Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny znaczenie w chemii klinicznej

Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny znaczenie w chemii klinicznej Opis badania podjętego w celu określenia struktury nowego, immunoreaktywnego metabolitu fosfenytoiny, odnośnie którego stawiano dawniej hipotezy, iż jest on obecny jako prolek w surowicy krwi pacjentów otrzymujących fosfenytoinę. Clinical Chemistry 47:5; 910-918 (2001) Thomas M. Annesley (a), Stephen Kurzyniec (b), Gerald D. Nordblom (b), Nathan Buchanan (b), William Pool (b), Michael Reily (b), Rasmy Talaat (b) i William L. Roberts (c) Metody: Metabolit izolowano z surowicy krwi pacjentów z mocznic¹ przy u yciu ekstrakcji do fazy sta³ej oraz HPLC. Analizê strukturaln¹ przeprowadzono przy u yciu metod HPLC i tandemowej spektrometrii masowej, magnetycznego rezonansu j¹drowego (NMR), wymiany deuterowej oraz derywatyzacji chemicznej. Immunoreaktywnoœæ okreœlano przy u yciu metody immunofluorescencyjno-polaryzacyjnej. Wyniki: Metabolit wykaza³ w widmie masowym obecnoœæ jonu macierzystego o wartoœci m/z=457 w trybie jonów ujemnych ulegaj¹cego fragmentacji, daj¹c pik przy wartoœci m/z=251, charakterystyczny dla fenytoiny oraz inne fragmenty fenytoiny. W widmie obecne by³y równie fragmenty zwi¹zane z kwasem glukuronowym. Pik chromatograficzny odpowiadaj¹cy temu metabolitowi wykazywa³ immunoreaktywnoœæ wystarczaj¹c¹ do powodowania fa³szywie podwy szonych wyników immunochemicznych oznaczeñ fenytoiny. Obserwowana w badaniu immunoreaktywnoœæ by³a ponadto proporcjonalna do wzglêdnego stê enia metabolitu w zebranych frakcjach. Analiza przu u yciu NMR wykaza³a obecnoœæ grup fenylowych z przesuniêciami chemicznymi identycznymi z przesuniêciami w fenytoinie, jak równie obecnoœæ w cz¹steczce mostka metylenowego, zgodnego z takim samym mostkiem metylenowym w cz¹steczce estru fosforanowego fenytoiny. Analiza porównawcza próbek surowicy pobranych od pacjentów z upoœledzon¹ czynnoœci¹ nerek otrzymuj¹cych fenytoinê lub fosfenytoinê z wykorzystaniem wielu reakcji monitoruj¹cych kwantyfikacjê wykaza³a, e obecnoœæ tego metabolitu jest zwi¹zana z przyjmowaniem fosfenytoiny. Wnioski: Unikalny metabolit, oksymetyloglukuronid powstajacy z fosfenytoiny wyizolowano z surowicy krwi otrzymuj¹cych ten prolek pacjentów z mocznic¹. 2001 American Association for Clinical Chemistry G³ównym problemem zwi¹zanym ze stosowaniem wielu klas leków jest bezpieczne i efektywne dostarczenie œrodka do ¹danego miejsca jego dzia³ania. W niektórych przypadkach aktywne formy leków s³abo wch³aniaj¹ siê po przyjêciu drog¹ doustn¹, co powoduje, i maj¹ one zmienn¹ dostêpnoœæ biologiczn¹. W innych przypadkach, aktywne formy leków s¹ nierozpuszczalne w œrodowiskach wodnych, a tym samym nie mog¹ byæ one stosowane jako efektywnie dzia³aj¹ce œrodki, podawane do ylnie lub domiêœniowo w stanach pilnych. Niektóre leki mog¹ byæ szybko metabolizowane i tym samym nie pozostaj¹ w uk³adzie kr¹ enia na tyle d³ugo, aby gromadziæ siê w ¹danym miejscu dzia³ania. Koncepcja tworzenia proleków powsta- ³a jako rozwi¹zanie wymienionych powy ej problemów. Prolek jest strukturalnym analogiem lub pochodn¹ ¹danej aktywnej formy leku, nadaj¹cym temu zwi¹zkowi w³aœciwoœci u³atwiaj¹ce uwalnianie, poprawiaj¹ce farmakokinetykê leku lub jego dzia³anie. Przyk³ady zwi¹zków wprowadzonych w ostatnim czasie na rynek obejmuj¹ formy prolekowe antagonistów czynników aktywuj¹cych p³ytki krwi 1, przeciwwirusowe leki analogi nukleozydów 2, œrodki cytoprotekcyjne 3, pochodne przeciwnowotworowe 4 6, leki neuroprotekcyjne 7 oraz leki przeciw