III LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE IM. MARYNARKI WOJENNEJ RP W GDYNI Zjawisko oddziaływania allelopatycznego sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki sinic bałtyckich Kinga Gergella Klasa III b Opiekun: mgr Małgorzata Kupczyk - Skodowska Gdynia, 2015
STRESZCZENIE W świetle wzrostu zainteresowania szkodliwymi zakwitami, allelopatia może być kluczowym czynnikiem wpływającym na dominację niektórych gatunków sinic w środowisku wodnym [11]. Rola związków allelopatycznych jest wciąż mało znana, lecz uważa się, że mogą one powodować przewagę produkujących je sinic nad innymi mikroorganizmami [5]. Pikoplanktonowa sinica Synechococcus sp. jest bardzo ważnym, lecz nadal słabo poznanym składnikiem morskich i słodkowodnych ekosystemów [13]. W przeprowadzonych badaniach określono wpływ pojedynczego i wielokrotnego przesączu uzyskanego z Synechococcus sp. na wybrane gatunki sinic bałtyckich. W pracy wykazano, że przesącz wpływał hamująco na wzrost nitkowatych sinic Geitlerinema amphibium, Nodularia spumigena oraz Nostoc sp. Nie zanotowano natomiast istotnych zmian liczebności dla pikoplanktonowej sinicy Synechocystis sp. Dla wszystkich gatunków badanych sinic zostały również wykonane zdjęcia przedstawiające zmiany morfologiczne, które zaszły w ich komórkach pod wpływem dodania przesączu uzyskanego z kultur Synechococcus sp. Ponadto dla sinicy G. amphibium zostały wykonane dodatkowe eksperymenty, na podstawie których stwierdzono, że dodany przesącz hamował fluorescencję chlorofilu a, tempo fotosyntezy, a także wpływał znacząco na ilość barwników fotosyntetycznych. W pracy udowodniono, że sinicowe związki allelopatyczne ograniczają sprawność fotosyntezy, co skutkuje zahamowaniem wzrostu organizmów targetowych. Taki sposób oddziaływania może wyjaśniać tworzenie się prawie monogatunkowych zakwitów sinic w wielu zbiornikach wodnych, w tym również w Morzu Bałtyckim. WSTĘP Allelopatia to szeroko rozpowszechnione, jednak niewystarczająco poznane zjawisko, które polega na produkowaniu i uwalnianiu przez niektóre gatunki fitoplanktonu wtórnych metabolitów oddziałujących na wzrost i funkcje życiowe innych organizmów [5]. Coraz powszechniej uważa się, że oddziaływania allelopatyczne mogą występować we wszystkich wodnych ekosystemach i powodować masowe zakwity fitoplanktonu w wielu słodkowodnych, brakicznych i morskich zbiornikach wodnych. Masowe występowanie sinic powoduje poważne implikacje dla ekosystemu, w którym się rozwijają, ponieważ wytwarzane przez nie związki mogą być szkodliwe dla mikroorganizmów, fito- i zooplanktonu, skorupiaków, ryb, a nawet człowieka [5; 13]. Uważa się, że związki allelopatyczne mogą być odpowiedzialne za selekcję naturalną organizmów, konkurencję międzygatunkową i sukcesję ekologiczną [11]. Jednym z gatunków występujących licznie w Morzu Bałtyckim i wykazującym aktywność allelopatyczną jest pikoplanktonowa sinica Synechococcus sp., która może stanowić aż 80% całkowitej biomasy sinic i 50% całkowitej produkcji pierwotnej w zakwicie sinicowym [13]. Głównym celem niniejszej pracy było wykazanie wpływu oddziaływania allelopatycznego pikoplanktonowej sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki sinic bałtyckich poprzez analizę zmian ich liczebności, morfologii, zawartości barwników asymilacyjnych, fluorescencji chlorofilu a oraz tempa fotosyntezy. 2
