Organizmy modelowe - drożdże Saccharomyces cerevisiae i nie tylko
Co można badać na drożdżach? Praktycznie wszystkie podstawowe aspekty biologii molekularnej, biologii komórki, genetyki
Transdukcja sygnału
Czego nie można badać na drożdżach Różnicowanie i rozwój Neurobiologia Regulacja przez małe niekodujące RNA (sirna, mirna) Alternatywny splicing
Drożdże i cykl komórkowy Nobel dla drożdży
Nobel 2001 Drożdże i cykl komórkowy
Cykl komórkowy
Mutanty cdc S. cerevisiae Cykl komórkowy podobny do wyższych Eukaryota Fazy G1, S, G2, M i wrzeciono podziałowe Lee Hartwell zastosowanie genetyki drożdży do badania cyklu komórkowego (1970-73) Mutanty temperaturowrażliwe (ts), analizowane za pomocą mikroskopii (zdjęcia poklatkowe) populacja zatrzymuje się w tej fazie, której dotyka mutacja stwierdzenie, której fazy cyklu dotyczy defekt w mutancie
Mutanty cdc S. cerevisiae http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2001/hartwell-lecture.pdf
Mutanty wee i cdc u S. pombe Podziały komórki skoordynowane z wzrostem komórek Mutant wee komórki zaczynają się dzielić, kiedy są jeszcze małe zaburzona kontrola startu cyklu
Regulacja cyklu wee1 inhibitor cyklu; cdc25, cdc2 aktywatory mutant typu wee dominujący (konstytutywna aktywność) utrata funkcji duże komórki
Regulacja cyklu komórkowego
Od drożdży do człowieka mutację cdc2 S. pombe można odwrócić wprowadzając na plazmidzie ludzki gen CDK1 (Cyclin Dependent Kinase)
Drożdże i transkrypcja Kolejny Nobel dla drożdży
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja
Drożdże i transkrypcja Łatwość hodowli przydatne w projektach oczyszczania i krystalizacji białek
Drożdże i mitochondria
Profil metaboliczny S. cerevisiae Fakultatywne aeroby Efekt Pasteura tlen hamuje fermentację, ale Efekt Crabtree w obecności glukozy (C6) fermentacja anaerobowa nawet w obecności tlenu Glukoza hamuje oddychanie Etanol jest następnie wykorzystywany (jeżeli nadal jest tlen) Strategia akumulacja i konsumpcja
S. cerevisiae i mitochondria co szczególnego? Przeżywa bez funkcji oddechowej (fakultatywny tlenowiec, fermentacja) Mutanty z defektywnym oddychanie, petite (lata 1960.) Przeżywa bez genomu mitochondrialnego ( petite positive ) glukoza (fermentacja) glicerol (oddychanie)
Fenotyp petite u S. cerevisiae Zmiany w mtdna ρ 0 całkowita utrata mtdna ρ - częściowa utrata mtdna, znaczne delecje i reamplifikacja mit - - mutacje punktowe, prawidłowa struktura genomu Zmiany w ndna mutanty pet
Oddziaływania jądrowo mitochondrialne Proteom mitochondrium ~500-800 białek 8-9 kodowane w mtdna jądro mitochondrium Ponad 150 genów jądrowych Ucieczka genów niezbędnych do utrzymania mitochondrialnego systemu genetycznego Ewolucja nowych funkcji Utrata genów
Kompleks III Kompleks IV syntaza ATP Błona wewnętrzna III IV V Matrix Cox1 Cox2 Cox3 Atp6 Atp8 Atp9 polimeraza RNA Cob Rpo41 Mtf1 24 trna Translation 21S rrna mtdna Transkrypcja Cob, Cox1, Cox2, Cox3, Atp6, Atp8, Atp9, Var1 LSU Translacja 15S rrna SSU Var1 9S RNA + Rpm2 RNaza P Rybosom Bartosz Zapisek, 2011.