wirusowi grypy 8. Jedn¹ z metod zwiêkszania rozpuszczalnoœci w wodzie leków zawieraj¹cych w cz¹steczkach grupy hydroksylowe, lub leków, w cz¹steczkach których mo liwe jest przy³¹czenie grupy hydroksylowej do mostka chemicznego, jest przy³¹czenie do cz¹steczki reszty fosforanowej 6, 9, 10. Fosfenytoina (rys. 1) jest estrem fosforanowym i prolekiem fenytoiny, zapewniaj¹cym bardziej efektywne dzia³anie leku oraz wiêksze bezpieczeñstwo w przypadku podawania leku drog¹ do yln¹ lub domiêœniow¹ 11. W przypadku uk³adowego podania leku, reszta fosforanowa cz¹steczki fosfenytoiny zostaje szybko odszczepiona 12, co prowadzi do utworzenia nietrwa³ego produktu poœredniego, który rozpada siê z utworzeniem cz¹steczki formaldehydu oraz aktywnej formy leku fenytoiny. Zachodz¹ce nastêpnie procesy meta- 8 Cała prawda w jednej kropli

boliczne oraz klirens nerkowy powinny przebiegaæ zgodnie ze szlakami hydroksylowania i sprzêgania, znanymi dla fenytoiny. W opublikowanym niedawno doniesieniu 13 przedstawiono dane, bêd¹ce poparciem hipotezy o istnieniu wyj¹tkowego metabolitu fosfenytoiny, wykrytego u pacjentów z upoœledzon¹ funkcj¹ nerek, przyjmuj¹cych fosfenytoinê. Ten postulowany metabolit wykazywa³ znacz¹c¹ reaktywnoœæ krzy ow¹ w licznych, dostêpnych na rynku testach immunochemicznych s³u ¹cych do oznaczania fenytoiny, wiod¹c do fa³szywie zwiêkszonych wyników oznaczeñ. W niniejszym badaniu potwierdziliœmy istnienie nowego metabolitu fosfenytoiny. Uda³o nam siê wstêpnie zidentyfikowaæ przy u yciu gradientowej HPLC w odwróconych fazach i tandemowej spektrometrii masowej (HPLC- -MS-MS) $$$$ zwi¹zek wykazuj¹cy w widmie masowym jon fenytoiny o wartoœci m/z=251 oraz jon cz¹steczkowy o wartoœci m/z=457. Metabolit ten nastêpnie izolowano i scharakteryzowano przy pomocy derywatyzacji chemicznej, HPLC, MS-MS, dok³adnej analizy masy cz¹steczkowej, wymiany izotopowej oraz spektroskopii magnetycznego rezonansu j¹drowego (NMR). Metabolit ten jest zwi¹zkiem immunoreaktywnym w najpowszechniej stosowanym teœcie immunochemicznym do monitorowania stê enia fenytoiny, zaœ jego strukturê zidentyfikowano jako N-3 -oksymetyloglukuronid fenytoiny. Zgodnie ze stanem naszej wiedzy, badania te przedstawiaj¹ równie pierwszy przypadek reakcji bezpoœredniej glukuronidacji centrum reaktywnego cz¹steczki proleku. MATERIA Y I METODY PRÓBKI SUROWICY Próbki surowicy wykorzystane do izolacji i scharakteryzowania metabolitów fosfenytoiny, pochodz¹ce od pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê, by³y tymi samymi próbkami, co próbki stosowane w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board 13. Analizy prowadzone metod¹ HPLC 14 potwierdzi³y, i próbki te nie zawiera³y fosfenytoiny, która mog³aby przyczyniaæ siê do reaktywnoœci krzy owej przypisywanej nowemu metabolitowi fosfenytoiny 15. Surowicê pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê uzyskano z próbek krwi wykorzystywanych w innym, zatwierdzonym badaniu 16. Rys. 1. Struktura fosfenytoiny LEKI I ODCZYNNIKI Fenytoinê, 5-(p-hydroksyfenylo)-5-fenylohydantoinê (HPPH) oraz N-3 -hydroksymetylofenytoinê otrzymano z firmy Pfizer Pharmaceutical. Fenytoino-N-glukuronid oraz HPPH-glukuronid zsyntezowano zgodnie z opisem zamieszczonym we wczeœniejszej publikacji 17. Odczynniki fenytoina TDx oraz wolna fenytoina zakupiono w firmie Abbott Laboratories i stosowano je zgodnie z zaleceniami producenta. Odczynnik metyluj¹cy BF3-metanol zakupiono w firmie Pierce Chemical. Acetonitryl zakupiono w firmie Mallinckbrodt. Rozpuszczalniki deuterowane nabyto od Cambridge Isotope Laboratories Inc. Kolumny