Znaczenie promieniowców w biotechnologii leków Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2014/15 Promieniowce (rząd: Actinomycetales) są bakteriami powszechnie występującymi w środowisku glebowym, stąd ich izolacja i hodowla zostały przeprowadzone już w początkowej fazie rozwoju mikrobiologii w drugiej połowie XIX wieku (w 1877 roku wyizolowano pierwszy gatunek Actinomyces bovis wywołujący promienicę u cieląt). Początkowo promieniowcom nie przypisywano ważniejszej roli aż do czasu, gdy zespół Selmana A. Waksmana wyizolował z hodowli Streptomyces griseus najważniejszy od czasu odkrycia penicyliny antybiotyk: streptomycynę (1943 r.). Dzięki jej produkcji na masową skalę (od roku 1948) możliwe stało się zwalczanie gruźlicy, choroby dotychczas niewyleczalnej znanymi chemioterapeutykami lub penicyliną. Kolejne odkrycia metabolitów promieniowców o aktywności antybiotycznej potoczyły się lawinowo i rozpoczęły trwającą przez ponad dwie dekady złotą erę antybiotykoterapii. Obecnie, spośród ponad 10 tysięcy odkrytych i scharakteryzowanych antybiotyków tylko około 100 ma zastosowanie lecznicze i jest produkowane na skalę przemysłową. Zdecydowana większość antybiotyków naturalnych jest metabolitami promieniowców ok. 2/3 wszystkich znanych antybiotyków, w tym aż 90% stosowanych w lecznictwie. Wśród promieniowców najwięcej antybiotyków produkują szczepy należące do rodzaju Streptomyces sp. (około połowa wszystkich stosowanych antybiotyków, w tym wiele antybiotyków przeciwnowotworowych). Tabela. Ważniejsze antybiotyki naturalne i ich półsyntetyczne pochodne stosowane w medycynie lub w skali laboratoryjnej będące metabolitami promieniowców ANTYBIOTYKI AMINOGLIKOZYDOWE MAKROLIDY streptomycyna neomycyna gentamycyna tobramycyna kanamycyna amikacyna erytromycyna azytromycyna klarytromycyna spiramycyna roksitromycyna nystatyna rifampicyna natamycyna rapamycyna Streptomyces griseus Streptomyces fradiae Micromonospora purpurea Streptomyces tenebrarius Streptomyces kanamyceticus Saccharopolyspora erythraea półsyntetyczna pochodna erytromycyny półsyntetyczna pochodna erytromycyny Streptomyces ambofaciens Streptomyces noursei Streptomyces natalensis Streptomyces hygroscopicus 1
TETRACYKLINY LINKOZAMIDY ANTYBIOTYKI POLIPEPTYDOWE INNE tetracyklina chlorotetracyklina (aureomycyna) oksytetracyklina rolitetracyklina doksycyklina minocyklina limecyklina linkomycyna klindamycyna wankomycyna aktynomycyna D D-cykloseryna chloramfenikol bleomycyna fosfomycyna cykloheksimid (aktidion) amfoterycyna B nowobiocyna doksorubicyna (adriamycyna) Streptomyces aureofaciens, S. viridifaciens Streptomyces aureofaciens, S. viridifaciens, S. psammoticus Streptomyces rimosus Streptomyces lincolnensis Streptomyces orientalis Streptomyces antibioticus (obecnie otrzymywana w wyniku Streptomyces venezuelae (obecnie otrzymywany w wyniku Streptomyces verticillus (obecnie otrzymywana w wyniku Streptomyces griseus Streptomyces nodosus Streptomyces pauceticus var. caesius W 1 gramie gleby znajduje się około 10 4-10 6 konidiów promieniowców (10 6-10 8 komórek bakterii, 10 2-10 4 zarodników grzybów). Promieniowce preferują gleby obojętne lub lekko zasadowe (cecha ta odróżnia je od grzybów, co wykorzystuje się praktycznie podczas ich izolacji na przykład poprzez dodatek węglanu wapnia), o niskim uwodnieniu. Bardzo obficie występują w torfie i kompoście, gdzie bytują na rozkładających się szczątkach roślinnych. Wśród promieniowców przeważają gatunki tlenowe (np. Nocardia sp.), choć występują też gatunki względnie beztlenowe (np. Actinomyces sp.). Większość promieniowców jest saprofitami, a jedynie nieliczne gatunki mogą być chorobotwórcze dla człowieka lub zwierząt wywołują promienicę (przede wszystkim Actinomyces israeli). U koni i owiec opisano także dermatozę wywoływaną przez gatunek Dermatophilus congolensis. Przewlekła ekspozycja na zarodniki promieniowców u rolników może doprowadzić do rozwoju choroby o podłożu alergicznym, tzw. płuca farmera. Zarodniki promieniowców obficie występują także w powietrzu zamkniętych pomieszczeń np. w biurach. 2
