r. Darłowo

TESTOWANIE TECHNOLOGII PRODUKCJI PSTRĄGA STOSOWANYCH W POLSCE W ŚWIETLE ROZPORZĄDZENIA KOMISJI (WE) NR 710/2009 ŚRODOWISKOWA I PROZDROWOTNA OPTYMALIZACJA PRODUKCJI 01. 03. 2014 r. Darłowo

TECHNOLOGIE CHOWU I HODOWLI PSTRĄGA TĘCZOWEGO A KSZTAŁTOWANIE SIĘ MECHANIZMÓW ODPORNOŚCI E. Terech-Majewska1, E. Kaczorek1, J. Małaczewska1, A. Lepa2, E. Głąbski2, E. Szczucińska1, B. Kazuń2, K. Kazuń2, M. Zembrzuska1, A.K. Siwicki1 Zembrzuska1, A.K. Siwicki1 1Uniwersytet Warmińsko-Mazurski 2Instytut Rybactwa Śródlądowego im. S. Sakowicza 1Uniwersytet Warmińsko-Mazurski 2Instytut Rybactwa Śródlądowego im. S. Sakowicza

Walory biologiczne Choroba Infekcja Czynniki środowiskowe (fizyczne, chemiczne) Efekty terapeutyczne Czynniki biologiczne (mikroorganizmy, pasożyty)

Czynniki biologiczne Wirusy, bakterie, grzyby, pasożyty Zagrożenie jest skorelowane: głównie ze zmianami w środowisku, brakiem kontroli, brakiem higieny w warunkach hodowlanych ułatwionym kontaktem ryb i możliwością bezpośredniego przenoszenia tych czynników

Zakres badań Badania kliniczne anatomopatologiczne bakteriologiczne i wirusologiczne immunologiczne i biochemiczne Każdorazowo zastosowano premedykację przed rozpoczęciem badań zanurzenie w roztworze Propiscinu (IRS) w stężeniu 1 ml preparatu/litr Badano ryby zdrowe, o wielkości handlowej S i D wody

WYNIKI We wszystkich gospodarstwach o systemie OOH i RAS izolowano głównie saprofityczną, warunkowo chorobotwórczą florę bakteryjną, Aeromonas sp. i Pseudomonas sp., występującą w wodach otwartych, na powłokach zewnętrznych ryb hodowlanych i wolnożyjących. W gospodarstwie 3-OOH u ryb S i D oraz 2-RAS u ryb S i D stwierdzono na wiosnę 2012 r. obecność bakterii Aeromonas salmonicida, które są czynnikiem etiologicznym furunkulozy u ryb łososiowatych.

Ogółem izolowano 16 rodzajów czynników bakteryjnych częstotliwość izolowania była zróżnicowana w zależności od rodzajów gospodarstw W próbkach z gospodarstw w systemach RAS nie stwierdzono Vibrio fluvialis, W systemach OOH nie stwierdzono Pasteurella pneumotropica

W Polsce największe znaczenie w patologii ryb hodowlanych mają mezolfilne, ruchliwe bakterie Aeromonas sp. (grupa fenotypowa Aer. hydrophila complex, Aer. sobria complex), psychrofilne Aer. salmonicida, różne gatunki Pseudomonas sp. i Flavobacterium sp., Shewanella putrefaciens, Yersinia ruckeri W ostatnich latach notowane są przypadki zakażeń Acinetobacter sp., Citrobacter freundi, Hafnia alvei, Mycobacterium sp., Lactococcus sp., Pseudomonas chlororaphis, Streptococcus sp.

Badania wirusologiczne Prowadzono w kierunku VHS, IHN, IPN i Herpes SAlHV-2. Materiał do badań stanowiły wycinki skrzeli, nerki, śledziony, wątroby oraz mózgu, które pobierano jałowo do pojemników transportowych i przetrzymywano w stanie zamrożenia (-20 C). Izolację wirusów prowadzono metodami biologicznymi, a identyfikację (materiału genetycznego) wirusów wykonywano metodami molekularnymi PCR i Nested-PCR wg procedur stosowanych w ZPiIR IRS i zalecanych przez laboratoria referencyjne.

