzeczywiście prostoliniowa, należy obliczyć wartość t r na podstawie równania: r t r = 1 r n 2 2 Gdzie: t r parametr testu t-studenta, r współczynnik korelacji, n- liczba powtarzanych oznaczeń (n=15) Uzyskaną wartość t r porównać z wartością krytyczną t (α,k) odczytaną z tablic rozkładu t-studenta, przyjmując poziomu ufności α = 0,05 oraz liczbę stopni swobody k = n 1. b) Wyznaczyć współczynnik: nachylenia (a) oraz przesunięcia (b) a = n i=l (x i x ) (y i y ) (x i x ) 2 n i=l b = y ax c) Sprawdzenie istotność współczynników a i b W celu spradzenia istotności współczynników a i b stosuje się test t-studenta. Sprawdzenie istotność wspólczynników polega na sprawdzeniu spełnienia zależności: 7

1. t a > t kryt (α, k), gdzie t a = a S a, S a = S y/x n i=l(x i x ) 2, S y/x = n i=l (yi y ) 2 n 2 2. t b t kryt (α, k), gdzie t b = b, S S b = S y/x b n i=l x i 2 n i=l(x i x ) 2, S y/x = n i=l (yi y ) 2 n 2 Wartość t kryt (α, k) dla stopni swobody k = n 2 i poziomu istotności α = 0,05 należy odczytać z tablic rozkładu t-studenta. Metoda może być unzna za liniową w wybranym przedziale stężeń, jeżeli: 1. t r > t kryt oznacza to, że t r nie różni się istotnie od 1, czyli funkcja ma przebieg liniowy 2. t a > t kryt potwierdza istotność współczynnika nachylenia a natomiast gdy: t a < t kryt metoda charakteryzuje się bardzo złą precyzją. 3. t b > t kryt potwierdza istotność współczynnika przesunięcia b natomiast gdy: t b < t kryt współczynnik przesunięcia jest równy zero. 1.3. Dokładność W celu określenia, czy metoda jest dokładna, należy oznaczyć zawartość kwasu askorbowego analizując mieszaniny modelowe, które sporządzono przez dodanie do placebo wzorca kwasu askorbowego, w ilościach powyżej i poniżej deklarowanych, w preparatach farmaceutycznych. Otrzymane wyniki należy porównać z wartością rzeczywistą, oraz obliczyć odzysk. Wyniki umieścić w tabeli 4 (sprawozdanie). Kwas askorbowy, μ [g] Placebo [g] Mieszanina modelowa A 0,0520 0,5577 0,6097 Całkowita masa preparatu, M [g] Mieszanina modelowa B 0,0976 0,5175 0,6151 Mieszanina modelowa C 0,2081 1,5052 1,7133 odważyć około 40mg mieszaniny modelowej A z dokładnością do 0,1mg (zapisać dokładną masę odważki), odważkę przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50ml, rozpuścić w niewielkiej ilości 0,02% roztworu kwasu szczawiowego, dopełnić roztworem kwasu szczawiowego do kreski, 8ml otrzymanego roztworu przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze dwukrotnie, oznaczenie powtórzyć dla mieszaniny modelowej B i C. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w mieszaninie modelowej A, B i C x = K V M m 50 8 0,001 [g] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; M całkowita masa preparatu [g]; m odważka preparatu [g], 50/8 współczynnik rozcieńczeń. 8

Obliczenie odzysku z poszczególnych miareczkowań dla mieszaniny modelowej A, B i C R = x μ 100% Gdzie: x oznaczona zawartość analitu (kwasu askorobwego) w badanej próbce; µ znana ilość analitu (kwasu askorobwego) w badanej próbce Metoda jest uznawana za dokładną jeżeli średni odzysk otrzymany dla serii pomiarów mieści się w granicach 95-105% 1.4. Precyzja i odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna a) Precyzja W celu sprawdzenia precyzji metody, należy dokonać analizy statystycznej wyników oznaczenia kwasu askorbowego w mieszaninie modelowej A, a otrzymane wyniki umieścić w tabeli 5 (sprawozdanie). odważyć około 40mg mieszaniny modelowej A z dokładnością do 0,1mg (zapisać dokładną masę odważki), odważkę przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100ml, rozpuścić w niewielkiej ilości 0,02% roztworu kwasu