Ćwiczenie 6 Oznaczanie witaminy A i witaminy E w produktach kosmetycznych z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) I. Część teoretyczna Chromatografia cieczowa Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i stacjonarną układu chromatograficznego. Możliwość rozdzielania chromatograficznego mieszaniny wynika z faktu, że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. eluent), a druga stanowi nieruchome wypełnienie kolumny chromatograficznej lub cienką warstwę na płycie chromatograficznej (faza stacjonarna). Różnica we współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną warunkuje ich rozdzielenie. Jeżeli C s i C m oznaczają stężenia składnika odpowiednio w fazie stacjonarnej i ruchomej to współczynnik podziału (stała podziału) jest równy ich ilorazowi: K = C s C m gdzie: K jest wielkością charakteryzującą dany składnik mieszaniny i zależy od rodzaju fazy stacjonarnej. W czasie przepływu rozdzielanej mieszaniny przez fazę stacjonarną między cząsteczkami związków rozdzielanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej, ustala się równowaga dynamiczna, przy czym naturalne przemieszczanie się składników rozdzielanej mieszaniny następuje tylko w fazie ruchomej. Zatem większe wartości K oznaczają dłuższy czas przebywania w fazie stacjonarnej (większe powinowactwo do fazy stacjonarnej) i stąd późniejsze opuszczenie kolumny, natomiast te, które mają większe powinowactwo do fazy ruchomej, szybciej opuszczają kolumnę i mają niższą wartość współczynnika podziału. Na rysunku 1 przedstawiono ideę rozdzielania chromatograficznego mieszaniny składającej się z dwóch składników: A i B. Mieszaninę tę wprowadza się do fazy ruchomej w czasie, który przyjęto za zerowy i od którego rozpoczyna się proces rozdzielania składników w wyniku różnego sposobu ich oddziaływania z fazą ruchomą i nieruchomą (stacjonarną). Jeżeli składnik A oddziałuje z fazą nieruchomą znacznie słabiej niż składnik B wówczas cząsteczki obu związków dzielą się między obie fazy w różnych stosunkach, charakterystycznych dla tych składników i opisanych przez współczynniki podziału K A i K B : dla składnika A dla składnika B CAs K A = CAm CBs K B = CBm W obu przypadkach C oznacza stężenie składnika w fazie nieruchomej - stacjonarnej (C s ) i w fazie ruchomej - mobilnej (C m ). Między cząsteczkami związków rozdzielanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej, ustala się równowaga dynamiczna z wielokrotnym przechodzeniem tych cząsteczek z
jednej fazy do drugiej. Ich przenoszenie wzdłuż układu chromatograficznego jest możliwe tylko wtedy, gdy znajdują się w fazie ruchomej. Rysunek 1. Schemat rozdzielania chromatograficznego mieszaniny składającej się z dwóch składników A i B [Witkiewicz,2005]. W czasie t 1 (rys. 1) widoczny jest różny podział składników między obie fazy układu chromatograficznego i rozdzielenie tych składników. To rozdzielenie jest możliwe tylko wtedy, gdy stałe podziału tych składników różnią się (K A K B ). Z rys. 1 wynika, że w czasie t 2 składnik A został już wymyty z fazy stacjonarnej i znajduje się w fazie ruchomej, a w czasie t 3 oba składniki (A i B) są już w fazie ruchomej poza zasięgiem oddziaływania fazy stacjonarnej. Pasma stężeniowe składników po przejściu układu chromatograficznego różnią się od pasma początkowego mieszaniny. Różnica polega na poszerzeniu tych pasm i na przyjęciu kształtu krzywej Gaussa. Pasma te noszą nazwę pików chromatograficznych. Na rys. 1 widać, że pik składnika B jest szerszy niż pik składnika A. Jest on wynikiem większego rozmycia dyfuzyjnego składnika B, który dłużej przebywał w układzie chromatograficznym. HPLC Chromatografia cieczowa wykorzystuje efekt rozdziału chromatograficznego z użyciem cieczy jako fazy ruchomej. Odmianą chromatografii cieczowej jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - High Performance Liquid Chromatography), która jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną głównie do analizy złożonych próbek, zwłaszcza zawierających nielotne związki chemiczne, a w szczególności związki biologicznie aktywne. Parametry analizy z wykorzystaniem HPLC (w tym skład fazy ruchomej, wypełnienie kolumny, czas trwania procesu itp.) dopasowywane są do specyfiki próbki i analizowanych składników mieszaniny. Po opuszczeniu kolumny rozdzielone związki trafiają do detektora, gdzie generują sygnały rejestrowane w postaci pików. Istnieje wiele różnych technik detekcji i rodzaj detektora musi być odpowiedni dla wykrywanych związków.
