Streszczenie Celem pracy była ocena czystości mikrobiologicznej surowców roślinnych wykorzystywanych do przygotowywania mieszanek ziołowych oraz leków doustnych, zawierających surowce pochodzenia roślinnego. Badania obejmowały 80 surowców zielarskich oraz 30 preparatów zawierających surowce pochodzenia roślinnego. Wykonywano je w warunkach aseptycznych zgodnie z wymaganiami FP wyd. VI. Liczbę żywych mikroorganizmów tlenowych (bakterii i grzybów) oznaczano metodą bezpośredniego posiewu. Badania jakościowe, mające na celu wykrycie obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych, takich jak S. aureus, P. aeruginosa oraz pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, w tym E. coli i Salmonella sp. wykonywano używając podłoży namnażających i wybiórczych. Dodatkowe potwierdzenie obecności danego mikroorganizmu uzyskiwano na drodze badań biochemicznych. Na podstawie uzyskanych wyników badań stwierdzono wysoki poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego, zarówno surowców zielarskich, jak i badanych preparatów doustnych. Farmakopealna norma czystości mikrobiologicznej dla surowców roślinnych poddawanych działaniu wrzącej wody, została przekroczona w 17,5% badanych próbek. Wykazano, że surowce pochodzące z nadziemnych części roślin posiadają równie wysokie zanieczyszczenie, jak i te pozyskiwane z podziemnych części roślin. Wymagań FP VI dla leków doustnych zawierających substancje pochodzenia roślinnego, poza ziołami nie spełniało 80% badanych preparatów. Należy jednak podkreślić, że w badanych próbkach leków doustnych nie odnotowano obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych. Wyniki badań, jak i wysokie wymagania mikrobiologiczne stawiane roślinnym preparatom leczniczym, skłaniają do poszukiwania skutecznych technologii redukujących liczbę mikroorganizmów w surowcach zielarskich. Słowa kluczowe: czystość mikrobiologiczna, mieszanki ziołowe, patogenne i oportunistyczne mikroorganizmy Summary The aim of the study was the evaluation of microbiological purity of plant raw materials used for preparation of herbal mixtures and oral medicines containing raw materials of plant origin. Studies included 80 herbal raw materials and 30 preparations containing raw materials of plant origin. Examinations were performed in sterile conditions, in accordance with the requirements. The number of living aerobic microorganisms (bacteria and fungi) was determined by means of direct culture method. Qualitative examinations, aimed at discovering the presence of pathogenic and opportunistic microorganisms, such as S. aureus, P. aeruginosa and rods from the family of Enterobacteriaceae, including E. coli and Salmonella sp. were conducted, using multiplying and selective media. The presence of a particular microorganism was additionally confirmed in the course of biochemical examinations. On the basis of the obtained examination results, a high level of microbiological contamination was found, both in herbal raw materials and examined oral preparations. Pharmacopeal microbiological purity norm for plant raw materials subjected to the action of boiling water, was exceeded in 17,5% of investigated samples. It was shown, that the raw materials from plant parts above the ground, are as highly contaminated as those obtained from the underground parts. The requirements for oral medicines, containing substances of plant origin, except for herbs, were not met in 80% of examined preparations. However, it should be emphasized, that in the examined samples of oral drugs, pathogenic and opportunistic microorganisms were not found. Examination results, as well as high microbiological requirements set for medicinal plant preparations, make it necessary to search for effective technologies of microorganisms reduction in herbal raw materials. Key words: microbiological cleanness, herbal mixtures, pathogenic and opportunistic microorganisms