szczawiowego, dopełnić roztworem kwasu szczawiowego do kreski, 8ml otrzymanego roztworu przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie należy powtórzyć jeszcze pięć razy Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w mieszaninie modelowej A x = K V M m 50 8 0,001 [g] Gdzie: K. masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; M całkowita masa preparatu [g]; m odważka preparatu [g], 50/8 współczynnik rozcieńczeń. Wyznaczenie precyzji Ponieważ miarą precyzji jest współczynnik zmienności W z, korzystając z poniższych wzorów, dla otrzymanej serii wyników, należy obliczyć wartość S, W z : S = i=n i=l (x i x ) 2 W z = S 100 x n 1 Gdzie: S odchylenie standardowe; n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wartość wyniku z pojedyńczego oznaczenia; x wartość średnia Metoda jest uznawana za precyzyjną jeżeli współczynnik zmiennośći mieści się w granicy 5%. 9

b) Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna W celu sprawdzenia odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej, należy wykonać dwie serie miareczkowań dla mieszaniny modelowej A i B, każda po sześć powtórzeń. Każda seria pomiarów powinna być wykonana przez inną osobę przy użyciu innej biurety. Do oceny czy wyniki uzyskane w takich warunkach różnią się istotnie, należy zastosować test jednorodności dwóch wariancji (F-Snedecora). Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 6 (sprawozdanie). odważyć około 40mg mieszaniny modelowej A z dokładnością do 0,1mg (zapisać dokładną masę odważki), odważkę przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 100ml, rozpuścić w niewielkiej ilości 0,02% roztworu kwasu szczawiowego, dopełnić roztworem kwasu szczawiowego do kreski, 8ml otrzymanego roztworu przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie należy powtórzyć jeszcze pięć razy, oznaczenie należy powtórzyć dla mieszaniny modelowej B. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w mieszaninie modelowej A i B x = K V M m 50 8 0,001 [g] Gdzie: K. masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; M całkowita masa preparatu [g]; m odważka preparatu [g]; 50/8 współczynnik rozcieńczeń. Wyznaczenie odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej Do oceny, czy wyniki uzyskane w dwóch seriach pomiarowych, wykonanych przez dwie różne osoby różnią się istotnie, należy zastosować test F-Snedecora (test jednorodności dwóch wariancji). Jednorodność wariancji sprawdza się porównując odchylenia standardowe dwóch zbiorów wyników dla wykonanych serii pomiarów (mieszanina modelowa A i B). W tym celu należy obliczyć: średnią arytmetyczną pomiarów ( x ) dla n = 6, odchylenie standardowe (S), oraz obliczyć wartość parametru testu F-Snedecora korzystając ze wzorów: F = S A 2 x = n i=1 x i i=n i=l, S = (x i x ) 2 n n 1 S2 dla S 2 2 A > S B lub F = S B B S2 dla S 2 2 B > S A A Gdzie: n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wartość wyniku z pojedynczego pomiaru. Obliczony współczynnik F porównujemy z wartością krytyczną F kryt, dla przyjętego poziomu istotności α = 0,05, oraz stopni swobody v 1 i v 2 (gdzie: v 1 = n 1-1, v 2 = n 2-1) odczytaną z tablic F-Snedecora. Metoda jest uznawana za odtwarzalną, jeżeli obliczona wartość F nie przewyższa wartości F kryt (F F kryt. ), w sytuacji takiej można wnosić, że obliczone wartości odchylenia standardowego nie różną się w sposób statystycznie istotny, w związku z powyższym można stwierdzić, że precyzja obu serii pomiarów nie różni się między sobą, czyli metoda jest odtwarzalna. 2 10