Technikę HPLC charakteryzują następujące zalety: łatwe przeprowadzenie analiz jakościowych i ilościowych, wielokrotne wykorzystywanie kolumny HPLC bez konieczności jej regeneracji, uzyskanie efektywniejszego rozdziału składników w porównaniu z rozdziałem prowadzonym tradycyjnymi metodami, wysoka odtwarzalność uzyskiwanych wyników, relatywnie krótki czas analizy, całkowicie zautomatyzowany pomiar, możliwość zastosowania różnych typów detekcji. Budowa i zasada działania chromatografu cieczowego Do analizy techniką chromatografii cieczowej wykorzystuje się zestawy chromatografów cieczowych o budowie przedstawionej schematycznie na rysunku 2. Faza ruchoma (eluent) zasysana jest ze zbiornika (lub zbiorników) przez pompę, a następnie przez dozownik tłoczona jest na kolumnę chromatograficzną, która powinna być termostatowana. Analizowaną próbkę wprowadza się za pomocą dozownika na szczyt kolumny chromatograficznej. Pod wpływem przepływającej fazy ruchomej eluentu, składniki mieszaniny rozdzielają się podczas przepływu przez kolumnę i po wyjściu z niej są wykrywane przez detektor. Czas, jaki upływa od momentu wprowadzenia składnika na kolumnę, aż do momentu jej opuszczenia i rejestracji przez detektor w postaci piku chromatograficznego nazywany jest czasem retencji. Czas ten można regulować przez odpowiedni dobór mocy elucyjnej (wymywającej) eluentu, czyli fazy ruchomej wprowadzanej do kolumny. Składniki mieszaniny po opuszczeniu kolumny wykrywane są przez detektor. Do najczęściej używanych detektorów należą detektory spektrofotometryczne, które działają na zasadzie absorbcji światła nadfioletowego (UV: 200-400nm) lub nadfioletowego i widzialnego (UV-VIS: 200-900 nm). Stosuje się je do wykrywania związków zawierających w cząsteczce wiązania nienasycone i grupy chromoforowe, np. olefin, związków aromatycznych i barwników. Absorbcja promieniowania w zakresie UV związana jest z przejściem elektronów walencyjnych oraz elektronów par elektronowych z orbitalu o niższej energii na orbital o wyższej energii. Sygnał elektryczny z detektora jest rejestrowany za pomocą komputera w postaci piku chromatograficznego.
powierzchnia piku Analiza mieszaniny składników za pomocą HPLC pozwala na ocenę jakościową i ilościową poszczególnych składników mieszaniny. Analiza jakościowa Analiza jakościowa w chromatografii cieczowej ma na celu identyfikację składników rozdzielanej mieszaniny i opiera się na: porównaniu czasu retencji piku identyfikowanych związków z czasem retencji piku wzorca, analizowanych w jednakowych warunkach (rysunek 3). Analiza ilościowa Rysunek 3. Analiza jakościowa w chromatografii cieczowej: a) chromatogram mieszaniny związków b) chromatogram wzorca identyfikowanego związku Analiza ilościowa w chromatografii cieczowej ma na celu pomiar ilości analizowanych związków. Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując fakt, że ilość tych składników jest proporcjonalna do wysokości oraz pola powierzchni pików im odpowiadających (rysunek 4). Do obliczeń zaleca się wykorzystywanie wysokości pików pod warunkiem, że są one wąskie i symetryczne. Niestety w praktyce często mamy do czynienia z pikami szerokimi lub/i niesymetrycznymi, dlatego w takich przypadkach, do obliczeń ilościowych wykorzystuje się pole powierzchni pod pikiem analizowanego związku. 70 40 10 0 2 4 0 2 4 0 2 4 Czas (min ) Rysunek 4. Zależność pola powierzchni piku od stężenia analitu.