Choroby nieegzotyczne ryby łososiowate CHOROBA GATUNKI PODATNE Wirusowa posocznica krwotoczna ryb łososiowatych (Viral haemorrhagic septicaemia) Ryby należące do rodziny Salmonideae, lipień (Thymallus thymallus), głąbiele (Coregonus spp.), szczupak (Esox lucius), turbot (Scophthalmus maximus), śledź i szprot ( Clupea spp. ), ł o s o ś p a c y f i c z n y (Oncorhynchus spp.), dorsz atlantycki (Gadus morhua), dorsz pacyficzny (G. macrocephalus), plamiak (G. aeglefinus) i Onos mustelus. Zakaźna martwica układu krwiotwórczego ryb łososiowatych (Infectious haematopoietic necrosis) Ryby należące do rodziny Salmonidae, szczupak (Esox lucius) Zakaźna anemia łososi (Infectious salmon anaemia) Łosoś atlantycki (Salmo salar), pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss), troć (Salmo trutta),

Sytuacja epizootyczna IHN-2011

Badania immunologiczne Dla oceny sprawności układu immunologicznego wybrano te wskaźniki, które umożliwiają ocenę naturalnych procesów, istotnych dla obrony przed szkodliwymi czynnikami środowiska Odporność nieswoista stanowi pierwszą i drugą linię obrony organizmu

Ocena poziomu nieswoistej odporności humoralnej aktywność lizozymu w surowicy z użyciem bakterii Micrococcus lysodeikticus poziom białka całkowitego w surowicy metodą biuretową przy zastosowaniu zestawu Diagnostic Kits Protein Total Reagents (Sigma) poziom gamma-globulin z użyciem metody biuretowej (zestaw Diagnostic Kits Protein Total Reagents - Sigma) oraz glikolu polietylenowego 10000 (Sigma) poziom ceruloplazminy białek ostrej fazy kortyzolu laktoferyny

Mukolityczny enzym W surowicy W śluzie W skrzelach Narządach imunokompetentnych Aktywność bójcza wobec bakterii G+, G-, wirusów, pasożytów Pobudza fagocytozę aktywując fagocyty Lizozym

alfa 2- glikoproteina Prawdopodobnie produkowana w wątrobie Odpowiada za transport Cu Usuwa wolne rodniki Ceruloplazmina

Oceny poziomu nieswoistej odporności komórkowej RBA (Respiratory Burst Activity) zdolność do wewnątrzkomórkowego wybuchu tlenowego, izolowanych z krwi oraz ze śledziony leukocytów, zawieszanych w gradiencie Gradisol G (Polfa), oznaczono za pomocą metody spektrofotometrycznej po stymulacji komórek PMA (Phorbol Myristate Acetate), PKA (Potential Killing Activity) aktywność bójcza fagocytów krwi oraz makrofagów izolowanych ze śledziony zawieszanych w gradiencie Gradisol G (Polfa), oznaczano przy użyciu metody spektrofotometrycznej, po stymulacji komórek bakteriami Aeromonas hydrophila, LyP - odpowiedź proliferacyjna limfocytów T (LyTP) stymulowanych konkanawaliną A (ConA, Sigma) oraz limfocytów B (LyBP) stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) przy użyciu metody MTT, limfocyty krwi oraz ze śledziony izolowano po wirowaniu komórek w gradiencie Gradisol L (Polfa).

Na odporność nieswoistą wpływa temperatura- wzrastająca wpływa na wzrost poziomu lizozymu w surowicy, koncentrację IgM, a także ekspresję molekuł i cytokin; długość dnia świetlnego i pora roku - wzrost poziomu lizozymu i IgM w surowicy (wiosna); stres- czynniki stresogenne, t.j. zanieczyszczenie środowiska, stopień natlenienia wody, nadmierne zagęszczenie ryb, transport, a nawet obsługa.