1.5. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) Granicę wykrywalności kwasu askorbowego można oznaczyć na podstawie wyznaczonej objętości 2,6- dichloroindofenolu potrzebnej do miareczkowania ślepej próby, czyli próbki przygotowanej w identyczny sposób jak do oznaczenia kwasu askorbowego nie zawierającą jednak kwasu askorbowego (tzw. tło). Przyjmuje się, że ilość roztworu mianowanego powinna stanowić 3-krotność poziomu tła. Granicę oznaczalności kwasu askorbowego można oznaczyć na podstawie wyznaczonej objętości 2,6- dichloroindofenolu potrzebnej do miareczkowania ślepej próby (tzw. tło). Przyjmuje się, że ilość roztworu mianowanego powinna stanowić 6-krotność poziomu tła. Uzyskane wyniki należy umieścić w tabeli 7 (sprawozdanie). w celu wykonania oznaczenia ślepej próby należy zmiareczkować próbę przygotowaną w taki sam sposób jak do oznaczenia kwasu askorbowego, nie zawierającą jednak kwasu askorbowego, do kolby stożkowej dodać 8ml roztworu 0,02% kwasu szczawiowego oraz 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6-dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze 5 razy. Obliczenie granicy wykrywalności Obliczenie granicy oznaczalności LOD = 3 V K LOQ = 6 V K Gdzie: K. masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie ślepej próby [ml] Metodę można uznać za przydatną do oznaczania kwasu askorbowego w preparatach farmaceutycznych, w których deklarowana zawartość kwasu askorbowego jest równa lub wyższa od wyznaczonej granicy oznaczalności. 2. Walidacja wybranych parametrów miareczkowej metody oznaczania kwasu askorbowego w moczu pacjentów po suplementacji 2.1. Selektywność metody Mocz jest materiałem biologicznym, w skład którego poza wodą wchodzą różnego rodzaju metabolity (głównie mocznik) oraz inne substancje jak np. barwniki żółciowe. W celu określenia czy substancje te nie wpływają otrzymany wynik analityczny należy sprawdzić selektywność metody dla badanej próbki. W tym celu należy oznaczyć zawartość witaminy C w badanej próbce moczu i porównać ją z wartością otrzymaną inną sprawdzoną metodą. Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 8 (sprawozdanie). 11

czystą pipetą odmierzyć 8ml próbki moczu nr 1, roztwór przenieść ilościowo do kolby stożkowej dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i miareczkować mianowanym roztworem 2,6-dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze pięć razy. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w moczu x = K V titr. V pr. [mg/ml] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V titr. objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; V pr. objętość próbki pobranej do analizy [ml]. Sprawdzenie dokładności metody W celu sprawdzenia czy metoda jest selektywna należy sprawdzić dokładności i precyzję stosowanej metody dla otrzymanej serii wyników. W tym celu należy obliczyć błąd względny, odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności. Błąd względny różnica pomiędzy wynikiem pomiaru a wartością rzeczywistą, podzielona przez wartość rzeczywistą, i wyrażona w %. Metoda jest uznawana za dokładną, jeżeli błąd względny wynosi nie więcej niż 0,1%. x μ E wz = 100% μ Gdzie: x wartość średnia z pomiarów; μ wartość otrzymana za pomocą HPLC [51,38 μg/ml] Odchylenie standardowe (S) i wspólczynnik zmienności (W z ) odchylenie standardowe stanowi ocenę błędu przypadkowego, jest miarą rozrzutu wokół średniej. Im mniejsza jest wartość odchylenia standardowego, tym mniejszy jest rozrzut wyników i większa precyzja pomiaru. Metoda jest uznawana za precyzyjną, jeżeli współczynnik zmiennośći W z mieści się w granicy 5%. S = i=n i=l (x i x ) 2 n 1 W z = S 100 % x Gdzie: S odchylenie standardowe; W z współczynnik