ekstrakcyjne 1 ml Oasis HLB zakupiono w firmie Waters Corporation. OCZYSZCZANIE METABOLITU Z SUROWICY Dwie porcje pulowanej surowicy pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fosfenytoinê 14, o objêtoœci 1 ml umieszczono w oddzielnych probówkach z polipropylenu. Do ka dej z probówek dodano acetonitryl (4 ml), ca³oœæ intensywnie wstrz¹saj¹c przez 60 sekund. Probówki odwirowano i acetonitrylowe nads¹cze uzyskane w obydwu probówkach po³¹czono, a rozpuszczalnik odparowano, przenosz¹c nads¹cz niewielkimi porcjami w atmosferze azotu do probówki polipropylenowej o objêtoœci 1,5 ml, przeznaczonej do mikroodwirowywania. Zawartoœæ probówki do mikroodwirowywania rozpuszczono w 100? l metanolu, ca³oœæ wytrz¹sano, po czym dodano 1 ml wody i ponownie wytrz¹sano. Uzyskan¹ ciecz przeniesiono na kolumnê ekstrakcyjn¹ Oasis 30 mg, któr¹ uprzednio aktywowano przy pomocy 100? l metanolu i przemyto wod¹. Kolumnê przemywano 300? l mieszaniny woda-acetonitryl (95:5 czêœci objêtoœciowych). Metabolity fenytoiny eluowano z kolumny czterema porcjami mieszaniny woda- -acetonitryl (80:20 czêœci objêtoœciowych). Poszczególne eluaty poddawano analizie jakoœciowej w kierunku obecnoœci metabolitu o wartoœci stosunku masy do ³adunku m/z=457 przy pomocy autosamplera Perkin- -Elmer Series 200 oraz pompy, pod³¹czonych do tandemowego spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima. Frakcje zawieraj¹ce metabolit po³¹czono i odparowano rozpuszczalniki w atmosferze azotu. Zebrane frakcje, poddane ekstrakcji do fazy sta³ej, zawieraj¹ce metabolit, rozpuszczono w mieszaninie metanol-woda (10:90 czêœci objêtoœciowych), po czym izolowano chromatograficznie zwi¹zek o wartoœci m/z=457, stosuj¹c kolumnê 2,1 x 150 mm Zorbax RX-C18 z faz¹ ruchom¹ acetonitryl 1 ml/l roztwór kwasu L-mlekowego w wodzie (22:78 czêœci objêtoœciowych), przy szybkoœci przep³ywu fazy ruchomej równej 0,3 ml/min. Frakcje (1 min; 0,3 ml) zbierano do mikrowirówkowych probówek z polipropylenu o pojemnoœci 1,5 ml i poddawano analizie metod¹ MS-MS DIAGNOSTYKA POD LUPĄ na obecnoœæ fenytoiny, HPPH, HPPH-glukuronidu, fenytoino-n-glukuronidu oraz metabolitu fosfenytoiny. Fenytoino-N-glukuronid oraz HPPH-glukuronid analizowano w trybie jonów dodatnich z racji lepszej odpowiedzi analitycznej, zaœ pozosta³e zwi¹zki analizowano w trybie jonów ujemnych, z tego samego powodu. Frakcje zawieraj¹ce metabolit fosfenytoiny zebrano, odparowano i rozpuszczono w niewielkiej iloœci mieszaniny metanol-woda (10:90 czêœci objêtoœciowych). Dalsze oczyszczanie prowadzono przy u yciu kolumny 2,0 x 100 mm Betamax Acid, stosuj¹c fazê ruchom¹ acetonitryl 1 ml/l roztwór kwasu L- -mlekowego w wodzie z dodatkiem wodnego rozwtoru 10 mmol/l octanu amonu (85:15 czêœci objêtoœciowych), dla szybkoœci przep³ywu fazy równej 0,3 ml/min. Podobnie jak opisywano to wczeœniej, zbierano frakcje przez 1 minutê ka da, po³¹czono je i poddano analizie metod¹ MS-MS. Frakcje zawieraj¹ce metabolit po³¹czono i odparowano. W celu usuniêcia resztek octanu amonu przeprowadzono ostateczn¹ ekstrakcjê do fazy sta³ej, podobn¹ do opisanej powy ej w tekœcie. REAKTYWNOŒÆ W TESTACH IMMUNOCHEMICZNYCH Podczas rozdzia³u chromatograficznego i oczyszczania metabolitu fosfenytoiny o wartoœci m/z=457, zbierane przez 1 minutê frakcje poddano analizie przy u yciu immunofluorescencyjno-polaryzacyjnej metody (FPIA, Tdx) oznaczania wolnej fenytoiny. Porcje ka dego z eluatów o objêtoœci 150? l umieszczono w polipropyenowej probówce do mikroodwirowywania i odparowywano w atmosferze azotu w celu usuniêcia fazy ruchomej zawieraj¹cej