powierzchnia pliku Metoda wzorca zewnętrznego (metoda krzywej wzorcowej) Istotą metody wzorca zewnętrznego (external standard) jest wyznaczenie zależności pomiędzy polem powierzchni (lub wysokością) piku dla każdego z oznaczanych związków i ich stężeniem lub masą. W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne (roztwory wzorca analizowanego związku o różnych stężeniach), które dozuje się na kolumnę chromatograficzną. Na podstawie wartości pola powierzchni lub wysokości pików, odczytanych z zarejestrowanych chromatogramów wyznacza się przebieg krzywej kalibracyjnej, bądź oblicza się wartości współczynników w równaniu kalibracyjnym dla każdego z oznaczanych związków. W kolejnym etapie nastrzykuje się na kolumnę analizowaną próbkę, w której oznaczona ma być zawartość badanego składnika i odczytuje się wartości pola powierzchni, bądź wysokość odpowiadającego mu piku, następnie na podstawie ich wielkości odczytuje się stężenie z krzywej kalibracyjnej. Na rysunku 5 przedstawiono krzywą kalibracyjną i sposób postępowania w analizie ilościowej dla związku oznaczanego metodą wzorca zewnętrznego. II. Część doświadczalna 1. Oznaczenie zawartości witaminy A i witaminy E w nafcie kosmetycznej i kremie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) 45 40 35 y = 10,2 x -0,4 R 2 = 0,9996 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 stężenie analitu [mg/ml] Rysunek 5. Analiza ilościowa na podstawie krzywej kalibracyjnej otrzymanej metodą wzorca zewnętrznego Cx Zasada oznaczenia Chromatograficzne oznaczenie witamin A i E polega na ich wyekstrahowaniu z matrycy preparatu kosmetycznego, a następnie przeprowadzeniu ich rozdziału na kolumnie z użyciem detektora spektrofotometrycznego. Zawartości obu witamin w preparacie kosmetycznym określa się metodą standardu zewnętrznego w oparciu o krzywe kalibracyjne dla zestawu wzorców obu witamin o różnych stężeniach.
Wykonanie oznaczenia Przygotowanie roztworów wyjściowych z roztworów witaminy A -100µg/ml i witaminy E -1000µg/ml roztwór wyjściowy witaminy A [roztwór A o stężeniu 10µg/ml] do probówki typu eppendorf [2 ml] pobrać 100µl roztworu witaminy A o stężeniu 100µg/ml i dodać 900µl etanolu otrzymuje się roztwór A przygotowanie roztworu wyjściowego witaminy E [roztwór B o stężeniu 100µg/ml] do probówki typu eppendorf [2 ml] pobrać 100µl roztworu witaminy E o stężeniu 1000µg/ml i dodać 900µl etanolu otrzymuje się roztwór B Przygotowanie roztworów wzorcowych zawierających mieszaninę witamin A i E z roztworów wyjściowych A i B do 5 probówek typu eppendorf [2 ml] dodawać roztwory A i B zgodnie z poniższą tabelą Lp. Roztwór A [µl] Roztwór B [µl] Etanol [µl] Stężenie końcowe wzorca witaminy A [µg/ml] Stężenie końcowe wzorca witaminy E [µg/ml] 1 12,5 50 937,5 0,125 5 2 25 100 875 0,25 10 3 50 150 800 0,5 15 4 75 200 725 0,75 20 5 100 250 650 1 25 Przygotowanie preparatów kosmetycznych do analizy chromatograficznej Przygotowanie próbek preparatów kosmetycznych różni się w zależności od ich rodzaju. W przypadku preparatów bardziej złożonych typu krem stosuje się ekstrakcję do odpowiedniego układu rozpuszczalników, natomiast dla preparatów o mniej skomplikowanych matrycach, typu nafta, stosuje się jedynie rozcieńczenie odpowiednim rozpuszczalnikiem. Dokładny sposób przygotowania poszczególnych preparatów znajduje się poniżej. Przygotowanie próbki kremu: w probówce typu eppendorf (o objętości 2ml) odważyć na wadze analitycznej 