Rozwój metod analitycznych i badanie sposobów rozprzestrzeniania się wybranych farmaceutyków w środowisku

AUTOREFERAT Omówienie cyklu publikacji pt. Rozwój metod analitycznych i badanie sposobów rozprzestrzeniania się wybranych farmaceutyków w środowisku Jolanta Kumirska Wydział Chemii Uniwersytetu Gdańskiego Gdańsk, 2014

1. Imię i nazwisko: Jolanta Kumirska 2. Posiadane stopnie i tytuły naukowe: Doktor nauk chemicznych w zakresie chemii Wydział Chemii Uniwersytetu Gdańskiego (15.02.2006); Rozprawa doktorska pt. Jednostki powtarzalne antygenów somatycznych bakterii Salmonella Agona (O:4) i Salmonella Dakar (O:28) i ich właściwości immunochemiczne wykonana pod kierunkiem prof. dra hab. inż. Janusza Szafranka. Tytuł zawodowy magistra chemii Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytetu Gdańskiego (16.07.1991); Praca magisterska pt. Hydroliza chityny wykonana pod kierunkiem prof. dra hab. inż. Janusza Szafranka. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: 2012 - Zastępca Dyrektora Instytutu Ochrony Środowiska i Zdrowia Człowieka ds. Dydaktycznych, Wydział Chemii UG 2012 - Kierownik Międzywydziałowych Studiów Podyplomowych Współczesne metody analityki z elementami diagnostyki molekularnej, UG 2006 - Adiunkt, Wydział Chemii UG 1996-2006 Asystent, Wydział Chemii UG 1990-1991 Pracownik techniczny, Wydział Chemii UG 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a. Tytuł rozprawy habilitacyjnej: Rozwój metod analitycznych i badanie sposobów rozprzestrzeniania się wybranych farmaceutyków w środowisku 2

b. Cykl prac wchodzących w skład rozprawy habilitacyjnej, stanowiących osiągnięcie naukowe: H1. Magda Caban, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Natalia Migowska, Jolanta Kumirska*, Determination of β-blockers and β-agonists using gas chromatography and gas chromatography mass spectrometry A comparative study of the derivatization step. Journal of Chromatography A 1218 (2011) 8110-8122. IF 2011 = 4,531 H2. Natalia Migowska, Magda Caban, Piotr Stepnowski, Jolanta Kumirska*, Simultaneous analysis of non-steroidal anti-inflammatory drugs and estrogenic hormones in water and wastewater samples using gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography with electron capture detection. Science of the Total Environment 441 (2012) 77 88. IF 2012 = 3,258 H3. Natalia Migowska, Piotr Stepnowski, Monika Paszkiewicz, Marek Gołębiowski, Jolanta Kumirska*, Trimethylsilyldiazomethane (TMSD) as a new derivatization reagent for trace analysis of selected non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by gas chromatography methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry 397 (2010) 3029-3034. IF 2010 = 3,841 H4. Magda Caban, Katarzyna Mioduszewska, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Jolanta Kumirska, DIMETRIS (dimethyl(3,3,3-trifluoropropyl)silyldiethylamine) a new silylating agent for the derivatization of β-blockers and β-agonists in environmental samples. Analytica Chimica Acta 782 (2013) 75 88. IF 2012 = 4,387 H5. Magda Caban, Małgorzata Czerwicka, Paulina Łukaszewicz, Natalia Migowska, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Jolanta Kumirska*, A new silylation reagent dimethyl(3,3,3-trifluoropropyl)silyldiethylamine for the analysis of estrogenic compounds by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1301 (2013) 215 224. IF 2012 = 4,612 H6. Jolanta Kumirska*, Natalia Migowska, Magda Caban, Alina Plenis, Piotr Stepnowski, Chemometric analysis for optimizing derivatization in GC-based procedures. Journal of Chemometrics, 25 (2011) 636 643. IF 2011 = 1,952 H7. Jolanta Kumirska*, Alina Plenis, Paulina Łukaszewicz, Magda Caban, Natalia Migowska, Anna Białk-Bielińska, Małgorzata Czerwicka, Piotr Stepnowski, Chemometric optimization 3