acetonitryl. Po odparowaniu fazy ruchomej, do probówek zawieraj¹ce such¹ pozosta³oœæ dodawano 150? l wodnego roztworu NaCl o stê eniu 9 g/l, wytrz¹sano i analizowano przy u yciu aparatu TDx. DOK ADNA ANALIZA MASOWA Dok³adn¹ analizê masow¹ przeprowadzono przy u yciu spektrometru masowego czasu przelotu Mariner (PE Biosystems). Przyrz¹d wyregulowano i wykalibrowano na HPPH-glukuronid oraz fenytoino-n-glukuronid. Próbki nastrzykiwano bezpoœrednio, przy pomocy strzykawek. Do okreœlenia sk³adu cz¹steczek u yto oprogramowania Masslynx, wersja 3.3. ANALIZA NMR Dane NMR uzyskano przy u yciu spektrometru Varian Inova 600 HPLC-NMR oraz programu VNMR 6.1B, spektrometr ten by³ wyposa ony w komorê przep³ywow¹ 1H- -[15N, 13C] o aktywnej objêtoœci 60? l, po- ³¹czon¹ szeregowo z pojedynczym, kwadrupolowym spektrometrem masowym Waters ZMD. Aby z³agodziæ wp³yw zanieczyszczeñ egzogennych, metabolit o wartoœci m/z=457 wydzielono metod¹ HPLC w celu Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 9

przeprowadzenia analizy NMR w trybie online, na kolumnie Zorbax XDB-C8 (2,1 mm x 15 cm), po³¹czonej szeregowo z kolumn¹ zabezpieczaj¹c¹ Upchurch Uptight (Upchurch Scientific) z wype³nieniem b³onkowatym C18 (rozmiar cz¹stek 40? m). Rozdzielenie przeprowadzono przy u yciu fazy ruchomej o sk³adzie: roztwór kwasu deuterooctowego (1ml/l) w ciê kiej wodzie-deuteroacetonitrylu (80:20 czêœci objêtoœciowych; szybkoœæ przep³ywu: 0,3 ml/minutê). Pik odpowiadaj¹cy metabolitowi monitorowano przy wartoœci m/z=461 (w trybie jonów ujemnych, cztery protony ulegaj¹ce wymianie na 2H). Dane NMR zbierano dla szczytu piku. Widma 1D NMR wygenerowano przy u yciu szybkiej transformacji Fouriera swobodnego zaniku indukcji, równej sumie 18 352 przejœæ. Ka de z przejœæ indukowano przy u yciu nieselektywnego pulsu 90o 1H w po³¹czeniu z selektywnym pulsem wstêpnego nasycenia, wysy³anym do rezonansu HDO podczas zaniku relaksacji. Powstaj¹cy, uœredniony po czasie swobodny zanik indukcji mno ono przez wyk³adnicz¹ funkcjê zaniku (poszerzenie linii, czêstotliwoœæ 3 Hz), co mia³o na celu zwiêkszenie wartoœci stosunku sygna³u do szumu. POMIAR STÊ ENIA METABOLITU W SUROWICY KRWI Wzglêdne iloœci metabolitu oznaczano w surowicy krwi 12 pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fosfenytoinê oraz od 12 pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fenytoinê. Surowica pacjentów z mocznic¹ (3? l), po³¹czone z surowica osoby zdrowej (10? l) w celu zwiêkszenia mieszanej objêtoœci, umieszczono w polipropylenowej probówce do mikrowirowywania. Nastêpnie, do próbki dodano 300? l acetonitrylu, ca³oœæ energicznie wstrz¹saj¹c przez 30 sekund. Po zakoñczeniu trwaj¹cego 5 minut wirowywania, nads¹cz acetonitrylowy przeniesiono do kolejnej probówki o pojemnoœci 0,5 ml i odparowano do sucha w atmosferze azotu. Pozosta³oœæ zalano 5? l metanolu, wytrz¹sano, a nastêpnie dodano 45? l wody, uzyskuj¹c ³¹czn¹ objêtoœæ próbki równ¹ 50? l. Po zakoñczeniu wytrz¹sania próbki, jej zawartoœæ przeniesiono do szklanej ampu³ki, a 10? l próbki analizowano przy pomocy metody HPLC-MS-MS. Analizê chromatograficzn¹ wykonano na kolumnie 2,1 x 150 mm Zorbax RX-C18, zaœ jako fazê ruchom¹ stosowano uk³ad acetonitryl-roztwór kwasu octowego w wodzie o stê eniu 1ml/l (15:85 czêœci objêtoœciowych), przy szybkoœci przep³ywu równej 0,3 ml/minutê. Zintegrowan¹ reakcjê metabolitu okreœlan¹ przez powierzchniê pod chromatogramem, oceniano w trybie jednoczesnego monitorowania kilku reakcji, œledz¹c przejœcie od m/z=457 do 193 przy u yciu tandemowego spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima. BADANIA