Z surowców roślinnych, zwanych tradycyjnie ziołami lub roślinami leczniczymi, wytwarzane są produkty do celów farmaceutycznych, spożywczych i kosmetycznych. Często te same przetwory zielarskie, takie jak ekstrakty, olejki eteryczne, czy soki roślinne są składnikami leków roślinnych, środków spożywczych oraz kosmetyków [1]. Obecnie na świecie przetwarza się rocznie ponad 400 tyś. ton surowców roślinnych, w tym w Polsce 15 26 tys. ton, z czego 85% stanowią surowce krajowe. Produkcja surowców wyłącznie do celów farmaceutycznych szacowana jest natomiast na około 100 tys. ton rocznie [2]. Przetwórstwo zielarskie to przede wszystkim produkcja leków roślinnych [3]. Według definicji Europejskiego Naukowego Zrzeszenia ds. Fitoterapii, leki roślinne są to użyteczne w medycynie wyroby, które jako składniki czynne zawierają wyłącznie rośliny, części roślin, substancje roślinne lub ich kombinacje, w postaci przerobionej lub nie przerobionej. Surowce roślinne przeznaczone do użytku leczniczego muszą, zatem spełniać określone standardy i normy, a kontrola jakości materiału roślinnego obejmuje wiele etapów, począwszy od wstępnej oceny przyszłego surowca już na plantacji lub u dostawcy, a skończywszy na ocenie gotowego preparatu przy użyciu metod laboratoryjnych [4]. Farmakognostyczne metody badania surowców pochodzenia roślinnego zawarte w FP VI, oprócz badań mikroskopowych i makroskopowych, obejmują również wykrywanie obecności i oznaczanie stężenia związków czynnych farmakologicznie, badanie zawartości popiołu, metali ciężkich, domieszek oraz zanieczyszczeń a także badanie czystości mikrobiologicznej. Aktualne wymagania jałowości i czystości mikrobiologicznej dla różnych grup leków zawiera Farmakopea Polska wyd. VI zgodnie, z którą leki pochodzenia naturalnego zaliczamy do grup czystości mikrobiologicznej: II B, III C, III D i III E [5]. Celem pracy była ocena czystości mikrobiologicznej surowców roślinnych, wykorzystywanych do przygotowywania mieszanek ziołowych oraz ocena preparatów zawierających surowce pochodzenia roślinnego, w świetle aktualnych wymagań Farmakopei Polskiej wyd. VI [5]. Badanie czystości mikrobiologicznej miało na celu oznaczenie w surowcach i lekach gotowych, dla których nie jest wymagana jałowość, ogólnej liczby żywych mikroorganizmów tlenowych (bakterii i grzybów) oraz określenie obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych, takich jak Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa oraz pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae, w tym Escherichia coli i Salmonella spp. Badania obejmowały 80 surowców zielarskich, w tym 3 Cortex, 3 Radix, 3 Rhizoma, 5 Pericarpium, 7 Anthodium, 16 Herba, 5 Herba cum radix, 20 Folium i 18 Varia oraz 30 gotowych preparatów doustnych zawierających surowce pochodzenia roślinnego. Wykonano je w warunkach aseptycznych, zgodnie z wymaganiami Farmakopei Polskiej wyd. VI [5]. Oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów (bakterii i grzybów) oraz pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae dokonano metodą bezpośredniego posiewu a interpretacji wyników przeprowadzono zgodnie z obowiązującymi zaleceniami [5]. W badanych jakościowych surowców roślinnych, należących według FP VI do grupy czystości mikrobiologicznej III D (surowce roślinne poddawane działaniu wrzącej wody), poszukiwano obecności pałeczek E. coli a w badanych próbkach leków doustnych, zawierających surowce pochodzenia roślinnego, poza ziołami, zgodnie z wymaganiami FP VI dla grupy czystości mikrobiologicznej III C, poszukiwano także obecności Salmonella spp. oraz S. aureus i P. aeruginosa. Badania wykonywano używając podłoży namnażających, a następnie wybiórczych i różnicujących, dodatkowo potwierdzając obecność mikroorganizmu badaniami biochemicznymi, zgodnie z obowiązującą metodyką [5]. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem 80 surowców zielarskich, wskazują na wysoki stopień zanieczyszczenia materiału roślinnego bakteriami tlenowymi (ryc.1). Około 37% próbek badanych surowców charakteryzowało się liczbą bakterii tlenowych niższą od 10.000 w 1g, a w około 11,25% liczba bakterii mieściła się w granicach 10.000-100.000 w 1g. Ponad 28% próbek wykazywało zanieczyszczenie wyższe od 100.000, a około 16% próbek zanieczyszczenie wyższe od 1.000.000 w 1g. FP VI dla surowców roślinnych grupy III D wymaga nie więcej niż 10 7 bakterii tlenowych w 1g surowca. Normy tej nie spełniało 6,25% badanych surowców. W 71,25% surowców zielarskich stwierdzono obecność grzybów (ryc. 2). Niskim stopniem zanieczyszczenia, w granicach 10-1.000 w 1g, charakteryzowało się 31,25% próbek. Ponadto 12,5% próbek zawierało grzyby w liczbie powyżej 1.000, a około 16% próbek powyżej 10.000 w 1g surowca. Farmakopealnych wymagań czystości mikrobiologicznej dla surowców roślinnych grupy III D, w odniesieniu do zanieczyszczeń mikologicznych, nie spełniało 11,25% próbek, w których liczba grzybów przekraczała 100.000 w 1g. W badaniach nie stwierdzono występowania grzybów w liczbie wyższej od 1.000.000 w 1 g surowca.
Obecność pałeczek E. coli stwierdzono w 8 próbkach, co stanowi 10% badanych surowców zielarskich, przy czym w 7 przypadkach liczba tych pałeczek przekraczała 100 w 1g, a zatem nie spełniała wymagań FP VI. Niskie zanieczyszczenie, mieszczące się w granicach tolerancji wymagań mikrobiologicznych dla surowców roślinnych grupy III D lub brak obecności pałeczek E. coli, stwierdzono w 91,25% badanych surowców zielarskich (ryc.3). Oceniając czystość mikrobiologiczną poszczególnych surowców roślinnych stwierdzono, że wymagań nie spełniało 14 spośród 80 próbek, co stanowi 17,5% badanych surowców. Wysoki stopień zanieczyszczenia grzybami, bakteriami tlenowymi i pałeczkami z rodziny Enterobacteriaceae odnotowano w surowcach Varia (35,7% próbek nie spełniających wymagań FP VI) oraz Herba (28,5% próbek nie spełniających wymagań FP VI). W Anthodium (14,3%), Folium (7,14%), Herba cum Radix (7,14%) oraz Radix (7,14%) liczba mikroorganizmów była niższa. Wysoką czystością mikrobiologiczną charakteryzowały się natomiast badane próbki: Cortex, Pericarpium oraz Rhizoma (ryc. 4). FP VI dla preparatów doustnych zawierających surowce pochodzenia roślinnego (grupa czystości mikrobiologicznej III C) wymaga nie więcej niż 10 4 bakterii tlenowych w 1g. Około 36,7% próbek badanych preparatów zawierało mniej niż 10.000 tych mikroorganizmów w 1g, lecz aż 63,3% charakteryzowało się liczbą bakterii tlenowych wyższą od 10.000 w 1g. W 30% próbek odnotowano zawartość bakterii tlenowych w granicach 100.000-1.000.000 w 1g, a w około 16,7% próbek stwierdzono zanieczyszczenie wyższe od 1.000.000. Ponadto 10% próbek odznaczało się liczbą bakterii tlenowych wyższą od 10.000.000 w 1g (ryc. 5). Stopień zanieczyszczenia preparatów doustnych zawierających surowce pochodzenia roślinnego grzybami był wysoki: ich obecność odnotowano w 96,7% badanych preparatów (ryc. 6). 20% badanych próbek zawierało powyżej 100, a około 16,7% próbek powyżej 1.000 grzybów w 1g preparatu. Zanieczyszczenie wyższe od 10.000 w 1g stwierdzono w 6,7% próbek. Również 6,7% próbek zawierało więcej niż 100.000 grzybów w 1g, a w 3,3% próbek liczba grzybów przekraczała 1.000.000 w 1g. Dla grupy III C FP VI wymaga nie więcej niż 10 2 grzybów w 1g, a zatem w odniesieniu do zanieczyszczeń mikologicznych, około 53% spośród badanych preparatów, nie spełniało norm czystości mikrobiologicznej. Brak wzrostu pałeczek z rodziny Enterobacte-