of derivatization reactions prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis, Journal of Chromatography A 1296 (2013) 164 178. IF 2012 = 4,612 H8. Magda Caban, Natalia Migowska, Piotr Stepnowski, Marek Kwiatkowski, Jolanta Kumirska*, Matrix effects and recovery calculations in analyses of pharmaceuticals based on the determination of β-blockers and β-agonists in environmental samples. Journal of Chromatography A 1258 (2012) 117-127. IF 2012 = 4,612 H9. Cykl trzech publikacji w czasopiśmie Camera Separatoria poświęconych analityce pozostałości farmaceutyków w środowisku: H9a. Jolanta Kumirska*, Marta Potrykus, Natalia Migowska, Ewa Mulkiewicz, Zastosowanie chromatografii gazowej do rozdzielania i oznaczania wybranych estrogenów w próbkach środowiskowych. Camera Separatoria 4/1 (2012) 7-36. H9b. Natalia Migowska, Jolanta Kumirska, Zastosowanie wybranych innowacyjnych technik służących do izolacji i/lub wzbogacania pozostałości wybranych farmaceutyków w próbkach środowiskowych. Camera Separatoria 4/1 (2012) 37-59. H9c. Magda Caban, Anna Michalak, Jolanta Kumirska, Metody rozdzielania i oznaczania pozostałości β-blokerów i β-agonistów w próbkach środowiskowych. Camera Separatoria 4/1 (2012) 61-79. H10. Anna Białk, Jolanta Kumirska, Richard Palavinskas, Piotr Stepnowski, Optimization of multiple reaction monitoring mode for the trace analysis of veterinary sulfonamides by LC MS/MS. Talanta 80 (2009) 947-953. IF 2009 = 3,29 H11. Anna Białk-Bielińska, Grzegorz Siedlewicz, Piotr Stepnowski, Ksenia Pazdro, Aleksandra Fabiańska, Jolanta Kumirska, A very fast and simple method for the determination of sulfonamide residues in seawaters Analytical Methods 3 (2011) 1371-1378. IF 2011 = 1,547 H12. Anna Białk-Bielińska, Joanna Maszkowska, Wojciech Mrozik, Agata Bielawska, Marta Kołodziejska, Richard Palavinskas, Piotr Stepnowski, Jolanta Kumirska, Sulfadimethoxine and sulfaguanidine: their sorption potential on natural soils, Chemosphere 86 (2012) 1059 1065. IF 2012 = 3,137 H13. Joanna Maszkowska, Marta Kołodziejska, Anna Białk-Bielińska, Wojciech Mrozik, Jolanta Kumirska, Piotr Stepnowski, Richard Palavinskas, Oliver Krüger, Ute Kalbe, Column and 4

batch tests of sulfonamide leaching from different types of soil. Journal of Hazardous Materials 260 (2013) 468 474. IF 2012 = 3,925 H14. Anna Białk-Bielińska, Stefan Stolte, Marianne Matzke, Aleksandra Fabiańska, Joanna Maszkowska, Marta Kołodziejska, Beata Liberek, Piotr Stepnowski, Jolanta Kumirska*, Hydrolysis of sulphonamides in aqueous solutions. Journal of Hazardous Materials 221 222 (2012) 264 274. IF 2012 = 3,925 * Autor korespondencyjny c. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wstęp Rozwój metod analitycznych i badanie sposobów rozprzestrzeniania się wybranych farmaceutyków w środowisku Farmaceutyki to substancje aktywne biologicznie, które po wprowadzeniu do ustroju w ściśle określonej dawce prowadzą do osiągnięcia żądanego efektu terapeutycznego [1]. Szacuje się, że liczba preparatów leczniczych w skali globalnej wynosi około 200 000, przy czym na rynku danego kraju znajduje się ich od 5000 do 10 000 [2]. Prawidłowe określenie ilości spożywanych farmaceutyków, a zarazem pośrednio ilości leków wprowadzanych do środowiska jest niezwykle trudne, gdyż wiele z nich sprzedawanych jest bez recepty. Ocenia się na przykład, że roczna, światowa produkcja samych antybiotyków mieści się w zakresie od 100 000 do 200 000 ton [3]. Zgodnie z danymi zebranymi przez Ministerstwo Zdrowia przy współpracy z Biurem Regionalnym Światowej Organizacji Zdrowia WHO w Europie [4] zużycie leków w Polsce należy do jednych z najwyższych w Europie (około 456 milionów opakowań i około 200 milionów wypisanych recept tylko w roku 2009). I tak na przykład w 2004 r. leki zażywane były przez 54 % ludności a w 2009 r. już przez 71 % społeczeństwa. Każdego roku rośnie liczba leków spożywanych bez recepty: szczególnie przeciwkaszlowych, przeciwprzeziębieniowych oraz przeciwbólowych [4]. Farmaceutyki służą nie tylko do ochrony zdrowia człowieka. Znaczne ich ilości produkowane są także na potrzeby hodowli zwierząt i weterynarii [5,6]. Niektóre z nich pełnią funkcję stymulatorów wzrostu i wprowadzane są bezpośrednio do pasz [7]. Po podaniu wydalane są w formie niezmienionej lub/i w postaci metabolitów [8,9]. Istnieją zatem różne drogi przedostawania leków do środowiska naturalnego. Podstawowym źródłem jest przemysł farmaceutyczny, rolnictwo i weterynaria, ośrodki służby zdrowia oraz 5

gospodarstwa domowe. Przeterminowane środki lecznicze (bez ich utylizacji) wprowadzane są do środowiska zarówno na małą skalę z gospodarstw domowych, jaki i na znacznie większą ze szpitali. Dotychczas przeprowadzone badania wykazały występowanie śladowych ilości licznych farmaceutyków (w zakresie stężeń od ng/l do μg/l) nie tylko w ściekach komunalnych, szpitalnych czy przemysłowych, ale też w wodach powierzchniowych, gruntowych i w wodzie pitnej, a także w glebach i osadach dennych [5,6,10]. Pochodzą one z różnych grup farmaceutycznych, przy czym przeważają leki przeciwzapalne i przeciwbólowe, antybiotyki, leki obniżające poziom cholesterolu, sterydy i hormony pokrewne, leki przeciwpadaczkowe, β-blokery, preparaty przeciwnowotworowe, środki moczopędne, leki antydepresyjne i uspakajające oraz charakteryzujące się wyjątkową trwałością środki kontrastowe stosowane w rentgenografii [5,6,10-12]. Szacuje się, iż w większości komponentów środowiskowych blisko 50 % leków występuje w postaci macierzystej, pozostała zaś część w formie w różnym stopniu zmienionych metabolitów (metabolity I i II fazy). Udowodniono, że wiele z tych aktywnych substancji w niewielkim stopniu ulega procesom biodegradacji w warunkach naturalnych [5,6,10]. Te, które wraz ze ściekami (szczególnie szpitalnymi) trafiają do konwencjonalnych oczyszczalni ścieków, w wielu przypadkach także są nie w pełni usuwane ze strumienia zanieczyszczeń w klasycznych procesach oczyszczania wód. Nie są one w całości eliminowane również w wyniku procesów chemicznego utleniania w ramach uzdatniania wody pitnej [5,6,10]. Z tego względu obecność pozostałości farmaceutyków w środowisku wodnym może stanowić realne zagrożenie nie tylko dla organizmów wodnych (np. udowodniono silny, negatywny wpływ 17α-etynyloestradiolu na aktywność reprodukcyjną Danio rerio w stężeniu niższym niż 1 ng/l), ale także dla zdrowia człowieka [13,14]. Korzystanie z wody zawierającej pozostałości leków, zwłaszcza w długiej perspektywie, może zaburzać skutecznie równowagę w organizmie i przyczyniać się m.in. do powstania niebezpiecznego zjawiska