zmienności; n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wynik z pojedynczego pomiary; x wartość średnia Metoda jest uznawana za selektywną, jeżeli obecności innych substancji w próbce nie wpływa na dokładność i precyzję oznaczenia składnika głównego. Metodę uznaje się za selektywną jeżeli spełnione są poniższe warunki: błąd względny (E wz ) nie wynosi więcej niż 10% dla tabletki zawierającej poniżej 100 mg kwasu askorbowego, błąd względny (E wz ) nie wynosi więcej niż 5% dla tabletki zawierającej powyżej 100 mg kwasu askorbowego, współczynnik zmienności (W z ) mieści się w granicy 5%. 2.2. Liniowość metody 12

W celu sprawdzenia liniowości metody w wybranym zakresie stężeń należy wykonać miareczkowanie pięciu roztworów wzorcowych (I-V) o różnej zwartości kwasu askorbowego oraz wyznaczyć paramety krzywej wzorcowej i przeprowadzić statystyczną analizę uzysanych wyników. Do sporządzenia krzywej wzorcowej posłużą roztwory wzorcowe w zakresie o zawartości kwasu askorbowego od 50% do 150%, względem wartości oczekiwanej. W tym celu należy przygotować roztwory wzorcowe w zakresie stężeń od 50μg/ml do 175μg/ml. Należy przygotować wzorce kwasu askorbowego do krzywej wzorcowej. Roztwór podstawowy kwasu askorbowego o stężeniu 5mg/ml sporządzamy przez rozpuszczenie 25mg kwasu askorbowego w 5ml 0,02% kwasu szczawiowego. Lp. Stęż. wzorca [μg/ml] Ilość wzorca o stężeniu 5mg/ml [μl] Kwas szczawiowy [ml] I 50 500 49,500 II 80 800 49,200 III 110 1100 48,900 IV 140 1400 48,600 V 175 1750 48,250 czystą pipetą odmierzyć 8ml roztworu wzorcowego I, roztwór przenieść ilościowo do kolby stożkowej do kolby stożkowej dodać 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, dla każdego roztworu wzorcowego (I-V) wykonać po trzy miareczkowania. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w roztworach wzorcowych (I-V) x = K V titr. V pr. [mg/ml] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V titr. objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; V pr. objętość próbki pobranej do analizy [ml]. Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 9 (sprawozdanie) i na ich podstawie, korzystając z poniższych wzorów, należy obliczyć parametry prostej y = ax + b (a, b, r). Należy zbadać również istotność wartości współczynnika korelacji r oraz współczynników a i b. Otrzymane wyniki należy umieścić w tabeli 10 (sprawozdanie). Na wykresie należy przedstawić zależność objętości zużytego titranta od rzeczywistej zawartość kwasu askorbowego w próbce. Wyznaczanie parametrów krzywej wzorcowej a) Wyznaczenie współczynnika korelacji liniowej i zbadanie istotności współczynnika korelacji n i=l (x i x ) (y i y ) r = n (x i x ) 2 (y i y ) 2 i=l n i=l Gdzie: r współczynnik korelacji; x i - rzeczywista zawartość kwasu askorbowego w pojedynczym pomiarze; x - średnia zawartość kwasu askorbowego w badanych próbkach; y i objętość zużytego titranta na pojedyncze oznaczenie x i ; y - średnia zawartość zużytego titranta na zmiareczkowanie próbek x, 13

Jeżeli r < 0,999 można podejrzewać wystąpienie funkcji nieliniowej. Aby sprawdzić czy zależność y = ax + b jest rzeczywiście prostoliniowa, należy obliczyć wartość t r na podstawie równania: r t r = 1 r n 2 2 Gdzie: t r parametr testu t-studenta, r współczynnik korelacji, n- liczba powtarzanych oznaczeń (n=15) Uzyskaną wartość t r porównać z wartością krytyczną t (α,k) odczytaną z tablic rozkładu t-studenta, przyjmując poziomu ufności α = 0,05 oraz liczbę stopni swobody k = n 1. b) Wyznaczyć współczynnik: nachylenia (a) oraz przesunięcia (b) a = n i=l (x i x ) (y i y ) (x i x ) 2 n i=l b = y ax c) Sprawdzenie istotność