METOD WYMIANY DEUTEROWEJ Poszczególne roztwory (porcje o objêtoœci 50? l) fenytoiny, HPPH, HPPH-glukuronidu, fenytoino-n-glukuronidu oraz oczyszczonego metabolitu fosfenytoiny inkubowano wraz z 200? l ciê kiej wody przez godzinê, w temperaturze otoczenia. Po zakoñczeniu inkubacji pobierano próbki o objêtoœci 10? l, które wstrzykiwano bezpoœrednio do spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima przy u yciu autosamplera firmy Perkin-Elmer, stosuj¹c jako fazê ruchom¹ uk³ad acetonitryl-ciê ka woda (50: 50 czêœci objêtoœciowych). Nie stosowano kolumny analitycznej, poniewa w tym przypadku nie by³o potrzebne przeprowadzanie rozdzia³u. METYLOWANIE GRUP KARBOKSYLOWYCH Roztwór (10? l) zawieraj¹cy oczyszczony metabolit fosfenytoiny inkubowano przez ca³¹ noc z nadmiarem BF3 w metanolu. Nastêpnie mieszaninê odparowano, do pozosta³oœci dodawano roztwór metanolu o stê eniu 100 ml/l i nastrzykiwano na kolumnê Betamax Acid, stosuj¹c jako fazê ruchom¹ uk³ad acetonitryl-wodny roztwór kwasu octowego o stê- eniu 1 ml/l z dodatkiem wodnego roztworu octanu amonu o stê eniu 10 mmol/l (85:15 czêœci objêtoœciowych), dla szybkoœci przep³ywu roztworu 0,3 ml/minutê. WYNIKI CHARAKTERYSTYKA WIDMA MS Analiza metabolitu fosfenytoiny przy u yciu metody dok³adnej analizy masowej wykaza³a obecnoœæ zwi¹zku charakteryzuj¹cego siê wartoœci¹ stosunku m/z=457,11 w trybie jonów ujemnych. Stosowano równie oprogramowanie Masslynx, umo liwiaj¹ce przewidywanie wzorów chemicznych i struktur zwi¹zków zgodnych z uzyskan¹ mas¹ cz¹steczkow¹. Fosfenytoina jest prolekiem i pochodn¹ fenytoiny, zak³adaliœmy zatem, i jej metabolit powinien posiadaæ w strukturze rdzeñ zbli ony do fenytoiny. Do oprogramowania okreœlaj¹cego sk³ad pierwiastkowy wprowadzono kryteria, umo liwiaj¹ce wykluczenie wzorów chemicznych, które nie odpowiada³yby strukturze zbli onej do cz¹steczki fenytoiny. Kryteria te by³y nastêpuj¹ce: (a) minimaln¹ liczbê atomów azotu, wêgla i wodoru; (b) 10 30 równowa ników wi¹zañ podwójnych, poniewa cz¹steczka fenytoiny zawiera wiele wi¹zañ podwójnych; oraz (c) tolerancja masy równa 0,04 atomowej jednostki masy. Program okreœli³ na podstawie sk³adu pierwiastkowego 67 wzorów cz¹steczek, spoœród których 7 mieœci³o siê w okreœlonym zakresie tolerancji. Jeden z wzorów, C22H21N2O9, by³ zgodny ze sk³adem pierwiastkowym przewidzianym na podstawie naszych badañ strukturalnych. Kompletne widmo masowe wyizolowanego metabolitu fosfenytoiny, uzyskane przy u yciu systemu Micromass Ultima MS- -MS, przedstawiono na rys. 2. Jak widaæ Dokładną analizę masową przeprowadzono przy użyciu spektrometru masowego czasu przelotu Mariner (PE Biosystems) na rys. 2, uzyskane widmo masowe ma kilka cech charakterystycznych: wartoœæ stosunku m/z=457 dla jonu macierzystego jest zgodna z dok³adn¹ mas¹ cz¹steczkow¹ zaobserwowan¹ podczas analizy przeprowadzonej przy u yciu przyrz¹du Mariner, mierz¹cego czas przelotu jonu. Ponadto, kilka mas jonów pochodnych mo na przypisaæ strukturze fenytoiny na podstawie porównania z widmem wzorcowym, otrzymanym dla fenytoiny przy u yciu tego samego, tandemowego spektrometru masowego. Do grupy tych jonów nale ¹ fragmenty o wartoœci m/z 251, 131, 103 i 77. Nie mo na wykazaæ, e fragmenty o wartoœci m/z równej 193, 175 i 113 s¹ produktami fragmentacji fenytoiny, ale mo na je przypisaæ jonowi macierzystemu oraz jonom pochodnym obserwowanym dla kwasu glukuronowego. CHARAKTERYSTYKA CHROMATOGRAFICZNA W³aœciwoœci retencyjne w kilku ró nych warunkach chromatograficznych równie by³y zgodne z proponowan¹ struktur¹ metabolitu fosfenytoiny. W