MATERIAŁ I METODY Materiał wykorzystywany w doświadczeniach stanowiły szczepy bałtyckich pikoplanktonowych sinic Synechococcus sp. (BA-124), oraz sinic Geitlerinema amphibium (BA-13), Nodularia spumigena (BA-15), Nostoc sp. (BA-81) i Synechocystis sp. (BA-153), które pochodziły z Kolekcji Kultur Glonów Bałtyckich (CCBA). W celu zbadania zjawiska allelopatii występującego u analizowanej sinicy Synechococcus sp. została wykorzystana metoda cross-culturing [15]. W metodzie tej badania określające oddziaływanie allelopatyczne były prowadzone poprzez dodanie 2 ml przesączu uzyskanego z Synechococcus sp. do hodowli wszystkich badanych sinic. Przesącz pochodził z przefiltrowania kultur Synechococcus sp. przez sączki z bibuły szklanej Whatman GF/C i był dodawany raz, na początku eksperymentu oraz wielokrotnie do 25 ml kolb Erlenmeyera zawierających 20 ml testowanych organizmów. W pracy wyznaczono korelację liniową między zawartością chlorofilu a zmierzoną dla nich gęstością optyczną (OD). Posłużyło to do określenia stężenia chlorofilu a w hodowlach we wszystkich eksperymentach jedynie na podstawie pomiarów OD. Następnie przygotowywano hodowle właściwe tak by miały one zawsze wyjściowe stężenie chlorofilu a na poziomie wynoszącym 0,8 µg chl a ml -1. Próby kontrolne były sporządzane przez dodanie pożywki mineralnej f/2 [7] o objętości równej dodawanego przesączu. W przypadku doświadczeń z wielokrotnym dodaniem przesączu, codziennie było usuwane z każdej kolby po 2 ml zawiesiny komórkowej i dodawana była równoważna ilość przesączu w celu uzyskania stałej objętości hodowli przez cały czas trwania eksperymentu. Każdy wariant doświadczenia był prowadzony w trzech powtórzeniach, a wyniki eksperymentów zostały przedstawione jako wartość średnia z trzech niezależnych pomiarów. Opracowanie statystyczne wyników wykonano przy użyciu arkusza kalkulacyjnego MS Excel oraz programu komputerowego Statistica 12. Testowanie istotności różnic pomiędzy średnimi wykonano za pomocą metody statystycznej ANOVA dla układów jednoczynnikowych na przyjętym poziomie istotności α=0,05. W przeprowadzonych badaniach koncentracja komórek sinic w hodowlach określona została przez pomiar gęstości optycznej (OD), która mierzona była na spektrofotometrze Thermo Scientific model Multiskan GO, dla długości fali 750 nm. W eksperymentach z dodanym przesączem, do pomiaru fluorescencji została zastosowana metoda pulsacyjnej modulacji amplitudy (PAM), do której użyto fluorymetru firmy Hansatech FSM-1. W pracy określono maksymalną kwantową wydajność fotosystemu II (Fv/Fm) oraz rzeczywistą wydajność fotosystemu II na świetle (ФPSII) [3]. W przeprowadzanych doświadczeniach pomiary tempa fotosyntezy zostały wykonane metodą polarograficzną przy użyciu elektrody tlenowej Clarka w odpowiednich komorach układu Chlorolab-2, firmy Hansatech. Przebieg krzywych świetlnych został dopasowany do danych pomiarowych z wykorzystaniem programu komputerowego Statistica 12 i funkcji podanej przez Jassby i Platt [8]. Koncentracja barwników chlorofilowych, karotenoidowych i fikobilinowych została wyznaczona za pomocą metody spektrofotometrycznej przy użyciu wzorów Strickland i Parsons [14], Jeffrey i Humphrey [9] oraz Bennett i Bogorad [1]. Zdjęcia komórek badanych sinic wykonano przy użyciu mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse 80i z kontrastem Nomarskiego. 3