lekooporności [15]. Do kompleksowej oceny zagrożeń wynikających z obecności farmaceutyków w środowisku, przewidywania ich losów i analizy ryzyka środowiskowego niezbędna jest identyfikacja i oznaczanie zarówno związków macierzystych, jak i ich metabolitów oraz produktów powstających podczas procesów degradacji zachodzących w warunkach naturalnych, w trakcie oczyszczania ścieków czy uzdatniania wody pitnej. Zdarza się bowiem, że toksyczność metabolitów wielu polarnych substancji zanieczyszczających środowisko jest znacznie wyższa niż związku wyjściowego [16]. Szczególną uwagę należy więc zwrócić na monitorowanie tych leków, których zużycie jest bardzo wysokie oraz tych, które charakteryzują się wysoką trwałością. W związku z powyższym wykrywanie, oznaczanie oraz badanie losu aktywnych związków farmaceutycznych oraz produktów ich metabolizmu w różnych komponentach środowiska 6

naturalnego jest jednym z priorytetowych zadań z zakresu współczesnej chemii analitycznej i środowiskowej. Ważnym ograniczeniem prowadzonych badań jest dostępność odpowiednio czułych i miarodajnych metodyk analitycznych, które umożliwiłyby oznaczanie różnorodnych leków występujących w ilościach śladowych w tak złożonych matrycach. Celem badań, wyniki których zawarto w niniejszym osiągnięciu naukowym, było opracowanie odpowiednich procedur analitycznych, które umożliwiłyby oznaczanie wybranych farmaceutyków, przede wszystkim w wodnych próbkach środowiskowych jako głównych miejsc, do których przenikają te związki w układzie przyrodniczym. Do badań wybrano przedstawicieli grup farmaceutyków powszechnie stosowanych w medycynie: niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), związków estrogennych, β-blokerów, β-agonistów, leków antydepresyjnych oraz o działaniu przeciwpadaczkowym, a także należących do grupy sulfonamidów. Dalsze prace miały na celu poznanie sposobu rozprzestrzeniania się w środowisku ostatniej wymienionej klasy leków sulfonamidów, które zaliczane są do chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym, stosowanych w znacznych ilościach w weterynarii i rolnictwie. Postanowiono zbadać mechanizm sorpcji do gleb trzech przedstawicieli tych leków, a dla dwunastu określić stabilność hydrolityczną. W opisie osiągnięć naukowych poszczególne rozdziały poprzedzono krótkim wstępem literaturowym. Opis osiągnięć naukowych I. Analityka pozostałości farmaceutyków w środowisku Dotychczas, najczęściej wybieraną techniką analityczną do oznaczania pozostałości farmaceutyków w środowisku jest chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) lub tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) [17]. Mimo dogodności jaką daje ta technika analityczna, głównie w zakresie znacznego uproszczenia etapu przygotowania próbek do analizy, ma ona szereg ograniczeń, do których należą m.in. interferencje analitów ze składem matrycy wpływające bezpośrednio na granicę oznaczalności i wykrywalności, problemy z powtarzalnością i odtwarzalnością wyników, znaczący wpływ rodzaju fazy ruchomej na proces jonizacji i fragmentacji związków, a także brak biblioteki widm mas czy wysoki koszt analizy [18,19]. Interesującą alternatywą jest zastosowanie chromatografii gazowej, szczególnie w tych przypadkach, gdy badane leki występują na bardzo niskim poziomie stężeń a skład matrycy zakłóca prawidłową detekcję tych związków przy użyciu techniki LC-MS/MS. Niższe koszty analizy oraz mniejsze zużycie rozpuszczalników także przemawiają na korzyść tego rozwiązania. Większa 7