przypadku zastosowania konwencjonalnej chromatografii w uk³adzie faz odwróconych na kolumnie C18, metabolit wykaza³ krótszy czas retencji ni zwyk³e, glukuronidowe metabolity fenytoiny (<7 minut). Przeciwny wynik uzyskano dla fenytoiny, która by³a silniej zatrzymywana na kolumnie i charakteryzowa³a siê czasem retencji równym 14 minut. W³aœciwoœci retencyjne badano równie przy u yciu kolumny Betamax Acid. Kolumna ta wykorzystuje specjaln¹ grupê polarn¹, osadzon¹ w d³ugim ³añcuchu alkilowym, a struktura ta zosta³a zaprojektowana tak, aby uzyskaæ specjalne powinowactwo do karboksylowych grup kwasowych. Zgodnie z oczekiwaniami, fenytoina i HPPH oddzia³ywa³y s³abo z wype³nieniem kolumny. W przeciwieñstwie do nich, metabolit fosfenytoiny, HPPH-glukuronid oraz fenytoino-n-glukuronid wykaza³y siê silniejszym oddzia³ywaniem z wype³nieniem kolumny, mia³y one zatem równie d³u sze czasy re- 10 Cała prawda w jednej kropli

tencji. Czasy retencji dla metabolitu fosfenytoiny i fenytoino-n-glukuronidu, posiadaj¹cych wolne, kwasowe grupy karboksylowe 18, 19, by³y bardzo zbli one do siebie; zwi¹zki te dawa³y równie piki ostatnich eluatów. IMMUNOREAKTYWNOŒÆ METABOLITU FOSFENYTOINY Na rys. 3 przedstawiono zale noœæ odpowiedzi uzyskanej w teœcie immunochemicznym od chromatograficznego czasu retencji dla próbek surowicy pobranych od jednego z pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê. Chromatograficzne czasy retencji wyd³u- ono w celu zapewnienia maksymalnego mo - liwego rozdzielenia sk³adników mieszaniny. Na rys. 3 przedstawiono równie czasy retencji dla ró nych pochodnych hydantoiny, co ilustruje fakt, i w naszych badaniach zaobserwowaliœmy dwa g³ówne piki chromatograficzne o mierzalnej immunoreaktywnoœci. Pierwszy pik (10 14 minut) zidentyfikowano jako fenytoinê, zaœ drugi pik (26 32 minuty) zidentyfikowano jako metabolit fosfenytoiny o wartoœci m/z=457. Obserwacja ta wskazuje, e metabolit fosfenytoiny wykazuje w tym konkretnym teœcie immunochemicznym daj¹c¹ siê ³atwo zaobserwowaæ reaktywnoœæ krzy ow¹. Na ró nych etapach procesu oczyszczania metabolitu z surowicy pacjenta z mocznic¹, jak równie w trakcie analizy acetonitrylowych osadów otrzymywanych z próbek surowicy, frakcje eluatu chromatograficznego zawieraj¹ce metabolit poddawano badaniom, których celem by³o wykazanie istnienia korelacji miêdzy wzglêdnym stê eniem metabolitu a stê eniem fenytoiny oznaczonym metod¹ immunochemiczn¹. Pomiêdzy zale noœciami tymi istnieje bezpoœrednia korelacja, potwierdzaj¹ca fakt, i metabolit rzeczywiœcie ulega reakcji krzy owej w teœcie immunochemicznym s³u- ¹cym do oznaczania stê enia fenytoiny, co ilustruje rys. 4. ANALIZA STRUKTURALNA NMR Dane NMR uzyskane dla metabolitu oraz dla dwóch zwi¹zków wzorcowych zosta³y przedstawione na rys. 5. Fenytoino-N-glukuronid (górne widmo) wykazywa³ w badaniu NMR dwie istotne cechy charakterystyczne. Dwa pierœcienie fenylowe wykazywa³y dwa oddzielne sygna³y rezonansowe obecne przy 7,3 i 7,4 ppm, podczas gdy reszta glukuronidowa dawa³a piêæ sygna³ów rezonansowych (1-5 ), zgodnych z faktem obecnoœci tego typu struktury wêglowodanowej. Analizê chromatograficzn¹ przeprowadzono na kolumnie Zorbax RX-C18 (2,1 x 150 mm), po³¹czonej szeregowo z kolumn¹ Betamax Acid (2,0 x 30 mm). Faza ruchoma: acetonitryl-wodny roztwór kwasu octowego (1ml/l) z dodatkiem wodnego roztworu octanu amonu (6 mmol/l) (82: 18 czêœci objêtoœciowych), szybkoœæ przep³ywu: 0,3 ml/minutê;? test immunochemiczny, (integracja MS-MS. W przypadku hydroksymetylofenytoiny (rys. 5, œrodkowe widmo), pierœcienie fenylowe równie wykazywa³y ten