Nie tylko S. cerevisiae S. cerevisiae był od dziesiątków lat standardowym modelem genetyki mitochondrialnej metabolizm fakultatywnie aerobowy przeżywa bez mtdna (petite positive) Pod wieloma względami jest nietypowy przeżywa bez mtdna (petite positive) nietypowa organizacja, ekspresja i replikacja mtdna brak genów kompleksu I (dehydrogenaza NADH) w mtdna genom po epizodzie duplikacji całego genomu (WGD) i utracie redundantnych paralogów
Drożdże jako model dla genetyki człowieka
Genomy S. cerevisiae H. sapiens ~1,2 x 10 7 bp ~3 x 10 9 bp ~6500 genów ~25 000 genów ~1800 genów wykazuje homologie z genami H. sapiens (30%) ~ 4000 genów wykazuje homologie z genami S. cerevisiae (13%) Wiele podstawowych funkcji komórki jest zachowanych. Niekiedy możliwa wymienność białek drożdżowych i ludzkich (np. Ras, Oxa1)
Baza danych
Przykładowe drożdżowe modele chorób Progerie Wernera i Blooma Choroby związane z defektami naprawy DNA (HNPCC, ataksjatelangiektazja) Ataksja Friedreicha Zaburzenia komunikacji jądrowo - mitochondrialnej (PEO) Choroby wywołane mutacjami w mtdna (NARP) Poszukiwanie leków za pomocą drożdży
Zespół Wernera Normalny rozwój w dzieciństwie. Przedwczesne starzenie rozpoczyna się wraz z wiekiem dojrzewania. Niski wzrost, owrzodzenia, zwapnienia, siwienie włosów. Pacjenci dożywają średnio 47 lat. Przyczyną śmierci z reguły choroba nowotworowa, albo schorzenia sercowonaczyniowe. Przyczyna: mutacje genu WRN kodującego helikazę DNA z rodziny RecQ
Zespół Blooma Opóźniony wzrost, karłowatość. Zaburzenia pigmentacji skóry. Predyspozycje do wczesnego (ok. 25 r. ż.) występowania wielu różnych nowotworów. Z reguły nie dożywają 40-50 lat (1/3 nie dożywa 25 lat). Przyczyna: mutacje genu BLM kodującego kolejną helikazę DNA z rodziny RecQ
Zaburzenia w zespołach Wernera i Blooma Utrata stabilności genomu Zaburzenia w okolicach telomerów (WRN) Zwiększona częstość wymiany chromatyd siostrzanych (BLM) Zwiększona częstość zaburzeń kariotypowych Zwiększona częstość mutacji genów
SGS1 model drożdżowy Gen SGS1 jest drożdżowym homologiem genów WRN i BLM. Fenotyp delecji SGS1: zwiększona rekombinacja mitotyczna (zwłaszcza subtelomerowa) zaburzenia segregacji chromosomów zaburzenia mejozy Białko Sgs1p jest zaangażowane w hamowanie nieuprawnionej rekombinacji i utrzymywanie stabilności genomu. Ludzkie geny BLM i WRN częściowo komplementują fenotyp delecji SGS1
C1orf31, COA6 C1orf31 - zachowywany w ewolucji gen, funkcja u człowieka nieznana Mutacje u chorych na choroby serca (kardiomiopatia przerostowa) związane z defektami mitochondrialnymi Homolog drożdżowy - COA6
COA6 Zaangażowany w składanie kompleksu IV (oksydaza cytochromowa) Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069
Fenotyp odwracany przez dodanie Cu 2+ W sekwencji białka motywy, które mogą wiązać jony miedzi Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069
Model mutacji znalezionych u pacjenta Mutacje u chorych w konserwowanych pozycjach Fenotyp zgodny z defektem oddychania komórkowego Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069
Model w układzie wielokomórkowym Wyciszenie homologicznego genu w zarodkach ryby Danio (TB - wyciszenie, MMC - kontrola) nie wymaga funkcjonalnego serca przez pierwsze 4-5 dni rozwoju u ssaków byłby to efekt letalny Fenotyp - defekt rozwoju serca Ghosh i wsp. Hum. Mol. Genet. (2014) doi: 10.1093/hmg/ddu069
Zaburzenia komunikacji jądrowomitochondrialnej Mutacje w genach kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie mtdna ANT1 (transporter ADP/ATP) POLG (polimeraza DNA) Choroby dziedziczone autosomalnie, objawiają się delecjami w mtdna lub deplecją mtdna
PEO PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) Postać dominująca (adpeo) lub recesywna (arpeo) Objawy opadanie powiek (ptosis), niezdolność do poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie mięśni, zaburzenia neurologiczne,
Inne choroby związane z mutacjami POLG Zespół Alpersa (ciężka postępująca choroba neurodegeneracyjna) SANDO (sensory ataxic neuropathy, dysarthria, and ophthalmoparesis)
Mutacje i modele drożdżowe POLG (mitochondrialna polimeraza DNA) drożdżowy homolog MIP1 ANT1 (mitochondrialny transporter ATP/ADP drożdżowy homolog AAC2
http://tools.niehs.nih.gov/polg
Homologia POLG i MIP1 Mutacje w MIP1 powodują niestabilność genomu mitochondrialnego spontaniczne delecje mutacje punktowe całkowita utrata mitochondrialnego DNA
Choroby wywołane mutacjami w mtdna Np. NARP Neurogenic Ataxia Retinitis Pigmentosa Mutacja w genie ATP6 W komórkach 70-90% zmutowanego DNA Obniżona aktywność syntezy ATP
Drożdżowe modele chorób mitochondrialnych S. cerevisiae jedyny organizm modelowy, u którego można wprowadzać DNA do mitochondriów ukierunkowana mutageneza mtdna Rak, M. et al. J. Biol. Chem. 2007;282:34039-34047
Poszukiwanie nowych leków
