Allelopatyczny wpływ sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki mikroglonów i sinic bałtyckich

Transkrypt

1 III LICEUM OGÓLNOKSZTAŁCĄCE IM. MARYNARKI WOJENNEJ W GDYNI Allelopatyczny wpływ sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki mikroglonów i sinic bałtyckich Kinga Gergella Klasa II b Opiekun: mgr Małgorzata Kupczyk - Skodowska Gdynia, 214

2 STRESZCZENIE Allelopatia może być jednym z kluczowych czynników wpływających na formowanie się masowych i szkodliwych zakwitów sinic i glonów w środowisku wodnym. Uważa się, że występowanie oddziaływania allelopatycznego jest powszechne u przedstawicieli fitoplanktonu, lecz dokładny sposób działania i charakterystyka wielu wydzielanych przez nie związków chemicznych pozostaje wciąż niewystarczająco poznana [4; 1]. Pikoplanktonowa sinica Synechococcus sp. jest ważnym składnikiem morskich i słodkowodnych ekosystemów [15]. W przeprowadzonych badaniach określono wpływ przesączu z Synechococcus sp. na wybrane gatunki sinic i mikroglonów bałtyckich. Doświadczenia wykazały inhibicję wzrostu okrzemek Skeletonema marinoi i Bacillaria paxillifer, zielenicy Chlorella vulgaris oraz sinicy Nodularia spumigena. Nie zanotowano natomiast istotnych zmian liczebności dla sinicy Synechococcus sp. oraz zielenicy Oocystis submarina. Dla okrzemki S. marinoi zostały wykonane dodatkowe eksperymenty, na podstawie których stwierdzono, że dodany przesącz hamuje fluorescencję chlorofilu a oraz tempo fotosyntezy, nie wpływa za to znacząco na ilość barwników fotosyntetycznych w komórkach analizowanej okrzemki. Dla N. spumigena zostały wykonane także zdjęcia przedstawiające zmiany morfologiczne, które zaszły w jej komórkach pod wpływem dodania przesączu uzyskanego z kultur Synechococcus sp. Moją pracę badawczą przeprowadziłam w Pracowni Ekofizjologii Roślin Morskich Instytutu Oceanografii Uniwersytetu Gdańskiego pod opieką pani mgr Sylwii Śliwińskiej, której pragnę podziękować za zainspirowanie mnie do badania zjawiska allelopatii oraz udzielone wsparcie merytoryczne. WSTĘP Oddziaływanie allelopatyczne to szeroko rozpowszechnione, jednak niewystarczająco poznane zjawisko, które może występować we wszystkich ekosystemach morskich, brakicznych i słodkowodnych. Polega ono na wytwarzaniu przez niektóre gatunki fitoplanktonu aktywnych związków chemicznych, które hamują lub stymulują rozwój innych organizmów [4]. Produkcja związków allelopatycznych jest ważną adaptacją, dzięki której fotoautotrofy mogą osiągać przewagę konkurencyjną nad pozostałymi producentami pierwotnymi [12]. Uważa się, że allelopatia może być jednym z istotnych czynników wpływających na strukturę fitoplanktonu oraz formowanie się masowych zakwitów sinic i glonów w wielu zbiornikach wodnych, w tym także w Morzu Bałtyckim. Jednym z gatunków występujących licznie w Morzu Bałtyckim i wykazującym aktywność allelopatyczną jest pikoplanktonowa sinica Synechococcus sp., która może stanowić aż 8% całkowitej biomasy sinic i 5% całkowitej produkcji pierwotnej w zakwicie sinicowym [14; 18]. Głównym celem niniejszej pracy było ukazanie wpływu oddziaływania allelopatycznego pikoplanktonowej sinicy Synechococcus sp. na wybrane gatunki zielenic, okrzemek i sinic bałtyckich poprzez analizę zmian ich liczebności, morfologii, barwników asymilacyjnych, fluorescencji chlorofilu a oraz tempa fotosyntezy. 2