50 mg kremu zawierającego witaminę A i E (wynik odczytać i zapisać z dokładnością do 0.1mg), do probówki dodać 100µl octanu etylu i 1ml heksanu, probówkę dokładnie zamknąć i wstrząsać przez 4 minuty przy użyciu wytrząsarki typu Vortex, mieszaninę odwirować przez 10 min. z szybkością 1000xg, zebrać dokładnie warstwę heksanową /górna warstwa/ do drugiej probówki typu eppendorf za pomocą pipetki Pasteura, odebraną warstwę heksanową odparować do sucha w atmosferze gazu obojętnego argonu, suchą pozostałość rozpuścić w 100µl etanolu i przenieść do viala chromatograficznego, vial umieścić w odpowiednim miejscu w autosamplerze chromatografu cieczowego. Przygotowanie próbki nafty kosmetycznej: odpipetować 50µl nafty zawierającej witaminę A i E do viala chromatograficznego, dodać 100µl etanolu, vial szczelnie zakręcić i dokładnie wymieszać po wymieszaniu vial z rozcieńczoną próbką nafty umieścić w odpowiednim miejscu w autosamplerze chromatografu cieczowego
Przeprowadzenie analizy chromatograficznej pobrać po 300 µl roztworów wzorcowych oraz przygotowanych roztworów badanych kosmetyków do oznakowanych viali chromatograficznych, które następnie umieścić w autosamplerze chromatografu cieczowego ustawić warunki analizy chromatograficznej kolumna chromatograficzna: RP C-18 (150x4.6mm, 4um) faza ruchoma: metanol (rozpuszczalnik A), oraz woda miliq (rozpuszczalnik B) elucja izokratyczna: % rozp. A : % rozp. B (97:3) szybkość przepływu fazy ruchomej: 1ml/min detekcja spektrofotometryczna przy długości fali λ=294nm objętość nastrzykiwanej próbki na kolumnę: 20µl czas analizy: 20 minut. przeprowadzić analizę chromatograficzną zgodnie z podanymi warunkami dla roztworów wzorcowych oraz przygotowanych próbek preparatów kosmetycznych wydrukować zarejestrowane chromatogramy Analiza jakościowa próbek preparatów kosmetycznych /ekstrakt z kremu i nafta/ z zarejestrowanych chromatogramów dla roztworów wzorcowych odczytać czasy retencji dla wzorców witaminy A i E, dokonać identyfikacji poszczególnych witamin w próbkach preparatów kosmetycznych na podstawie otrzymanych chromatogramów, poprzez porównanie czasów retencji pików odpowiadających witaminom A i E zawartym w preparatach kosmetycznych, z czasami retencji odczytanymi z chromatogramów zarejestrowanych w jednakowych warunkach dla roztworów wzorcowych. Analiza ilościowa próbek preparatów kosmetycznych /ekstrakt z kremu i nafta/ w oparciu o zarejestrowane chromatogramy dla roztworów wzorcowych odczytać pola powierzchni pików dla poszczególnych stężeń wzorców witaminy A i E i ich wartości zamieścić w tabeli, korzystając z faktu, że ilości analizowanych składników są proporcjonalne do powierzchni pików im odpowiadającym, sporządzić i zamieścić w sprawozdaniu wykresy krzywych wzorcowych dla obu witamin, jako graficzną zależność pola powierzchni od stężenia, na podstawie wartości pól powierzchni pików witamin A i E odczytanych z zarejestrowanych chromatogramów próbek preparatów kosmetycznych oraz krzywych wzorcowych odpowiednich witamin odczytać ich stężenie w analizowanych próbkach. Lp. Stężenie witaminy A [µg/ml] Powierzchnia piku wit A Stężenie witaminy E [µg/ml] 1 0,125 5 2 0,25 10 3 0,5 15 4 0,75 20 5 1 25 Powierzchnia piku wit E