Powietrze o wysokiej wilgotności względnej (powyżej 70%) może zawierać 5,3-7 x 10 4 jednostek CFU promieniowców w 1 m 3, co stanowi do 25-40% ogólnej liczby bakterii w powietrzu. Najczęściej identyfikowane gatunki promieniowców to Streptomyces sp. i Nocardia sp. Wydzielanie aromatycznych substancji lotnych przez promieniowce może skutkować objawami tzw. Zespołu Chorego Budynku. Rola promieniowców w ekosystemach glebowych jest ogromna. Wynika ze zdolności tych bakterii do rozkładu wielu substancji nie rozkładanych przez inne mikroorganizmy (długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, ligniny, chityna, kwasy huminowe, węglowodory aromatyczne). Szczególnie rozpowszechnionym w glebie i osadach dennych rodzajem promieniowców zdolnym do rozkładu celulozy jest Micromonospora sp. innym często spotykanym rodzajem o takich właściwościach jest Streptosporangium sp. Produkty metabolizmu są zwykle wydzielane na zewnątrz komórek. Metabolity te często mają charakter związków zapachowych (np. geosmina, czyli 1,10-dimetylo-9-dekalol, nadająca glebie charakterystyczną ziemistą woń). Promieniowce należą do bakterii właściwych, gramdodatnich, tworzących strzępki. Charakterystyczna morfologia ich kolonii powoduje, iż makroskopowo promieniowce bardziej przypominają grzyby strzępkowe niż bakterie. Promieniowce tworzą kolonie zbudowane z rozgałęzionych nitek przypominające morfologię grzybni. Z uwagi na to pozorne podobieństwo początkowo promieniowce zaliczono do grzybów: nazwa pierwszego odkrytego rodzaju promieniowców Actinomyces sp., od którego nazwę przyjął cały rząd, oznacza promienisty grzyb. Kolonie promieniowców nadal nazywa się tradycyjnie grzybniami, choć od dawna promieniowce stanowią jednostkę systematyczną bakterii, a nie grzybów (rząd Actinomycetales oficjalnie wyodrębniono w 1916 roku). Rozmnażanie promieniowców przebiega poprzez fragmentację strzępek grzybni bądź też poprzez produkcję egzospor (konidiów). Morfologia kolonii, tryb życia, wymagania troficzne, cykl życiowy i rozmnażanie przypominają więc grzyby strzępkowe pomimo, że budowa pojedynczych komórek jest typowa dla bakterii. Strzępki tworzone przez promieniowce są jednak mniejsze (1-5 mm) i są mniej zróżnicowane morfologicznie w porównaniu ze strzępkami grzybów będących typowymi plechowcami. Również morfologia promieniowców w hodowli wgłębnej, płynnej przypomina morfologię kolonii grzybów strzępkowych (nitkowate kłaczki lub kuleczki). W hodowli wgłębnej nie dostrzega się zróżnicowania morfologii strzępek. Natomiast w warunkach hodowli powierzchniowej (podłoże zestalone) promieniowce tworzą dwa charakterystyczne typy strzępek. W pierwszym etapie powstaje tzw. grzybnia substratowa (wegetatywna, podstawowa). Składa się z delikatnej siateczki zbudowanej ze strzępek wnikających wgłąb podłoża. Strzępki często składają się z syncytiów, czyli komórek z wieloma nukleoidami 3