Najwyższy potencjał odporności komórkowej i humoralnej stwierdzono w gospodarstwie 1-OOH we wszystkich okresach badawczych zarówno w 2011 r. jak i 2012 r.

Aktywność lizozymu w różnych pobraniach u ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 1 70 60 Lizozym mg/l 50 40 30 20 10 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Gr S Gr D Terminy pobrań Aktywnosć ceruloplazminy w różnych pobraniach próbek u ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 1 Poziom ceruloplazminy (IU) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Terminy pobrań Gr S Gr D

Statystycznie istotne obniżenie aktywności komórkowych mechanizmów obronnych u ryb D i S w dwóch gospodarstwach 3-OOH i 3-RAS, gdzie stwierdzono w 2011 r. w dwóch okresach badawczych obecność wirusa IPN 3-OOH i 3-RAS

IPN ma silne działanie obniżające aktywność fagocytów krwi i makrofagów oraz limfocytów T i B, czego wynikiem jest obserwowane obniżenie aktywności lizozymu Oraz Wzrost poziomu ceruloplazminy

Aktywność lizozymu w różnych pobraniach od ryb w Gr S i Gr D z gosp. OOH 3 Lizozym mg/l 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Gr S Gr D Terminy pobrań Aktywność lizozymu w róznych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3 50 Lizozym mg/l 40 30 20 10 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Terminy pobrań GR S GR D

Aktywność ceruloplazminy w róznych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 3 POziom ceruloplazminy (IU) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Terminy pobrań Gr S Gr D Aktywnośc ceruloplazminy w różnych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3 Ceruloplazmina (IU) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.2012 Terminy pobrań Gr S Gr D

W okresie wiosennym 2011 roku statystycznie istotny wzrost aktywności ceruloplazminy, białka ostrej fazy, co jednoznacznie wskazuje na aktywację hepatocytów związaną z infekcją wirusową Poziom białka całkowitego oraz Ig był zbliżony zarówno u ryb z gospodarstw OOH jak RAS Jedynie obserwowano statystycznie istotny spadek białka całkowitego w okresie badań jesiennych u ryb z gospodarstw 3-OOH i 3-RAS, gdzie stwierdzono obecność wirusa IPN

Na podstawie uzyskanych wyników badań nie stwierdzono istotnych różnic w parametrach nieswoistej odporności komórkowej i humoralnej u pstrągów tęczowych pochodzących ze zróżnicowanych systemów chowu OOH i RAS, Wysoki potencjał odporności przeciwzakaźnej nie pozwalał na pojawienie się objawów chorobowych u badanych ryb. Stwierdzenie obecności wirusa IPN pozwoliło na obiektywną ocenę jego wpływu na komórkowe i humoralne mechanizmy obronne w gospodarstwach o odmiennych systemach chowu.

Birnaviridae Aquabirnavirus, wirus zakaźnej martwicy trzustki Infectious pancreatis necrosis - IPN izolowany jest od 33 rodzin ryb, 11 gatunków mięczaków, 4 rodzin skorupiaków; powszechne jest nosicielstwo; pierwsza izolacja w 1960 r. w USA (1941 r.); Chorobę stwierdza się w USA, Kanadzie, w krajach Płn. i Płd. Europy (Norwegia, Szkocja, Hiszpania, Grecja, Turcja, także Polska), w krajach Płd. Ameryki (Meksyk, Chile), a także w Japonii.

Występowanie wirusa IPN (kolor żółty) (RAIDAL S. i in.; 2004)

Antychowicz, 2008 r. - badania prowadzone w PIWet-PIB w Puławach

Antychowicz 2008 - badania prowadzone w PIWet-PIB w Puławach

Gatunki ryb wrażliwe na IPNV: pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss); pstrąg źródlany (Salmo fontinalis); pstrąg potokowy (Salmo trutta morpha fario L.); łosoś bałtycki (Salmo salar); troć wędrowna (Salmo trutta m. trutta). Inne gatunki to: halibut, węgorz, danio * danio pręgowane, a także małże i skorupiaki.