WYNIKI Doświadczenia z pojedynczym i wielokrotnym dodaniem przesączu uzyskanym z kultur sinic Synechococcus sp. wykazały hamujący wpływ na liczebność komórek sinic G. amphibium, N. spumigena i Nostoc sp. (Rys. 1). Jedynym gatunkiem, który nie wykazywał wrażliwości na dodany przesącz była sinica Synechocystis sp. (p>0,05). Największy spadek wzrostu 7 dnia eksperymentu z dodatkiem pojedynczego i wielokrotnego przesączu wykazała sinica G. amphibium, której odpowiedź wynosiła odpowiednio 48% i 56% w stosunku do kontroli (p<0,05). Rys. 1. Liczebność komórek (% kontroli) G. amphibium (BA-13), N. spumigena (BA-15), Nostoc sp. (BA-81) i Synechocystis sp. (BA-153) uzyskana 1, 3 i 7 dnia hodowli z dodatkiem a) pojedynczego i b) wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. Wartości przedstawiono jako średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach. * - oznacza różnice istotne statystycznie w stosunku do kontroli (α=0,05). Po tygodniu badań wykonano także pomiary krzywych świetlnych fotosyntezy dla G. amphibium (Rys. 2). W przeprowadzonym eksperymencie z dodaniem pojedynczego i wielokrotnego przesączu z Synechococcus sp. wykazano spadek tempa fotosyntezy, a ilość produkowanego tlenu była odpowiednio około 3-krotnie i 5-krotnie niższa niż w warunkach kontrolnych. Rys. 2. Krzywe świetlne fotosyntezy dla G. amphibium (BA-13) uzyskane 7 dnia hodowli dla kontroli i doświadczeń z dodatkiem: a) pojedynczego i b) wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. (wartości średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach). W pracy zbadano również parametry fluorescencji Fv/Fm i ФPSII dla sinicy G. amphibium uzyskane w kontroli i doświadczeniach z dodaniem przesączu otrzymanego z kultur Synechococcus sp. (Rys. 3). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że parametry fluorescencji u analizowanej sinicy po pojedynczym dodaniu przesączu wykazały niewielką stymulację, zaś po 4
wielokrotnym dodaniu przesączu wykazały wyraźny spadek, który 7 dnia eksperymentu wynosił około 94% dla Fv/Fm i 57% dla ФPSII w stosunku do kontroli. Rys. 3. Wartości (% kontroli) parametru fluorescencji Fv/Fm i ΦPSII dla G. amphibium (BA-13) odnotowane 7 dnia w doświadczeniach z dodatkiem pojedynczego i wielokrotnego przesączu otrzymanego z hodowli sinicy Synechococcus sp. Wartości przedstawiono jako średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach. * - oznacza różnice istotne statystycznie w stosunku do kontroli (α=0,05). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że przesącz istotnie wpływał na ilość chlorofilu a oraz barwników fikobilinowych w komórkach G. amphibium (Rys. 4). W pracy zanotowano także niewielki spadek ilości barwników karotenoidowych, jednakże wpływ ten nie był istotny statystycznie (p>0,05). Rys. 4. Zawartość barwników fotosyntetycznych (% kontroli) dla G. amphibium (BA-13) uzyskana 7 dnia hodowli dla kontroli i doświadczeń z dodatkiem: a) pojedynczego i b) wielokrotnego przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. Wartości przedstawiono jako średnie ±SD przy n=3 powtórzeniach. * - oznacza różnice istotne statystycznie w stosunku do kontroli (α=0,05). Po 7 dniach hodowli zaobserwowano również widoczne zmiany morfologiczne komórek badanych sinic po dodaniu przesączu z kultur Synechococcus sp., które polegały na pękaniu i rozrywaniu nici oraz lizie komórek analizowanych sinic (Rys. 5). Rys. 5. Morfologia komórek dla a) G. amphibium, b) N. spumigena, c) Nostoc sp. i d) Synechocystis sp. uzyskana 7 dnia hodowli dla A) kontroli oraz B) po dodaniu przesączu otrzymanego z kultur sinicy Synechococcus sp. 5