współczynników a i b W celu spradzenia istotności współczynników a i b stosuje się test t-studenta. Sprawdzenie istotność wspólczynników polega na sprawdzeniu spełnienia zależności: t a > t kryt (α, k), gdzie t a = a S a, S a = S y/x n i=l(x i x ) 2, S y/x = n i=l (yi y ) 2 n 2 t b t kryt (α, k), gdzie t b = b, S S b = S y/x b n i=l x i 2 n i=l(x i x ) 2, S y/x = n i=l (yi y ) 2 n 2 Wartość t kryt (α, k) dla stopni swobody k = n 2 i poziomu istotności α = 0,05 należy odczytać z tablic rozkładu t-studenta. Metoda może być unzna za liniową w wybranym przedziale stężeń, jeżeli: 1. t r > t kryt oznacza to, że t r nie różni się istotnie od 1, czyli funkcja ma przebieg liniowy 2. t a > t kryt potwierdza istotność współczynnika nachylenia a natomiast gdy: t a < t kryt metoda charakteryzuje się bardzo złą precyzją. 3. t b > t kryt potwierdza istotność współczynnika przesunięcia b natomiast gdy: t b < t kryt współczynnik przesunięcia jest równy zero. 2.3. Dokładność W celu określenia, czy metoda jest dokładna, należy oznaczyć zawartość kwasu askorbowego analizując trzy różne próbki moczu (pochodzące od 3 różnych osób). Otrzymane wyniki należy porównać z wartością odniesienia, oraz obliczyć odzysk. Wyniki umieścić w tabeli 11 (sprawozdanie). odmierzyć 8ml próbki nr 1i przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać do kolby stożkowej 10ml 0,5M roztowru H 2 SO 4 i miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze 2 razy, oznaczenie należy powtórzyć dla próbki nr 2 i 3. 14

Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w próbce moczu nr 1, 2 i 3 x = K V titr. V pr. [mg/ml] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V titr. objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; V pr. objętość próbki pobranej do analizy [ml]. Obliczenie odzysku z poszczególnych miareczkowań dla próbki moczu nr 1, 2 i 3 R = x μ 100% Gdzie: x oznaczona zawartość analitu (kwasu askorobwego) w badanej próbce; µ wartość otrzymana za pomocą HPLC [51,38 μg/ml]. Metoda jest uznawana za dokładną jeżeli średni odzysk otrzymany dla serii pomiarów mieści się w granicach 95-105% 2.4. Precyzja i odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna a) Precyzja odmierzyć 8ml próbki nr 2 i przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać do kolby stożkowej 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze 5 razy, Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w próbce nr 1 x = K V titr. V pr. [mg/ml] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V titr. objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; V pr. objętość próbki pobranej do analizy [ml]. Wyznaczenie precyzji metody Ponieważ miarą precyzji jest współczynnik zmienności W z, korzystając z poniższych wzorów, dla otrzymanej serii wyników, należy obliczyć wartość S, W z : S = i=n i=l (x i x ) 2 W z = S 100 x n 1 Gdzie: S odchylenie standardowe; n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wartość wyniku z pojedyńczego oznaczenia; x wartość średnia 15

Metoda jest uznawana za precyzyjną jeżeli współczynnik zmiennośći mieści się w granicy 5%. b) Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna W celu sprawdzenia odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej, należy wykonać dwie serie miareczkowań dla próbki nr 2 i próbki nr 3, każda po sześć powtórzeń. Każda seria pomiarów powinna być wykonana przez inną osobę przy użyciu innej biurety. Do oceny czy wyniki uzyskane w takich warunkach różnią się istotnie, należy zastosować test jednorodności dwóch wariancji (F-Snedecora). Otrzymane wyniki umieścić w tabeli 13 (sprawozdanie). odmierzyć 