sam wzorzec sygna³ów rezonansowych, poniewa nie ulega³y one reakcji sprzêgania ani nie by³y modyfikowane w jakikolwiek inny sposób. Poniewa hydroksymetylofenytoina nie zawiera w cz¹steczce reszty glukuronidowej, w widmie nie zaobserwowano adnego z sygna- ³ów rezonansowych przypisywanych reszcie wêglowodanowej. Dodatkowa grupa - CH2 dawa³a jednak dodatkowy, przewidywany, singletowy sygna³ rezonansowy przy wartoœci 5,0 ppm (pik A). Wzór sygna³ów NMR dla metabolitu fosfenytoiny (rys. 5, dolne widmo) wykaza³ obecnoœæ sygna³ów zgodnych z obydwoma zwi¹zkami wzorcowymi. Sygna³y rezonansowe dwóch pierœcieni fenylowych s¹ zgodne z obserwowanymi poprzednio i mo na je zaobserwowaæ przy wartoœciach 7,3 i 7,4 ppm, co pokazuje, e miejsce, w którym zachodzi reakcja sprzêgania w cz¹steczce, nie znajduje siê w adnym z pierœcieni fenylowych. Sygna³y rezonansowe 1-5 obecne w zakresie pomiêdzy 3,0 i 4,5 ppm by³y zgodne z sygna³ami, jakich nale a³oby oczekiwaæ dla reszty glukuronidu. W cz¹steczce obecny by³ równie mostek CH2 (pik A), ale jego sygna³ ulega³ rozszczepieniu, poniewa obydwa atomy wodoru tej grupy znajduj¹ siê pod wp³ywem dwóch ró nych elementów: pierœcienia hydantoiny oraz pierœcienia glukuronidowego. DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Rys. 2. Widma masowe fragmentów jonów pochodnych jonu molekularnego o wartości m/z=457 Rys. 3. Odpowiedzi w teście immunochemicznym oraz integracja MS-MS wykreślone w postaci zależności od chromatograficznego czasu retencji dla próbek surowicy pobranych od pacjentów z mocznicą otrzymujących fosfenytoinę WYMIANA IZOTOPOWA (DEUTEROWA) Wyniki badania polegaj¹cego na wymianie izotopowej wodór-deuter (H-D) pomog³y okreœliæ to samoœæ metabolitu fenytoiny. Poniewa atom wodoru (a w tym przypadku atom deuteru) jest zwykle tracony przez cz¹steczkê w trybie jonów ujemnych, jeden z wymienionych atomów deuteru bêdzie tracony przez cz¹steczkê; tym samym, obserwowana wartoœæ stosunku m/z dla zwi¹zku bêdzie o jedn¹ jednostkê masow¹ mniejsza ni rzeczywista wartoœæ m/z. Nale y przy tym zauwa yæ, e wi¹zania C-H z trudem ulegaj¹ wymianie izotopowej, a g³ówny efekt wymiany izotopowej H-D bêdzie obserwowany w przypadku wi¹zañ H-N i O-H. Dane wymienione w tabeli 1 pokazuj¹, e przewidywane i obserwowane zmiany sk³adu masowego zwi¹zku spowodowane wymian¹ deuterow¹ s¹ bez wyj¹tku zgodne ze struktur¹ zwi¹zków z grupy pochodnych hydantoiny, w tym równie z proponowan¹ struktur¹ metabolitu fosfenytoiny. DERYWATYZACJA GRUPY KARBOKSYLOWEJ Przeprowadzone przez nas badania chromatograficzne wykaza³y, e metabolit fosfenytoiny by³ zatrzymywany na kolumnie HPLC Betamax Acid, co by³o prawdopodobnie spowodowane obecnoœci¹ grupy karboksylowej w cz¹steczce tego zwi¹zku. Derywatyzacja prowadzona przy pomocy odczynnika BF3- -metanol, selektywnie metyluj¹cego wszelkie obecne w cz¹steczce grupy karboksylowe, prowadzi³a do obserwowanej straty metabolitu o wartoœci m/z=457 przy oczekiwanej wartoœci chromatograficznego czasu retencji oraz do pojawienia siê nowego zwi¹zku chemicznego o wartoœci m/z=471, eluowanego w pobli u tzw. pustej objêtoœci eluentu. Zmiana masy cz¹steczkowej zwi¹zku o 15 jednostek by³a zgodna z przejœciem pojedynczej grupy COOH do postaci COOCH3. Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 11