DYSKUSJA Oddziaływania allelopatyczne mogą odgrywać znaczącą rolę w środowisku wodnym [5]. Uważa się, że allelopatia wpływa na występowanie gatunków, sukcesję gatunkową oraz konkurencję pomiędzy sinicami i mikroglonami [5; 11]. Mimo, iż występowanie zjawiska allelopatii jest powszechne u wielu przedstawicieli sinic, dokładny mechanizm działania i charakterystyka wielu wytwarzanych przez nie związków pozostaje wciąż niewystarczająco poznana [11]. Najbardziej powszechną metodą określania oddziaływania allelopatycznego jest analiza zmian liczebności komórek targetowych [15]. W pracy wykazano, że największa inhibicja wzrostu występowała ostatniego dnia eksperymentu dla sinicy G. amphibium, która wyniosła 48% w stosunku do kontroli. Natomiast inna pikoplanktonowa sinica Synechocystis sp. była praktycznie niewrażliwa na zadany przesącz. Ponadto zanotowano, że wielokrotne dodanie przesączu miało większy wpływ na organizmy targetowe, niż przesącz dodawany raz, na początku eksperymentu. Wykonywanie doświadczeń z wielokrotnym dodaniem przesączu powoduje, że obserwowany efekt jest bliższy sytuacji występującej w środowisku naturalnym, gdyż związki allelopatyczne są przypuszczalnie stale uwalniane do ekosystemu [15]. Także Schagerl i in. [12] w swojej pracy wykazali inhibicję wzrostu sinic Anabaena cylindrica i Microcystis flos-aquae po dodaniu przesączu z sinicy Anabaena torulosa. Uważa się, że selektywne hamowanie wzrostu poszczególnych organizmów może wpływać na sukcesję wybranych gatunków w środowisku wodnym [11]. Zmiany morfologiczne komórek zachodzące na skutek negatywnego wpływu produkowanych związków allelopatycznych są innym, notowanym sposobem działania u sinic [4]. W niniejszym eksperymencie zaobserwowano zmiany morfologiczne u wszystkich badanych nitkowatych sinic. Pod wpływem przesączu z Synechococcus sp. komórki sinic uległy lizie oraz doszło do rozerwania łańcuchów i deformacji komórek. Również Gantar i in. [4] zanotowali, że po dodaniu przesączu komórkowego z sinicy Fischerella sp. komórki Chlamydomonas sp. były wyciągnięte, tworzyły granulaty lub były puste w środku. Uzyskane wyniki mogą w części wyjaśnić możliwe przyczyny osiągania przez pikoplanktonowe sinice Synechococcus sp. przewagi konkurencyjnej nad innymi gatunkami fitoplanktonu w wielu zbiornikach wodnych. Kolejnym możliwym mechanizmem działania związków allelopatycznych jest ich wpływ na zawartość barwników asymilacyjnych i aktywność fotosyntetyczną organizmów targetowych. W przeprowadzonych badaniach wykazano spadek zawartości chlorofilu a w komórkach, tempa fotosyntezy i parametru fluorescencji ФPSII u sinicy G. amphibium pod wpływem dodania przesączu z Synechococcus sp. Dane literaturowe wskazują, że związki allelopatyczne wytwarzane przez sinice mogą wpływać na proces fotosyntezy, a szczegółowe badania wykazały, że działają one głównie na fotosystem II (PSII). Na podstawie uzyskanych danych Gross i in. [6] wykazali, że fischerellina A produkowana przez sinicę Fischerella muscicola, a także związki uwalniane przez Trichormus doliolum i Oscillatoria late-virens hamowały działanie PSII u sinic i glonów. [5]. Inhibicja fotosyntezy, głównego procesu fizjologicznego u konkurujących producentów pierwotnych, może być efektywną strategią obronną występującą u sinic [5]. 6
Wiele prac wskazuje, że sinice produkując szerokie spektrum wtórnych metabolitów, stanowią źródło nowych bioaktywnych i naturalnych związków, które mogą mieć zastosowanie w medycynie i przemyśle farmaceutycznym jako związki o działaniu antybakteryjnym, przeciwwirusowym, przeciwgrzybicznym, a nawet w zwalczaniu komórek rakowych [2; 5; 11]. Związki produkowane przez sinice mogą być również wykorzystywane w rolnictwie jako herbicydy, środki owadobójcze czy bionawóz, a także mogą mieć potencjalne zastosowanie w biotechnologii [10]. Uważa się również, że allelopatia może być jednym z istotnych czynników wpływających na formowanie się masowych zakwitów sinic w środowisku wodnym [5; 11]. Gatunki tworzące szkodliwe zakwity