3 MATERIAŁ I METODY Materiał wykorzystywany w doświadczeniach stanowiły szczepy bałtyckich pikoplanktonowych sinic Synechococcus sp. (BA-124), nitkowatych sinic Nodularia spumigena (BA-15), zielenic Chlorella vulgaris (BA-8) i Oocystis submarina (BA-1) oraz okrzemek Skeletonema marinoi (BA-98) i Bacillaria paxillifer (BA-14), które pochodziły z Kolekcji Kultur Glonów Bałtyckich (CCBA). W celu realizacji doświadczeń na uchwycenie zjawiska allelopatii występującego u analizowanej sinicy Synechococcus sp. została wykorzystana metoda cross-culturing [17]. W metodzie tej badania określające oddziaływanie allelopatyczne były prowadzone poprzez dodanie 2 ml przesączu uzyskanego z Synechococcus sp. do hodowli wszystkich badanych sinic, zielenic i okrzemek. Dodanie przesączu do niezależnej hodowli sinicy Synechococcus sp. miało na celu sprawdzenie, czy zawarte w przesączu związki allelopatyczne wpływają także na organizm, który sam je produkuje. Przesącz pochodził z przefiltrowania kultur Synechococcus sp. przez sączki z bibuły szklanej Whatman GF/C i był dodawany raz, na początku eksperymentu do 25 ml kolb Erlenmeyera zawierających 2 ml testowanych organizmów. Próby kontrolne były sporządzane przez dodanie pożywki mineralnej f/2 [6] o objętości równej dodawanego przesączu. Każdy wariant doświadczenia był prowadzony w trzech powtórzeniach, a wyniki eksperymentów zostały przedstawione jako wartość średnia z trzech niezależnych pomiarów. W przeprowadzonych doświadczeniach koncentracja komórek w hodowlach określona została przez pomiar gęstości optycznej bałtyckich szczepów sinic i glonów. Gęstość optyczna (OD) mierzona była na spektrofotometrze Thermo Scientific model Multiskan GO, dla długości fali 75 nm. Koncentracja barwników chlorofilowych i karotenoidowych została wyznaczona za pomocą metody spektrofotometrycznej przy użyciu wzorów Strickland i Parsons [16] oraz Jeffrey i Humphrey [8]. W przeprowadzonych doświadczeniach do pomiaru fluorescencji została zastosowana metoda pulsacyjnej modulacji amplitudy (PAM), do której użyto fluorymetru firmy Hansatech FSM-1 [1]. W pracy określono maksymalną kwantową wydajność fotosystemu II (Fv/Fm) oraz rzeczywistą wydajność fotosystemu II na świetle (ФPSII). W przeprowadzanych doświadczeniach pomiary tempa fotosyntezy zostały wykonane metodą polarograficzną przy użyciu elektrody tlenowej Clarka w odpowiednich komorach układu Chlorolab-2, firmy Hansatech. Przebieg krzywych świetlnych został dopasowany do danych pomiarowych z wykorzystaniem programu komputerowego Statistica 1 i funkcji podanej przez Jassby i Platt [7]. Zdjęcia komórek N. spumigena wykonano przy użyciu mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse 8i z kontrastem Nomarskiego. Opracowanie statystyczne wyników wykonano przy użyciu arkusza kalkulacyjnego MS Excel oraz programu komputerowego Statistica 1. Testowanie istotności różnic pomiędzy średnimi wykonano za pomocą metody statystycznej ANOVA dla układów jednoczynnikowych, na przyjętym poziomie istotności p=,5.