Birnaviridae Budowa wirionu Birnavirusa: kwas nukleinowy w formie dsrna; kapsyd białkowy; nie posiadają otoczki. Wirion ma kształt kulisty i wykazuje symetrię ikozaedralną, tzw. T13; Średnica cząsteczki wirusa wynosi 60 nm.

Funkcje białek wirusowych Część A genomu (większa 3092 pz) - koduje 4 białka VP2, VP3, VP4 (NS), VP5 Część B genomu (mniejsza 2784 pz) koduje cząstkę VP1 VP1 jest największym białkiem wirusa, polimeraza, nie jest związana z wirulencją. VP-2 jest białkiem głównego kapsydu białkowego, to antygen grupowo swoisty. VP-2 i VP-3 są ze sobą związane. Nie posiadają one epitopów wiążących przeciwciała na IPNV. VP4 czyli NS (non structure) funkcjonuje jako koenzym współgrający z enzymami komórki gospodarza, co służy namnożeniu wirusa. VP 5 białko antyapoptotyczne.

Wirus jest bardzo trudny do sklasyfikowania genotyp nie równa się serotypowi, niepatogenne serotypy IPNV mogą być serologicznie identyczne z formami patogennymi (w testach SN) Od 1988 r., uznaje się 3 serogrupy (A-C) wraz ze swoimi serotypami, Grupa I (A) obejmuje wirusy patogenne dla ryb (9 serotypów A1-A9) Sp, Ab, He, Te, Can1, Can2, Can3, Jasper, VR-299, są od siebie dość odległe serologicznie. Grupa II (B) tzw. TV- od Tellina virus, od mięczaka Tellina tennis dotyczy mięczaków. Grupa III (C) to wszystkie wirusy IPN - podobne

Udało się wydzielić 6 genogrup i przyporządkować je pochodzeniu geograficznemu oraz klasyfikacji serologicznej Stwierdza się duże zróżnicowanie i zmienność w budowie antygenowej, zjadliwości oraz patogenności badanych szczepów wirusa IPN Budowa molekularna zmienia się, genom ulega mutacjom, co także determinuje cechy patogenności

Źródła zakażenia wirusem IPN: Woda główny wektor Ptaki wodne: wykazano, że wirus IPN może być przenoszony na pazurach i dziobach ptaków oraz za pośrednictwem upuszczonych przez nie zakażonych ryb; Ssaki wodne, a także inne, które współprzebywają w gospodarstwie; Kał ptaków (IPNV jest oporny na działanie niskich ph); Zaschnięty śluz ryb, którym pokryty jest sprzęt rybacki.

Źródła zakażenia wirusem IPN Produkty płciowe IPNV może się znajdować na zewnątrz lub wewnątrz komórek płciowych, u pstrąga tęczowego i źródlanego jest potwierdzony mechanizm (u pstrąga tęczowego także w nasieniu), Wydzieliny wyrostków pylorycznych, trzustki oraz nerki (wydalany do środowiska), Wirus IPN jest uwalniany do środowiska po rozkładzie zwłok śniętych ryb, IPNV przeżywa w leukocytach krwi i w nerce (ochrona przed niszczeniem przez UI gospodarza.