w wielu miejscach świata są dziś poważnym problemem, zarówno ekologicznym, jak i ekonomicznym. Mimo wagi problemu nie występuje zbyt wiele prac podejmujących temat oddziaływania allelopatycznego sinic w Morzu Bałtyckim. Dlatego tak ważne jest dostarczanie nowych informacji na temat sposobu i zakresu działania związków allelopatycznych, aby móc w przyszłości lepiej rozumieć i kontrolować nasilające się na całym świecie masowe zakwity sinic w ekosystemach wodnych. PODZIĘKOWANIA: Moją pracę badawczą przeprowadziłam w Pracowni Ekofizjologii Roślin Morskich Instytutu Oceanografii Uniwersytetu Gdańskiego pod opieką naukową Pani mgr Sylwii Śliwińskiej, której pragnę podziękować za zainspirowanie mnie do badania zjawiska allelopatii oraz ogromne wsparcie, pomoc i poświęcony czas. PIŚMIENNICTWO 1. Bennett A., Bogorad L. 1973. Complementary chromatic adaptation in freshwater blue-green alga. Journal of Cell Biology 58: 419-435. 2. Berry J.P., Gantar M., Perez M.H., Berry G., Noriega F.G. 2008. Cyanobacterial Toxins as Allelochemicals with Potential Applications as Algaecides, Herbicides and Insecticides. Marine Drugs 6: 117-146. 3. Campbell D., Hurry V., Clarke A.K., Gustafsson P., Öquist G. 1998. Chlorophyll fluorescence analysis of cyanobacterial photosynthesis and acclimation. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62 (3): 667-683. 4. Gantar M., Berry J.P., Thomas S., Wang M., Perez R., Rein K.S. 2008. Allelopathic activity among Cyanobacteria and microalgae isolated from Florida freshwater habitats. Federation of European Microbiological Societies 64: 55-64. 5. Gross E.M. 2003. Allelopathy of Aquatic Autotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences 22: 313-339. 6. Gross E.M., Wolk C.P., Jüttner F. 1991. Fischerellin, a new allelochemical from the freshwater cyanobacterium Fischerella muscicola. Journal of Phycology 27: 686-692. 7. Guillard R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith W.L., Chanley M.H. (eds.). Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA: 26-60. 8. Jassby A.D., Platt T. 1976. Mathematical formulation of the relationship between photosynthesis and light for phytoplankton. Limnology and Oceanography 21: 540-547. 9. Jeffrey S.W., Humphrey G.F. 1975. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen 167: 191-194. 10. Leflaive J., Ten-Hage L. 2007. Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters: a comparison of Allelopathic compounds and toxins. Freshwater Biology 52: 199-214. 11. Legrand C., Rengefors K., Fistarol G.O., Granéli E. 2003. Allelopathy in phytoplankton - biochemical, ecological and evolutionary aspects. Phycologia 42 (4): 406-419. 12. Schagerl M., Unterrieder I., Angeler D.G. 2002. Allelopathy among Cyanoprokaryota and Other Algae Originating from Lake Neusiedlersee (Austria). International Review of Hydrobiology 87: 365-374. 13. Stal L.J., Albertano P., Bergman B., Bröckel K., Gallon J.R., Hayes P.K., Sivonen K., Walsby A.E. 2003. BASIC: Baltic Sea cyanobacteria. An investigation of the structure and dynamics of water blooms of cyanobacteria in the Baltic Sea responses to a changing environment. Continental Shelf Research 23: 1695-1714. 14. Strickland I.D.H., Parsons T.R. 1972. A practical handbook of seawater analysis. Journal of the Fisheries Research Board of Canada 167: 1-310. 15. Suikkanen S., Fistarol G.O., Granéli E. 2004. Allelopathic effects of the Baltic cyanobacteria Nodularia spumigena, Aphanizomenon flos-aquae and Anabaena lemmermannii on algal monocultures. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 308: 85-101. 7