III. Aspekt kosmetologiczny Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach Witaminy są powszechnie występującymi składnikami preparatów kosmetycznych. W piśmiennictwie istnieje wiele opracowań dotyczących ich budowy, źródeł pozyskiwania, objawów niedoboru. Witaminy w kosmetykach mogą pełnić różne funkcje. Jednak do najczęściej wykorzystywanych działań tych związków należą właściwości: przeciwutleniające, regulujące metabolizm komórkowy, nawilżające, zatrzymujące wilgoć w skórze, promieniochronne oraz regulujące procesy keratynizacji. Do grupy witamin rozpuszczalnych w tłuszczach spotykanych w preparatach kosmetycznych należą: witamina A, E, D i K. Retinol witamina A Witamina A to jedna z najwcześniej odkrytych witamin, stąd jej oznaczenie pierwszą literą alfabetu. Jest to witamina rozpuszczalna w tłuszczach, która odpowiada za proces widzenia (jej niedobór grozi ślepotą), proces wzrostu organizmu oraz wpływa na prawidłowy rozwój i formowanie się kości, włosów, paznokci i skóry.. Witamina A Witamina A zaliczana jest do witamin młodości, gdyż jej stymulujące działanie zmniejsza zmiany pojawiające się wraz z procesem starzenia. Ilość witaminy A w skórze drastycznie spada pod wpływem promieniowania słonecznego, zwłaszcza promieniowania UVA. Z tego powodu niedobory witaminy A należy regularnie uzupełniać poprzez zastosowanie produktów ze skuteczną formą witaminy A bezpośrednio na skórę. Pod nazwą witamina A kryje się wiele związków chemicznych wykazujących aktywność biologiczną charakterystyczną dla tej witaminy. Wszystkie pochodne witaminy A nazywane są RETINOIDAMI. Podstawową formą witaminy A jest retinol, pozostałe pochodne to: kwas retinowy, retinal, beta-karoten oraz związki estrowe, głównie spotykane to octan i palmitynian retinylu. Kwas retinowy (tretinoina) i jego pochodne - to najsilniej działająca forma witaminy A, która ze względu na możliwość intensywnego podrażnienia, zaczerwienienia, łuszczenia, a nawet poparzenia skóry, dostępna jest tylko w preparatach dermatologicznych na receptę. Retinal (retinaldehyd) - słabiej poznana i przebadana forma witaminy A dostępna w kosmetykach, aktualnie zarezerwowana patentem tylko dla koncernu kosmetycznego Pierre Fabre (marka Avene). Estry witaminy A (palmitynian retinylu i octan retinylu) - najtańsze i najsłabiej działające na skórę formy witaminy A, chwytliwie nazywane przez firmy kosmetyczne 'pro-retinolem', jednak w praktyce w porównaniu z czystym retinolem nie wykazują większego działania przeciwzmarszczkowego. Głównie nawilżają, zapobiegają łuszczeniu i rogowaceniu skóry, natłuszczają oraz pełnią funkcję antyoksydacyjną. Beta-karoten - pro-witamina A, występująca w roślinach, która zastosowana w kosmetykach pełni funkcję silnego antyutleniacza, zwalczającego wolne rodniki. Retinol - to główna forma witaminy A w czystej postaci, stosowana w kosmetykach, która użyta w odpowiednim stężeniu i formule ulega w komórkach skóry przekształceniu do kwasu retinowego, wykazując wysoce efektywne działanie bez powodowania intensywnego podrażnienia skóry, charakterystycznego dla retinoidów na receptę. Wielokierunkowe działania retinolu na skórę: poprawia strukturę i spoistości naskórka, co prowadzi do redukcji zrogowaciałej warstwy naskórka i wygładzenia skóry