IPNV jest stabilny i bardzo oporny na warunki środowiskowe: W temp. 20 ºC może przetrwać w wodzie maksymalnie 3 miesiące W temp. 10 ºC do 231 dni, (słonej także) Oporny na wysuszenie: w temp. między 4 ºC a 20 ºC wysuszone i przetrzymywane w laboratorium próbki wirusa wykazywały właściwości zakaźne ponad 20 dni Szczególnie długo przeżywa w rybach, np. w martwym pstrągu w temp. -20 ºC zachowuje właściwości infekcyjne ponad dwa lata

Objawy IPN: korkociągowe ruchy w czasie pływania wytrzeszcz gałek ocznych obrzęk jamy brzusznej bladość skrzeli wybroczyny w trzustce obrzęk okolicy odbytu nitkowaty galaretowaty kal nieprawidłowe stężenie chlorków we krwi zmiany martwicze trzustki i jelita martwica wątroby (narybek słodkowodny)

Patogeneza Wirus wnika do organizmu przez układ pokarmowy, - lubi kwaśne ph (pierwotne miejsce namnażania wirusa, stany zapalne, od nieżytu do krwotocznego zapalenia jelit i martwicy. Wybroczyny lub rozległe przekrwienia w okolicy odźwiernika i wyrostków pylorycznych. Wirus wędruje z krwią do nerki, trzustki oraz mięśni. Apoptoza, z wyjątkiem trzustki, hamując apoptozę w trzustce, wirus zyskuje czas na namnożenie się, po namnożeniu wirusa rozwija się wywołana apoptozą martwica narządu.

Wirus może przebywać w komórkach leukocytarnych, a szczególnie w makrofagach różnych narządów (śledziony, nerki), które chronią go przed mechanizmami obronnymi gospodarza. Często wirus IPN replikuje się w leukocytach krążących. Jest to wtedy infekcja przetrwała. Taki wirus często też ma odmienne właściwości antygenowe niż typowy IPNV. Dzieje się tak, ponieważ tylko pewna subpopulacja leukocytów jest zakażona wirusem i tylko tam wirus się namnaża. Daje to nietypowe objawy u ryb 3-4 letnich. Aktualnie obserwuje się tendencje do bezobjawowych infekcji IPNV.

Aktualnie wirus IPN jest diagnozowany na zlecenie hodowcy lub lekarza prowadzącego, nie podlega obowiązkowi monitorowania, a zatem urzędowego diagnozowania realizowanych w ramach programów nadzoru.

Rezultat amplifikacji fragmentu genu VP2 (cdna): RT PCR M P N 23 24 25 26 27 28 M P N (1 ) (2 ) Produkt długości 206 par zasad M marker GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus firmy Fermentas; składa się on z 14 oczyszczonych chromatograficznie fragmentów DNA o następujących długościach (w parach zasad): 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100; P kontrola pozytywna; N kontrola negatywna; 23-28 numery kolejnych prób; (1 ) stężenie cdna użyte w przypadku pierwszej amplifikacji; (2 ) stężenie cdna dwukrotnie większe niż w przypadku pierwszej amplifikacji.

U ryb wędrujących IPNV stanowi duże zagrożenie IPN dodatnie smolty wykazują 5x większą śmiertelność niż IPN - ujemne smolty, po zasiedleniu środowiska morskiego, sną krótko po zmianie

Istnieje możliwość szczepień! US Patent 6274147 - Method for generating nonpathogenic infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from synthetic RNA transcripts US Patent Issued on August 14, 2001 Estimated Patent Expiration Date: March 31, 2019

Zwalczanie Usuwanie wirusa z powierzchni gamet poprzez stosowanie środków biobójczych, daje możliwość stosowania profilaktyki i bioasekuracji Przenoszenie wirusa wewnątrz gamet wymusza konieczność kontroli ryb w kierunku nosicielstwa (u tarlaków) Aktualnie obserwuje się tendencje do bezobjawowych infekcji IPNV, wirusa należy diagnozować najefektywniejszymi metodami Ryby mogą być nosicielami przez całe życie

Duże straty bezpośrednie, od kilku procent do około 100% (u narybku) Wielkość śnięć jest uzależniona od gatunku i wieku ryby, warunków higienicznych, od stopnia zjadliwości patogennego szczepu wirusa. Równie istotne dla efektów hodowli jest immunosupresyjne działanie wirusa na funkcje układu odpornościowego, co sprzyja wtórnym infekcjom bakteryjnym.

Dziękuję za uwagę!