riaceae odnotowano tylko w jednym przypadku, natomiast mniej niż 1 drobnoustrój z tej rodziny stwierdzono w 10% badanych preparatów. 6,7 % próbek charakteryzowało się obecnością tych mikroorganizmów w granicach 1-10 w 1 g preparatu, a 53% zawierało pałeczki w ilości 10-100 w 1g preparatu. Obecność ponad 100 mikroorganizmów z rodziny Enterobacteriaceae w 1 g dyskwalifikuje dany preparat pod względem wymaganej przez FP VI czystości mikrobiologicznej. Taką liczbę drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae stwierdzono w 26,7% badanych próbek. Obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych: E. coli, Salmonella spp. P. aeruginosa oraz S. aureus nie stwierdzono w żadnym z badanych preparatów. Biorąc pod uwagę kryteria czystości mikrobiologicznej określone przez FP VI dla preparatów doustnych zawierających substancje pochodzenia naturalnego (<10 4 bakterii w 1g, <10 2 grzybów w 1g, <10 2 pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae w 1g; nieobecność w 1g E. coli, P. aeruginosa, S. aureus oraz nieobecność w 10 g Salmonella spp.) stwierdzono, że wymagań tych nie spełniały 24 spośród 30 próbek, co stanowi 80% badanych preparatów. Szeroki asortyment leków roślinnych, ułatwiony do nich dostęp, a także możliwości stosowania w geriatrii i pediatrii oraz w celach profilaktycznych, spowodowały wzrost zainteresowania fitoterapią w społeczeństwie, a w konsekwencji zainteresowanie przemysłu produkcją preparatów zielarskich. Surowiec roślinny lub lek zawierający substancje pochodzenia naturalnego wprowadzony do obrotu aptecznego powinien odpowiadać wymaganiom przedstawionym w monografiach ogólnych i szczegółowych Farmakopei Polskiej. O stopniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego materiału roślinnego decydują warunki wegetacji, zbioru, przechowywania i magazynowania. Obecność mikroorganizmów w surowcach roślinnych jest z wielu względów zjawiskiem niepożądanym. Drobnoustroje mogą powodować rozkład substancji biologicznie czynnych oraz wpływać na zmianę właściwości organoleptycznych preparatów leczniczych. Ponadto wiele występujących w materiale roślinnym mikroorganizmów to gatunki toksynotwórcze i chorobotwórcze dla człowieka, stanowiące realną groźbę zatruć. Z prac Kędzi wynika, że liczba bakterii tlenowych niższa od 10.000 w 1g występuje tylko w 27% surowców zielarskich [6, 7]. Badając 695 próbek stwierdził on, że 43% z nich charakteryzowało się liczbą bakterii tlenowych w granicach 10.000-1.000.000 w 1g surowca. Ponad 1.000.000 bakterii tlenowych w 1g zawierało 30% próbek, w tym prawie 10% surowców zielarskich odznaczało się liczbą bakterii tlenowych wyższą od 10.000.000 w 1g. W materiale roślinnym powszechnie występują również grzyby. Pluta, Krutul i Olszewski stwierdzili ich obecność w 26 surowcach na 33 badanych [8], Hitokoto i wsp. w 49 na 54 surowcach [9], a w badaniach Kędzi tylko 2 próbki (1,3%) ze 156 były wolne od grzybów pleśniowych. Obecność grzybów w liczbie mniejszej od 100 w 1g stwierdził Kędzia tylko w 17% surowców zielarskich [7]. Ponadto 51% spośród badanych przez niego próbek zawierało od 100 do 10.000 grzybów w 1g, 25% - od 10.000-1.000.000 w 1g, a w 5% liczba grzybów przekraczała 1.000.000 w 1g. Wymagania farmakopealne spełniało 53,6% badanych tabletek, przy czym 13 % preparatów wykazywało zanieczyszczenie niższe od 100 bakterii tlenowych i grzybów w 1g. Liczbę mikroorganizmów w granicach od 100 do 1.000 w 1g stwierdził on w 31%, a w granicach 1.000-10.000 w około 34% tabletek i drażetek. Około 20% preparatów zawierało ponad 10.000 drobnoustrojów w 1g. W surowcach roślinnych bakterie tlenowe reprezentowane są między innymi przez Gramujemne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae. Najczęściej w materiale roślinnym spotyka się pałeczki z rodzaju Enterobacter (około 75% wszystkich pałeczek jelitowych) oraz Escherichia. Inne pałeczki takie jak Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus oraz Erwinia, Serratia i Proteus spotykane są w 4-5 na 100 próbek surowców [7]. Według Gopala, Patela i Sharmy [10] oraz Roberts i wsp. [11] pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae występują w około 48% surowców zielarskich, a według Kędzi w około 33%. Zanieczyszczenie drobnoustrojami z rodziny Enterobacteriaceae w liczbie wyższej niż 100 w 1g stwierdził Kędzia w 25% badanych surowców oraz w 6,25 % leków doustnych zawierających substancje pochodzenia roślinnego. Występowanie Escherichia coli w preparatach doustnych odnotował Kędzia tylko w 3 na 110 próbek (2,7%) [7]. Araujo i Ohara [12], jak i Kędzia [7] z badanych surowców roślinnych nie wyizolowali pałeczek jelitowych z rodzaju Salmonella, niemniej sporadyczne przypadki występowania tych drobnoustrojów odnotowano w piśmiennictwie. Roberts i wsp.[11] stwierdzili obecność Salmonella rubislaw w kłączu imbiru (Rhizoma Zingiberis). Pluta, Krutul i Olszewski [8] donoszą o obecności Salmonella arizonae w korzeniu lukrecji (Radix Glycyrrhizae) i nasionach kozieradki (Semen Foenugraeci), zaś Gopal i wsp. [10] wykryli Salmonella sp. w nasieniu babki (Semen Plantaginis ovatae). Surowce roślinne mogą być także zanieczyszczone pałeczkami niefermentującymi. Haenen i Meyvisch [13] oraz Gopal i wsp. [10] wskazali na ich występowanie w 32%, a Kędzia [7] doniósł o ich obecności w 43,6% przebadanych próbek. Około 21% zanieczyszczeń pałeczkami niefermentującymi przypada na przedstawicieli rodzaju Pseudomonas [13]. W materiale roślinnym stwierdzono także obecność innych pałeczek niefermentujących: Acinetobacter (ok.15%) oraz rzadziej występujących Alcaligenes faecalis (1,7%), Alcaligenes paradoxus (1,3%), Alcaligenes denitrificans v. denitrificans (0,4%), Alcaligenes denitrificans v. xylosoxydas (0,4%) i Flavobacterium odoratum (1,7%) [8]. Kędzia [7] stwierdził obecność Pseudomonas aeruginosa tylko w jednej spośród 42 przebadanych próbek (2,4%). O rzadkim występowaniu Staphylococcus aureus w materiale roślinnym świadczą wyniki badań wielu autorów. W jednym z przypadków ze 150 próbek surowców wyizolowano tylko 4 szczepy Staphylococcus aureus [7], w innym tylko 1 szczep na 21 przebadanych surowców zielarskich [14]. Elementem wpływającym na stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego materiału roślinnego może być rodzaj surowca. Dane literaturowe na ten temat są jednak zróżnicowane. Prace Pluty, Krutula i Olszewskiego [8] oraz Araujo i Ohary [12] wskazują na większy stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego surowców korzeniowych w porównaniu do
surowców pochodzących z części nadziemnych rośliny. Z przeprowadzonych przez Kędzię analiz wynika natomiast, że do najbardziej zanieczyszczonych drobnoustrojami, należą surowce z grupy Folium, wśród których prawie 37% zanieczyszczonych jest w bardzo wysokim stopniu bakteriami tlenowymi, grzybami pleśniowymi i drożdżoidalnymi oraz pałeczkami jelitowymi. Wysokie zanieczyszczenie wymienionymi drobnoustrojami (26,5-28,1%) odnotowano również wśród takich surowców, jak: Flos, Radix i Herba. Wśród pozostałych: Fructus, Varia, Semen, Rhizoma oraz Cortex liczba surowców wysoce zanieczyszczonych drobnoustrojami była znacznie niższa i mieściła się granicach 12,1-15,1% badanych próbek. Surowce roślinne używane bezpośrednio, jak i w postaci mieszanek, stosowane jako odwary czy napary, wskutek działania wysokiej temperatury charakteryzują się niskim poziomem zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Z przedstawionych przez Kędzię [15] danych wynika, że pod wpływem gorącej wody giną wszystkie grzyby oraz większość form wegetatywnych bakterii tlenowych. Po zaparzeniu liczba bakterii tlenowych nie przekracza 100.000 w 1ml. W gotowym naparze lub odwarze pozostają jedynie przetrwalniki laseczek Bacillus. Według Parnowskiej [16] 88-95% naparów spełnia wymagania farmakopealne. Zrozumiałe jest jednak, że należy dążyć do uzyskania surowców, które odpowiadać będą określonym w