nieprzydzielonych ścianami komórkowymi. Po kilkudniowej hodowli w kolonii powstaje grzybnia generatywna (wtórna, powietrzna). Ma bardziej zwartą strukturę wystającą ponad powierzchnię grzybni substratowej. W grzybni powietrznej przebiega sporulacja, czyli wytwarzanie zarodników. Proces ten przebiega na strzępkach zwanych sporoforami. Nie są to specjalne twory, a jedynie rodzaj strzępek różniący się morfologicznie od pozostałych; mogą przybierać różne kształty prosty, wrzecionowaty, spiralny, falisty - będące jedną z cech diagnostycznych dla poszczególnych rodzajów i gatunków promieniowców. Zarodniki promieniowców (artrospory, konidia) są bardzo odporne na zewnętrzne warunki środowiska, zwłaszcza wysuszenie, i mogą w stanie anabiozy przetrwać wiele lat. Są jednak dość wrażliwe na wysoką temperaturę giną po około 10 minutach w temperaturze 70 C. Wyjątkiem są zarodniki gatunku Thermoactinomyces vulgaris, które przypominają składem chemicznym endospory laseczek przetrwalnikujących (wysoka zawartość kwasu dipikolinowego). Gatunek ten jest termofilem występującym w gnijącym sianie i kompoście. Na odpowiednim podłożu i w optymalnych warunkach termicznych następuje kiełkowanie spor i wyrastanie nowych kolonii substratowych. Kiełkowanie rozpoczyna się od pęcznienia spor. Cały proces kiełkowania trwa, w zależności od rodzaju promieniowca i od warunków zewnętrznych, od 3 do 8 godzin. Spory promieniowców wykazują duże zróżnicowanie morfologiczne i są jedną z najważniejszych cech diagnostycznych. Mogą tworzyć łańcuszki, jak u Streptomyces sp., lub też występować pojedynczo np. u Micromonospora sp. U niektórych gatunków spory nie są wytwarzane w grzybni powietrznej, lecz powstają w specjalnych sporangiach (np. Actinoplanes sp., Ampullariella sp., Streptosporangium sp.). większość zarodników promieniowców jest nieruchliwa, choć u niektórych rodzajów zarodniki są urzęsione i mają zdolność ruchu (np. Actinoplanes sp.). Analiza molekularna (sekwencja rdna) wykazała bardzo skomplikowaną naturę promieniowców. Są między innymi spokrewnione z takimi rodzajami jak Mycobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium. Taksonomia promieniowców wyróżnia osiem podgrup obejmujących 41 rodzajów (tom IV w kluczu Bergey a): Nocardioform Actinomycetes (13 rodzajów, w tym Nocardia sp.); Multilocular Actinomycetes (3 rodzaje, np. Frankia sp.); Actinoplanetes (5 rodzajów, w tym Micromonospora sp.); Streptomycetes (4 rodzaje, w tym Streptomyces sp.); Maduromycetes (7 rodzajów); Thermomonospora (4 rodzaje); 4
Thermoactinomycetes (1 rodzaj Thermoactinomycetes sp. wytwarzający endospory - podobnie jak laseczki przetrwalnikujące z grupy Bacillus); inne (4 rodzaje). W literaturze opisano około 500 szczepów promieniowców. 90% promieniowców izolowanych z gleby należy do grupy Streptomycetes (dosłownie: poskręcany grzyb) obejmującej 4 rodzaje, w tym główny rodzaj Streptomyces sp. To właśnie do tej grupy należy większość promieniowców o znaczeniu biotechnologicznym. Promieniowce Streptomycetes produkują lotne związki organiczne nadające charakterystyczną woń zaoranej ziemi, spleśniały zapach ziemi w piwnicy, a także gnijącej słomy. Część z nich jest termofilna i dlatego często występuje w oborniku i kompoście. Klasyfikacja izolowanych szczepów promieniowców na podstawie opracowanych kluczy jest bardzo trudna. Wiele cech diagnostycznych (np. barwa grzybni, wytwarzanie pigmentu) wykazuje duże zróżnicowanie nawet w obrębie jednego szczepu w zależności od składu podłoża hodowlanego. W literaturze powszechnie uznawane są cztery główne klucze. Powstały one jako wynik wieloletnich badań w ramach międzynarodowego projektu ISP (International Streptomyces Project). Uproszczony klucz do identyfikacji promieniowców bazuje na dwóch etapach: 1 etap: oznaczenie cech morfologicznych: typy sporoforów: I Rectus-flexibilis II Retinaculum-apertum III Spira IV Verticillus typy powierzchni zarodników: 1 gładkie 2 brodawkowate 3 kolczaste 4 owłosione barwa grzybni powietrznej: A biała B żółta C czerwona D fioletowa E niebieska F zielona G szara 2 etap: identyfikacja szczepu za pomocą testów uzupełniających: pigment melanoidowy: a wytwarza b nie wytwarza źródła węgla: 1 L-arabinoza 2 sacharoza 3 D-ksyloza 4 inozytol 5 D-mannitol 6 D-fruktoza 7 L-ramnoza 8 rafinoza 5