8ml próbki nr 1i przenieść ilościowo do kolby stożkowej, dodać do kolby stożkowej 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i miareczkować mianowanym roztworem 2,6- dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze 5 razy, oznaczenie powtórzyć dla próbki nr 3. Obliczenie zawartość kwasu askorbowego w próbce nr 2 i 3 x = K V titr. V pr. [mg/ml] Gdzie: K masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V titr. objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie [ml]; V pr. objętość próbki pobranej do analizy [ml]. Wyznaczenie odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej Do oceny, czy wyniki uzyskane w dwóch seriach pomiarowych, wykonanych przez dwie różne osoby różnią się istotnie, należy zastosować test F-Snedecora (test jednorodności dwóch wariancji). Jednorodność wariancji sprawdza się porównując odchylenia standardowe dwóch zbiorów wyników dla wykonanych serii pomiarów (mieszanina modelowa A i B). W tym celu należy obliczyć: średnią arytmetyczną pomiarów ( x ) dla n = 6, odchylenie standardowe (S), oraz obliczyć wartość parametru testu F-Snedecora korzystając ze wzorów: F = S A 2 x = n i=1 x i i=n i=l, S = (x i x ) 2 n n 1 S2 dla S 2 2 A > S B lub F = S B B S2 dla S 2 2 B > S A A Gdzie: n liczba powtarzanych oznaczeń; x i wartość wyniku z pojedynczego pomiaru. Obliczony współczynnik F porównujemy z wartością krytyczną F kryt, dla przyjętego poziomu istotności α = 0,05, oraz stopni swobody v 1 i v 2 (gdzie: v 1 = n 1-1, v 2 = n 2-1) odczytaną z tablic F-Snedecora. 2 Metoda jest uznawana za odtwarzalną, jeżeli obliczona wartość F nie przewyższa wartości F kryt (F F kryt. ), w sytuacji takiej można wnosić, że obliczone wartości odchylenia standardowego nie różną się w 16

sposób statystycznie istotny, w związku z powyższym można stwierdzić, że precyzja obu serii pomiarów nie różni się między sobą, czyli metoda jest odtwarzalna. 2.5. Granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) Granicę wykrywalności kwasu askorbowego można oznaczyć na podstawie wyznaczonej objętości 2,6- dichloroindofenolu potrzebnej do miareczkowania ślepej próby, czyli próbki przygotowanej w identyczny sposób jak do oznaczenia kwasu askorbowego nie zawierającą jednak kwasu askorbowego (tzw. tło). Przyjmuje się, że ilość roztworu mianowanego powinna stanowić 3-krotność poziomu tła. Granicę oznaczalności kwasu askorbowego można oznaczyć na podstawie wyznaczonej objętości 2,6- dichloroindofenolu potrzebnej do miareczkowania ślepej próby (tzw. tło). Przyjmuje się, że ilość roztworu mianowanego powinna stanowić 6-krotność poziomu tła. Uzyskane wyniki należy umieścić w tabeli 7 (sprawozdanie). w celu wykonania oznaczenia ślepej próby należy zmiareczkować próbę przygotowaną w taki sam sposób jak do oznaczenia kwasu askorbowego, nie zawierającą jednak kwasu askorbowego, do kolby stożkowej dodać 8ml roztworu 0,02% roztworu kwasu szczawiowego oraz 10ml 0,5M roztworu H 2 SO 4 i natychmiast miareczkować mianowanym roztworem 2,6-dichloroindofenolu, do uzyskania trwałego różowego zabarwienia, miareczkowanie powtórzyć jeszcze 5 razy. Obliczanie granicy wykrywalności Obliczanie granicy oznaczalności LOD = 3 V K LOQ = 6 V K Gdzie: K. masa kwasu askorbowego (mg), odpowiadająca 1,0 ml mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu; V objętość mianowanego roztworu 2,6-dichloroindofenolu zużyta na miareczkowanie ślepej próby [ml] Metodę można uznać za przydatną do oznaczania kwasu askorbowego w preparatach farmaceutycznych, w których deklarowana zawartość kwasu askorbowego jest równa lub wyższa od wyznaczonej granicy oznaczalności. 17