4 WYNIKI Doświadczenia z dodaniem przesączu uzyskanym z kultur sinic Synechococcus sp. wykazały hamujący wpływ na liczebność komórek sinicy N. spumigena, zielenicy C. vulgaris oraz okrzemek B. paxillifer i S. marinoi (Rys. 1). Jedynym gatunkiem, który nie wykazywał wrażliwości na dodany przesącz była zielenica O. submarina. W pracy wykazano, że największy spadek wzrostu 14 dnia eksperymentu wykazała okrzemka S. marinoi, której odpowiedź wynosiła 82% w stosunku do kontroli (1%). Dodatkowo zaobserwowano, że przesącz 7 i 1 dnia powodował stymulację wzrostu u Synechococcus sp., jednakże wpływ ten nie był istotny statystycznie (ANOVA, p>,5). A) B) Liczebność komórek (N 1 6 ml -1 ) Synechococcus sp. BA kontrola BA BA C) D) Liczebność komórek (N 1 6 ml -1 ) Oocystis submarina BA-1,8 kontrola BA-1,7 BA-1 + BA-124,6,5,4,,2, E) F) Bacillaria paxillifer BA-14 Liczebność komórek (N 1 6 ml -1 ) Liczebność komórek (N 1 5 ml -1 ) 12 1,5 9 7,5 6 4,5 1,5 1,5,9,75,6,45,,15 Nodularia spumigena BA-15 kontrola BA-15 BA-15 + BA kontrola BA-8 BA Chlorella vulgaris BA Skeletonema marinoi BA-98 Liczebność komórek (N 1 5 ml -1 ),5,4,,2,1 kontrola BA-14 BA-14 + BA Liczebność komórek (N 1 6 ml -1 ) 2,5 2 1,5 1,5 kontrola BA-98 BA-98 + BA Rys. 1. Liczebność komórek dla A) Synechococcus sp., B) N. spumigena, C) O. submarina, D) C. vulgaris, E) B. paxillifer i F) S. marinoi uzyskana w kontrolach i doświadczeniach z dodaniem przesączu otrzymanego z kultur Synechococcus sp. 4

5 W pracy zbadano również ilość barwników asymilacyjnych, parametry fluorescencji i tempo fotosyntezy dla okrzemki S. marinoi oraz zmiany morfologiczne sinicy N. spumigena uzyskane w kontrolach i doświadczeniach z dodaniem przesączu otrzymanego z kultur Synechococcus sp. (Rys. 2). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że dodany przesącz hamował fluorescencję chlorofilu a oraz tempo fotosyntezy u S. marinoi. W niniejszej pracy zanotowano, że parametry fluorescencji u analizowanej okrzemki wykazały wyraźny spadek, który 14 dnia eksperymentu wynosił około 67% dla Fv/Fm i 52% dla ФPSII w stosunku do kontroli (1%). Po 2 tygodniach badań wykonano również pomiary krzywych świetlnych fotosyntezy dla S. marinoi. W przeprowadzonym eksperymencie wykazano spadek fotosyntezy, gdzie ilość produkowanego tlenu dla kontroli i doświadczeń z dodaniem przesączu uzyskanego z Synechococcus sp. wynosiła odpowiednio 18 µmolo2/kom 1 9 /h i 4 µmolo2/kom 1 9 /h. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono natomiast, że przesącz nie wpływał istotnie na ilość chlorofilu a, chlorofilu c oraz barwników karotenoidowych w komórkach S. marinoi (ANOVA, p>,5). Natomiast po 2 tygodniach hodowli zaobserwowano również widoczne zmiany morfologiczne komórek sinicy N. spumigena po dodaniu przesączu z kultur Synechococcus sp., które polegały na pękaniu i rozrywaniu nici oraz lizie komórek analizowanej sinicy. A) B) Ilość barwników fotosyntetycznych (pg/kom) 1,2 1,8,6,4,2 BA-98 kontrola BA chlorofil a chlorofil c karotenoidy parametry fluorescencji,9,75,6,45,,15 fv/fm ФPSII BA-98 kontrola BA C) D) Rys. 2. Wykresy przedstawiające: A) ilość barwników fotosyntetycznych, B) parametry fluorescencji chlorofilu a, C) tempo fotosyntezy dla S. marinoi oraz D) zmiany morfologiczne (a - kontrola, b - eksperyment) dla N. spumigena uzyskane w kontrolach i doświadczeniach z dodaniem przesączu otrzymanego z kultur Synechococcus sp. 5