Farmakopei Polskiej wymaganiom [17]. Wysokie wymagania mikrobiologiczne stawiane roślinnym preparatom leczniczym skłaniają do poszukiwania skutecznych technologii redukujących liczbę mikroorganizmów (promieniowania jonizującego, pary wodnej pod ciśnieniem itp.). Stwierdzono, że badane surowce zielarskie: 3 Cortex, 3 Radix, 3 Rhizoma, 5 Pericarpium, 7 Anthodium, 16 Herba, 5 Herba cum Radix, 20 Folium i 18 Varia, były w znacznym stopniu zanieczyszczone bakteriami tlenowymi i grzybami. Farmakopealna norma czystości mikrobiologicznej, która dla surowców grupy III D wynosi nie więcej niż 10 7 bakterii w 1g, nie więcej niż 10 5 grzybów w 1g i nie więcej niż 10 2 pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae w 1g, została przekroczona w 17,5% badanych surowców. Wykazano, że surowce pochodzące z nadziemnych części roślin, posiadają równie wysokie zanieczyszczenie, jak i te pozyskiwane z podziemnych części roślin. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono wysoki poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego leków doustnych zawierających surowce pochodzenia roślinnego. W próbkach przebadanych preparatów nie odnotowano obecności drobnoustrojów chorobotwórczych i oportunistycznych, takich jak: E. coli, Salmonella spp., P. aeruginosa i S. aureus. Kryteria czystości mikrobiologicznej dla preparatów doustnych zawierających substancje pochodzenia naturalnego, poza ziołami nie zostały spełnione w 24 spośród 30 próbek, co stanowi 80% przebadanych preparatów doustnych. 1. Lutomski J. Zioła, fitofarmaceutyki i nutraceutyki. Post Fitoter 2001; 1: 4. 2. Jambor J. Kierunki rozwoju krajowego rynku surowców i przetworów zielarskich. Wiad Ziel 2001; 10: 1. 3. Jambor J. Prognozowanie potrzeb surowcowych w zielarstwie. Wiad Ziel 2002; 2: 13. 4. Kordana T. Wymagania jakościowe stawiane surowcom zielarskim przez przemysł. Wiad Ziel 2002; 12: 1. 5. Farmakopea Polska wyd. VI. Pol Tow Farm, Warszawa; 2002. 6. Kędzia B. Zanieczyszczenie surowców zielarskich drobnoustrojami w świetle wymagań mikrobiologicznych. Herba Pol 1994; 40: 3. 7. Kędzia B. Badania nad zanieczyszczeniem surowców zielarskich drobnoustrojami. Rozprawa habilitacyjna wykonana w Instytucie Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu, Poznań; 1999. 8. Pluta J, Krutul H, Olszewski Z. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne surowców roślinnych i produkowanych z nich granulatów. Farm Pol 1980; 36: 205. 9. Hitokoto H, Morozumi S, Wauke T I wsp. Fungal contamination and mycotoxin detection of powdered herbal drugs. Appl Environ Microbiol 1978; 36: 252. 10. Gopal NGS, Patel KM, Sharma G. Effect of heat, ethylenoxide and gamma radiation on psyllium husk. Indian J Pharm Sci 1987; 49: 75. 11. Roberts D, Watson GN, Gilbert RJ. Contamination of food plants and plants products with bacteria of public health significance. Soc Appl Bacteriol Symp Ser 1982; 10: 169. 12. Araujo AL, Ohara MT. Microbiological quality of vegetable drugs commercialized in open - air markets for use in infusion preparations according to the part of the vegetable used. Boll Chim Farm 2000; 142 (7): 271. 13. Haenen JM, Meyvisch O. Microbial contamination of pharmaceutical ingredients. Pharm Int 1984; 5: 192. 14. Muszyński Z, Resel H. Zanieczyszczenia drobnoustrojami surowców, sprzętów i powietrza w aptece oraz leków przygotowywanych w warunkach aseptycznych i bez zachowania aseptyki. [W:] Farmacja kliniczna. T.1. Poznań: Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Farmakologicznego; 1973. 15. Kędzia B. Czystość mikrobiologiczna naparów w świetle obowiązujących wymagań. Herba Pol 1995; 41: 190. 16. Parnowska W. Współczesne wymagania jakości mikrobiologicznej leków w świetle zasad GMP. Farm Pol 1993; 49, 18: 1. 17. Strzelecka H, Wojtasik E. Jakość leków roślinnych ocenianych w procesie rejestracji. Wiad Ziel 1999; 10: 8.