poprzez zastąpienie uszkodzonych czynnikami fizycznymi i chemicznymi komórek skóry, zdrowymi i prawidłowo uformowanymi powoduje cofanie objawów fotostarzenia skóry przyczynia się do zwiększenia produkcji białek skóry (kolagenu i elastyny) odpowiadających za jej jędrność, a jednocześnie ma zdolność reperowania i odbudowy już zniszczonych włókien kolagenowych poprawia nawilżenie skóry poprzez stymulację produkcji kwasu hialuronowego w skórze, co sprzyja uelastycznieniu skóry i zanikowi drobnych zmarszczek wpływa na rozjaśnienie przebarwień posłonecznych i hormonalnych wykazuje działanie przeciwzapalne i sprzyja gojeniu skóry poprawia funkcjonowanie układu immunologicznego poprawia ukrwienie i koloryt skóry reguluje ilość wydzielanego łoju, zmniejsza przetłuszczanie, redukując tendencje do tworzenia zaskórników i wyprysków Aby produkty z retinolem mogły działać skutecznie, muszą spełniać dwa podstawowe warunki: ponieważ niestabilność retinolu, jest jednym z głównym problemów jego zastosowania w kosmetyce formuła i opakowanie kosmetyku muszą zagwarantować stabilność wrażliwego retinolu kosmetyk musi zawierać odpowiednio wysokie stężenie czystego retinolu, nie niższe niż 0.25% (max. do 1%). Witamina A najczęściej jest spotykana w następujących preparatach kosmetycznych: kremy, maści ochronne, mleczka kosmetyczne Tokoferol witamina E Witamina E to grupa ośmiu rozpuszczalnych w tłuszczach związków chemicznych z grupy steroli. Najbardziej rozpowszechniony jest α-tokoferol wykazujący także największą aktywność. Witamina E Naturalnym źródłem tej grupy witamin są oleje roślinne. Występuje również w niektórych świeżych roślinach, takich jak sałata, oraz w ziarnach zbóż, orzechach, nasionach słonecznika, ziarnach sezamu, jajach i dyni. Bogate w nią jest również mięso i jego przetwory. Wielokierunkowe działania retinolu na skórę: działanie antyoksydacyjne i wymiatanie wolnych rodników w fazie lipidowej, dzięki czemu chroni przed stresem oksydacyjnym składniki lipidowe skóry, zapobiega fotostarzeniu oraz chroni przed zamianami nowotworowymi skóry, działa przeciwzapalnie, sprzyja gojeniu i regeneracji uszkodzonego naskórka chroni przed poparzeniami słonecznymi, łagodzi rumień i podrażnienie oraz wzmacnia naturalne własności ochronne skóry, działa przeciwzapalnie, sprzyja gojeniu i regeneracji uszkodzonego naskórka, poprawia barierę lipidową naskórka, która ulega osłabieniu z wiekiem, dzięki czemu skóra staje się lepiej nawilżona, bardziej elastyczna, wygładzeniu ulegają drobne zmarszczki, normalizuje powstawanie kolagenu, powstrzymuje zbyt duży wzrost tkanki łącznej i jej nadmierne sieciowanie gamma-tokoferol hamuje nadmierną produkcję melaniny, dzięki czemu zapobiega tworzeniu przebarwień oraz zmniejsza już istniejące plamy.
Pochodne tokoferoli stosowane w preparatach kosmetycznych linolenian α-tokoferolu wbudowując się w lipidy naskórka, wykazuje długotrwały efekt nawilżający i promieniochronny octan tokoferolu, który jest trwałym, aktywnym składnikiem, odpornym na światło i działanie tlenu acetylosalicylan tokoferolu, który jest również łatwo wchłaniany przez skórę i włosy Ze względu na swoje właściwości tokoferole znalazły szerokie zastosowanie w kosmetykach, gdzie często stosowana jest mieszanina α, β, γ, δ-tokoferoli. Związki te są łatwo absorbowane przez skórę zarówno z roztworów alkoholowych, olejowych jak i emulsji. Witamina E najczęściej jest spotykana w następujących preparatach kosmetycznych: kremach i mleczkach kosmetycznych, szminkach, kosmetykach do pielęgnacji paznokci, preparatach o działaniu promieniochronnym kosmetykach do włosów Kosmetyki zawierające witaminę E powinny być chronione przed dostępem światła i tlenu. Z tego względu, często stosowany jest już wcześniej wspomniany octan tokoferolu, który jest bardziej trwały.