Identyfikacja substancji aktywnych Drożdże na szalce (murawa) Testowane związki nakraplane na krążki filtrów Drugs are deposited on filters kontrola negatywna Związki aktywne
Identyfikacja celów działania substancji aktywnych za pomocą genomiki drożdży
Długowieczność i starzenie
Długowieczność drożdży Zastosowanie drożdży S. cerevisiae jako modelu zjawisk związanych ze starzeniem proponowano od lat 60. (Mortimer & Johnson) Dwa mechanizmy starzenie replikatywne limit podziałów komórki-matki (~30) starzenie chronologiczne przeżywalność w fazie spoczynkowej hodowli (wyczerpane źródła energii)
Mechanizmy kontrolujące długowieczność mogą być konserwowane w ewolucji
Drożdże i biologia systemów Drożdże w XXI wieku
Poszukiwanie interakcji genetycznych Oddziaływania łagodzące (np. supresja) selekcja bezpośrednia Oddziaływania syntetyczne syntetyczna letalność: pojedyncze mutacje gen1 i gen2 nie są letalne, ale podwójny mutant gen1, gen2 nie przeżywa syntetyczne wzmocnienie pojedyncze mutacje gen1 i gen2 słaby fenotyp, podwójny mutant gen1, gen2 silny fenotyp (np. spowolnienie wzrostu)
Ujęcie ilościowe Dixon et al. 2009, Annu Rev Genet 43:601-25
SGA Synthetic Gene Array Kolekcja delecji, krzyżowana z badanym genem Sporulacja, Selekcja haploidów MATa Selekcja pojedynczych i podwójnych mutantów Boone et al. Nature Reviews Genetics, 2007 vol. 8 (6) pp. 437
http://www.utoronto.ca/boonelab/sga_technology/index.shtml SGA
dslam Diploid-based synthetic lethality analysis with microarrays (dslam)
Rekonstrukcja sieci interakcji Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25
Interakcje genetyczne ujęcie systemowe Interakcje genetyczne wskazują na związki funkcji Mogą wiązać elementy tego samego szlaku/kompleksu, ale też różnych szlaków, powiązanych funkcją Zestaw interakcji (pozycja na mapie interaktomu genetycznego) może wskazywać na funkcję genu
Sieci interakcji Sieć interakcji syntetycznych letalnych jest rzadka około 1% Interakcje syntetyczne są jednak częste pomiędzy genami o powiązanej funkcji (18%-25%) Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25
Interakcje genetyczne a fizyczne Interakcje fizyczne i genetyczne rzadko się nakładają, choć częściej, niż przewidywano by dla pełnej losowości Nakładanie się interakcji genetycznych i fizycznych częste dla interakcji pozytywnych (epistaza) Interakcje negatywne z reguły pomiędzy różnymi kompleksami fizycznymi Dixon et al. 2009, Systematic mapping of genetic interaction networks. Annu Rev Genet 43:601-25
Wyniki sieci interakcji genetycznych
Costanzo i wsp., (2010) Science 327, 425
Genomika cech wieloczynnikowych Dziedziczenie wieloczynnikowe - fenotyp zależy od interakcji alleli wielu genów oraz środowiska W odróżnieniu od fenotypów mendlowskich mają zwykle charakter zmienności ciągłej (ilościowej), a nie dyskretnej QTL - Quantitative Trait Loci - loci cech ilościowych - obszary genomu w istotny sposób wpływające na fenotyp cechy wieloczynnikowej
Genomika cech wieloczynnikowych Ważne zagadnienie dla genetyki człowieka częste choroby, zmienność prawidłowa genetyki roślin uprawnych genetyki zwierząt hodowlanych teorii ewolucji Głównie analizy statystyczne Czy można zastosować proste organizmy modelowe?
QTL u drożdży QTL u drożdży można badać wykorzystując szczepy o różnym tle genetycznym S. cerevisiae - bardzo duża zmienność, nawet wśród szczepów laboratoryjnych
QTL u drożdży - 3 strategie Bulk Segregant Analysis (BSA) - masowa analiza segregantów Individual Segregant Analysis (ISA) - analiza pojedynczych segregantów (równoległa) Reciprocal Hemizygosity Scanning (RHS) - analiza hemizygotycznych delecji
QTL u drożdży Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865
QTL u drożdży Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865
QTL u drożdży - metoda ISA Wilkening et al. (2014), Genetics, 196:853-865
QTL u drożdży Metoda ISA pozwala na mapowanie cech, których nie można selekcjonować (np. kształt kolonii) Skuteczność zależy od liczby pojedynczych segregantów, które można przeanalizować Obecnie do ~1000
Genotypowanie szczepów Co można dziś Do 384 bibliotek/tydzień <15 /próbka 30x pokrycie Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90
Inne zastosowanie Mapa częstości rekombinacji homologicznej w skali genomu Wilkening et al. BMC Genomics 2013 14:90
Ewolucja eksperymentalna
Ewolucja eksperymentalna Możliwość prowadzenia wielu hodowli równolegle przez wiele pokoleń
Ewolucja wielokomórkowości Selekcja w hodowlach S. cerevisiae w kierunku szybkiego opadania osadu Pojawiają się grupy komórek ( płatki śniegu )
Ewolucja wielokomórkowości wyjściowe - jednokomórkowe po 14 pokoleniach selekcji po 60 pokoleniach selekcji
Ewolucja specjalizacji Pod koniec w zgrupowaniach pojawił się podział funkcji niektóre komórki inicjują programowaną śmierć by ułatwić podział grupy przez fragmentację
Wzrost kolonii
Podział kolonii