6 DYSKUSJA Allelopatia w środowisku wodnym może powodować czy ułatwiać dominację poszczególnych gatunków sinic, glonów czy roślin wyższych [4]. Badania wykazały, że oddziaływanie allelopatyczne może występować we wszystkich środowiskach wodnych, zarówno morskich, brakicznych, jak i słodkowodnych, a producenci pierwotni są zdolni do produkowania licznych, aktywnych związków allelopatycznych, które wpływają na cały otaczający je ekosystem. Najbardziej powszechną metodą określania oddziaływania allelopatycznego jest analiza zmian liczebności i tempa wzrostu komórek targetowych [17]. W moim doświadczeniu największa inhibicja wzrostu ostatniego dnia eksperymentu była zaobserwowana dla okrzemki S. marinoi, która wyniosła 82% w stosunku do kontroli. Podobne wyniki uzyskała m.in. Keating [9; 1] wykazując inhibicję wzrostu okrzemek pod wpływem dodania przesączu z wody jeziora, w którym dominowały sinice oraz Lafforgue i in. [11], którzy udowodnili, że niska biomasa okrzemki Fragilaria crotonensis z jeziora Aydat była efektem hamowania wzrostu przez metabolity pochodzące z sinic Anabena sp. Kolejnym sposobem działania związków allelopatycznych jest wpływ na aktywność fotosyntetyczną mikroglonów i sinic. W mojej pracy wykazałam spadek tempa fotosyntezy okrzemki S. marinoi pod wpływem przesączu z Synechococcus sp., który 14 dnia eksperymentu wyniósł około 2% w stosunku do kontroli. Dane literaturowe wskazują, że niektóre gatunki sinic z rodzaju Microcystis znane są z produkowania mikrocystyn peptydów, hamujących fosfatazę białkową, która może wpływać na przebieg procesu fotosyntezy [2]. Ponadto Sukenik i in. [18] zaobserwowali spadek wzrostu Nostoc muscorun i Anabena sp., który związany był z ograniczeniem tempa fotosyntezy. Suikkanen i in. [17] zasugerowali, że na obserwowany efekt może mieć wpływ aspekt ewolucyjny. Okrzemka S. marinoi jest typowym gatunkiem wiosennych zakwitów w Morzu Bałtyckim, który w naturalnym środowisku nie występuje licznie podczas zakwitów sinic. Stąd okrzemki mogły nie wytworzyć mechanizmów obronnych przed związkami produkowanymi przez sinice, co również pokazano w niniejszej pracy. Zmiany morfologiczne komórek są również możliwym mechanizmem działania związków allelopatycznych [2; 19]. W niniejszym eksperymencie zostały zaobserwowane zmiany morfologiczne u N. spumigena. Pod wpływem przesączu z Synechococcus sp. komórki sinicy stały się puste oraz doszło do rozerwania łańcuchów komórek. W 214 roku Śliwińska i in. [19] również wykazali deformację oraz lizę komórek zielenicy C. vulgaris pod wpływem przesączu z Synechococcus sp. Natomiast wyniki zaprezentowane przez Valdor i Aboal [2], wykazały, że przesącz z sinic z rzędu Oscillatoriales wpływał na rozdzielanie się nici Pseudocapsa sp. i Nostoc sp. na pojedyncze komórki. Może to świadczyć o istnieniu przewagi konkurencyjnej niektórych gatunków sinic nad innymi organizmami, które występują w tym samym zbiorniku wodnym. 6

7 Wiele prac wskazuje, że występowanie oddziaływania allelopatycznego jest często notowane u sinic, lecz dokładny sposób działania wydzielanych przez nie związków jest wciąż niewystarczająco poznany [4; 1]. Zachęceniem do dalszych doświadczeń nad allelopatią są ostatnie badania, w których wykazano, że związki allelopatyczne mogą stanowić ważną grupę bioaktywnych składników o właściwościach antyglonowych, antywirusowych, antybakteryjnych oraz antygrzybicznych [4; 12; 1]. Użycie takich związków może mieć potencjalne zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i biotechnologii. Ponadto wykorzystanie związków allelopatycznych może być efektywną alternatywą dla pestycydów używanych w rolnictwie [14]. Dostarczenie nowych informacji na temat sposobu i zakresu oddziaływania allelopatycznego różnych gatunków fitoplanktonu może mieć również ważne znaczenie dla lepszego zrozumienia i możliwości późniejszego kontrolowania nasilających się na całym świecie masowych zakwitów sinic i mikroglonów w ekosystemach wodnych. PIŚMIENNICTWO 1. Campbell D., Hurry V., Clarke A.K., Gustafsson P., Öquist G Chlorophyll fluorescence analysis of cyanobacterial photosynthesis and acclimation. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62 (), Carmichael W.W The toxins of cyanobacteria. Scientific American 27, Engström-Öst J., Koski M., Schmidt K., Viitasalo M., Jónasdóttir S.H., Kokkonen M., Repka S., Sivonen K. 22. Effects of toxic cyanobacteria on a plankton assemblage: community development during decay of Nodularia spumigena. Marine Ecology Progress Series 22, Gross E.M. 2. Allelopathy of Aquatic Autotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences 22, Gross E.M., Wolk C.P., Jüttner F Fischerellin, a new allelochemical from the freshwater cyanobacterium Fischerella muscicola. Journal of Phycology 27, Guillard R.R.L Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In Smith, W.L. and Chanley M.H. (eds.), Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA, Jassby A.D., Platt T., 1976, Mathematical formulation of the relationship between photosynthesis and light for phytoplankton. Limnology and Oceanography 21, Jeffrey S.W., Humphrey G.F New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen 167, Keating K.I Allelopathic influence on blue-green bloom sequence in a eutrophic lake. Science 196, Keating K.I Blue-green algal inhibition of diatom growth: transition from mesotrophic to eutrophic community structure. Science 199, Lafforgue M., Szeligiewicz W., Devaux J, Poulin M Selective mechanisms controlling algal succession in Aydat Lake. Water Science and Technology 2, Leflaive J., Ten-Hage L. 27. Algal and cyanobacterial secondary metabolites in freshwaters: a comparison of Allelopathic compounds and toxins. Freshwater Biology 52, Legrand C., Rengefors K., Fistarol G.O., Granéli E. 2. Allelopathy in phytoplankton - biochemical, ecological and evolutionary aspects. Phycologia 42 (4), Putnam A.R., Duke W.B Biological susppression of weeds: evidence of allelopathy in accessions of cucumber. Science 185, Stal L.J., Albertano P., Bergman B., Bröckel K., Gallon J.R., Hayes P.K., Sivonen K., Walsby A.E. 2. BASIC: Baltic Sea cyanobacteria. An investigation of the structure and dynamics of water blooms of cyanobacteria in the Baltic Sea responses to a changing environment. Continental Shelf Research 2, Strickland I.D.H., Parsons T.R A practical handbook of seawater analysis. Bul. Journal of the Fisheries Research Board of Canada 167, Suikkanen S., Fistarol G.O., Granéli E. 24. Allelopathic effects of the Baltic cyanobacteria Nodularia spumigena, Aphanizomenon flos-aquae and Anabaena lemmermannii on algal monocultures. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 8, Sukenik A., Eshkol R., Livne A., Hadas O., Rom M., Tchernov D., Vardi A., Kaplan A. 22. Inhibition of growth and photosynthesis of the dinoflagellate Peridinium gatunense by Microcystis sp. (cyanobacteria): A novel allelopathic mechanism. Limnology and Oceanography 47 (6), Śliwińska S., Skauradszun M., Niemirycz E., Latała A The production and release of allelopathic compounds by Baltic cyanobacteria. Ecology and Safety 8, Valdor R., Aboal M. 27. Effects of living cyanobacteria, cyanobacterial extracts and pure microcystins on growth and ultrastructure of microalgae and bacteria. Toxicon 49,