Rys. 4. Korelacja pomiędzy względnym stężeniem metabolitu, którego stężenie wyznaczono przy pomocy metody HPLC- MS-MS oraz stężeniem wolnej fenytoiny, wyznaczonym na podstawie testu immunochemicznego STÊ ENIA METABOLITU W PRÓBKACH SURO- WICY PACJENTÓW Z MOCZNIC Porównanie próbek surowicy krwi pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fenytoinê i fosfenytoinê przedstawiono w tabeli 2. Próbki surowicy (n=12) w ka dej z grup by- ³y pobrane od ró nych pacjentów. Obecnoœæ metabolitu stwierdzono w osoczu pacjentów otrzymuj¹cych fosfenytoinê, jednak nie uda- ³o siê stwierdziæ reakcji pochodz¹cej od tego metabolitu, przekraczaj¹cej poziom t³a, w osoczu pacjentów leczonych fenytoin¹. DYSKUSJA Wstêpna identyfikacja metabolitu fenytoiny wymaga³a nieco szczêœcia. Pocz¹tkowo próbowaliœmy izolowaæ metabolity fenytoiny i fosfenytoiny przy u yciu metodologii immunochemicznej. Próbki surowicy pacjentów inkubowano wraz z roztworem (2 ml lub 5 ml objêtoœci) odczynnika firmy Abbott, zawieraj¹cego przeciwcia³a monoklonalne. Po podzia³aniu na mieszaninê bia³kiem A-sefaroz¹ oraz po przeprowadzonym nastêpnie uwolnieniu zwi¹zków chemicznych zwi¹zanych z przeciwcia³ami, otrzymane nads¹cze poddawano analizie przy u yciu metody HPLC-MS-MS. Niestety, wiêksze stê enia fenytoiny w tych próbkach surowicy, w po³¹czeniu z pierwotn¹ swoistoœci¹ metody wobec fenytoiny, doprowadzi³y do uzyskania izolatów, które wyraÿnie wykazywa³y wy- ³¹cznie obecnoœæ fenytoiny. Fakt ten zmusi³ nas do wykonania badañ przesiewowych próbek ekstraktów surowicy przy u yciu metody HPLC-MS-MS w celu zidentyfikowania metabolitów fosfenytoiny. Zak³adaj¹c, e metabolit posiada³ w cz¹steczce fragment fenytoiny lub HPPH jako centraln¹ czêœæ struktury, wykonaliœmy chromatografiê w uk³adzie odwróconych faz, dla ³agodnego gradientu acetonitrylu, monitoruj¹c wartoœci m/z równe 251 i 268, w trybie jonów ujemnych. Uda³o nam siê uzyskaæ Rys. 5. Widma NMR fenytoino-n-glukuronidu (u góry), hydroksymetylofenytoiny (pośrodku) i metabolitu fenytoiny (u dołu) Tabela 3. Diagnostyka cukrzycy ciążowej (GDM). DTTG (2 h) doustny test tolerancji glukozy (glikemia w 2 godz.). Stężenia glukozy w osoczu krwi żylnej. POCZĄTEK CIĄŻY Glikemia na czczo: <95 mg/dl (5,3 mmol/l) prawidłowa 95 125 mg/dl (5,3 6,9 mmol/l) DTTG (2h): > 126 mg/dl (7,0 mmol/l) (dwukrotnie) GDM <140 mg/dl (7,8 mmol/l) prawidłowa > Tabela 3. Diagnostyka cukrzycy ciążowej (GDM). DTTG (2 h) doustny test tolerancji glukozy (glikemia w 2 godz.). Stężenia glukozy w osoczu krwi żylnej. > POCZĄTEK CIĄŻY Glikemia na czczo: <95 mg/dl (5,3 mmol/l) prawidłowa 95 125 mg/dl (5,3 6,9 mmol/l) DTTG (2h): > 126 mg/dl (7,0 mmol/l) (dwukrotnie) GDM <140 mg/dl (7,8 mmol/l) prawidłowa > 140 mg/dl (7,8 mmol/l) GDM 24. 28. TYDZIEŃ CIĄŻY Test przesiewowy; opcjonalnie (50 g glukozy, glikemia po 1 godz.): <140 mg/dl (7,8 mmol/l) ujemny 140 200 mg/dl (7,8 11,1 mmol/l) DTTG (2h): > 200 mg/dl (11,1 mmol/l) GDM <140 mg/dl (7,8 mmol/l) prawidłowa > 140 mg/dl (7,8 mmol/l) GDM dwa piki o wartoœci m/z=251, które poddano dalszej analizie, polegaj¹cej na identyfikacji jonów macierzystych w piku 251. Jeden z nich zidentyfikowano jako zwi¹zek posiadaj¹cy jon macierzysty o wartoœci m/z=457, zaœ drugi z nich zidentyfikowano jako fenytoinê. Dysponuj¹c tak¹ informacj¹, kontynuowaliœmy izolowanie metabolitu o wartoœci m/z równej 457, zgodnie z danymi przedstawionymi we wczeœniejszej czêœci artyku³u. Okaza³o siê, i jako pierwszy etap procedury oczyszczania zwi¹zku nale y przeprowadziæ ekstrakcjê do fazy sta³ej. W pozosta³oœci otrzymanej podczas wytr¹cania osadu z próbek surowicy pacjentów przy pomocy acetonitrylu obecne by³y du e stê enia soli. Sole te powodowa³y t³umienie sygna³ów podczas masowej analizy spektralnej, a tym samym konieczna by³y ich eliminacja (w miarê mo liwoœci). Piœmiennictwo dostêpne na yczenie. 12 Cała prawda w jednej kropli