dostępność aparatury GC-MS sprawia ponadto, że metodyki analityczne oparte na chromatografii gazowej mogą być znacznie szybciej wprowadzone do rutynowych analiz w laboratoriach środowiskowych. Z uwagi na fakt, iż farmaceutyki w większości przypadków mają charakter polarny lub wysoce polarny, wymagane jest jednak przeprowadzenie ich w postać odpowiednich, lotnych pochodnych [20,21]. Polarność farmaceutyków związana jest z reguły obecnością w ich strukturze takich grup funkcyjnych jak OH, NH, COOH czy SH [20-26]. Podczas odparowywania związku w układzie dozownika może zachodzić reakcja dehydratacji, dekarboksylacji czy tworzenia struktur cyklicznych i wówczas te produkty, a nie związki wyjściowe, docierałyby do detektora (np. spektrometru mas w układzie GC-MS). Tak więc proces derywatyzacji zabezpiecza farmaceutyki przed ich rozkładem w układzie chromatograficznym i jest wymagany dla związków niestabilnych termicznie [24-26]. Należy też dodać, że bezpośrednia analiza chromatograficzna wielu farmaceutyków i/lub ich mieszanin bywa niemożliwa z uwagi na zbyt silne oddziaływania z fazą stacjonarną kolumny chromatograficznej. I tak na przykład, gdy leki zawierają wspomniane wyżej grupy funkcyjne mogą tworzyć międzycząsteczkowe wiązania wodorowe, które nie tylko obniżają ich lotność i stabilność, ale przyczyniają się do powstawania wspomnianych wyżej silnych oddziaływań z fazą stacjonarną. Może to prowadzić do niesymetrycznego kształtu sygnałów czyli tzw. ogonowania, spadku rozdzielczości i w następstwie kłopotów z wykonaniem właściwej analizy jakościowej i ilościowej (niepowtarzalny kształt i wielkość sygnałów chromatograficznych). Przekształcenie farmaceutyków do postaci pochodnych chroni przed takimi konsekwencjami. Kolejnym zadaniem derywatyzacji jest umożliwienie wykonania skutecznych rozdzieleń chromatograficznych tych leków, które w formie natywnej rozdzielają się słabo lub wręcz eluują razem [20-29]. Podsumowując, reakcje derywatyzacji przed analizą za pomocą techniki GC-MS wykonuje się w celu: a) zwiększenia lotności farmaceutyków, b) obniżenia ich polarności, c) zwiększenia stabilności termicznej leków, d) poprawienia właściwości chromatograficznych analitów, e) zwiększenia czułości i selektywności oznaczeń, a tym samym obniżenia granicy wykrywalności i oznaczalności metodyk analitycznych, f) poprawienia parametrów analizy jakościowej (bardziej charakterystyczne widma mas, wyższa rozdzielczość), g) umożliwienia wykonania rozdzieleń chromatograficznych leków chiralnych [20-29]. W przypadku analiz z użyciem techniki GC i GC-MS reakcje derywatyzacji polegają najczęściej na przeprowadzeniu reakcji alkilowania, acylowania bądź sililowania [20-29]. 8

Alkilowanie polega na wprowadzeniu w miejsce aktywnego wodoru grupy alkilowej lub alkilowoaromatycznej (np. benzylowej). Zachodzi wówczas gdy farmaceutyki posiadają atom(y) wodoru o charakterze kwasowym i prowadzi do otrzymywania eterów, tioeterów, N-alkiloamin, amidów czy sulfonamidów. W reakcji acylowania odczynnikami derywatyzującymi są kwasy karboksylowe lub ich pochodne. Leki zawierające podstawniki OH, SH i NH przekształcane są odpowiednio w estry, tioestry i amidy. Sililowanie jest reakcją najczęściej wykorzystywaną do konwersji chemicznej związków w lotne pochodne. Podczas tej reakcji następuje wymiana aktywnego wodoru z grupy COOH, OH, NH 2, NH czy SH na grupę sililową, najczęściej trimetylosililową [-Si(CH 3 ) 3 ] lub tert-butylo-dimetylosililową [-Si(CH 3 ) 2 (C(CH 3 ) 3 ]. W przypadku farmaceutyków zawierających różnorodne grupy funkcyjne dobrym rozwiązaniem może być zastosowanie bardziej złożonych odczynników derywatyzujących [20-29]. Warto dodać, że bezpośrednie porównanie danych literaturowych dotyczących efektywności derywatyzacji i jej użyteczności do oznaczeń śladowych jest bardzo trudne, a czasami wręcz niemożliwe. Wynika to z faktu, iż podczas opracowywania i walidacji metodyk analitycznych autorzy publikacji podają najczęściej wartości parametrów granicy oznaczalności i wykrywalności zaproponowanych procedur, ale nie odnoszą się w sposób ilościowy do testowanych warunków konwersji chemicznej analitów. Z reguły sprowadza się to tylko do podania czy dla wszystkich analitów uzyskano pojedynczą pochodną, a jeśli nie to z derywatyzacją których związków były kłopoty. Jedną z nielicznych prac, w których oceniono efektywność derywatyzacji była publikacja Shareef a i in. [30]. Autorzy ci wprowadzili do testowanej próbki wzorzec wewnętrzy, który nie ulegał reakcji, a następnie wyznaczyli względne współczynniki odpowiedzi detektora dla poszczególnych pochodnych względem tego wzorca (parametr RRF, ang. Relative Response Factor). Wartość współczynnika RRF rosła ze wzrostem efektywności derywatyzacji. Wielu analityków uważa, że procedura derywatyzacji farmacutyków jest zbyt czasoi pracochłonna (szczególnie gdy wymaga optymalizacji) i unika metodyk, które jej wymagają, skłaniając się bardziej do zastosowania techniki LC-MS lub LC-MS/MS. Międzylaboratoryjne badania wykazały jednak, że analizy próbek o skomplikowanym składzie i niskich stężeniach analitów oparte na technice GC-MS charakteryzują się wyższą czułością i selektywnością niż przy zastosowaniu układu LC-MS [31,32]. Zatem rozwój metod derywatyzacji farmaceutyków, wprowadzanie nowych odczynników do konwersji chemicznej, a także kontrola jakości opracowywanych metodyk są niezwykle istotnymi zadaniami współczesnej analityki tych związków, które zostały szeroko rozwinięte w publikacjach [H1-H9]. Z kolei w publikacjach [H10-H11] zaprezentowano zastosowanie techniki chromatografii cieczowej do oznaczania farmaceutyków w próbkach środowiskowych. 9

I.1. Zastosowanie chromatografii gazowej do oznaczania farmaceutyków w środowisku I.1.1. Porównanie skuteczności działania istniejących procedur derywatyzacji farmaceutyków oraz ich udoskonalenie Do badań wytypowano farmaceutyki należące do czterech klas środków farmaceutycznych: niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) (8 związków), o działaniu estrogennym (5 związków), β-blokerów (6 związków) i β-agonistów (2 związki), które z uwagi na powszechność stosowania w medycynie mogą występować w środowisku i stanowić realne zagrożenie dla układu przyrodniczego i zdrowia człowieka. Obecność wielu grup funkcyjnych w strukturach tych związków (m.in. układów aminowych, grup hydroksylowych czy ugrupowań karboksylowych) sprawiła, iż do ich modyfikacji chemicznej zastosowano szereg odczynników derywatyzujących, prowadzących do uzyskania różnorodnych pochodnych, odpowiednio: trimetylosililowych, sililowych o strukturze cyklicznej, tert-butylodimetylosililowych, trifluoroacetylowych, pentafluoropropylowych, heptafluorobutylowych, metylowych czy o charakterze mieszanym, np. trimetylosililo-trifluoroacetylowych. Rodzaj użytych odczynników był dobierany indywidualnie dla danej grupy leków oraz ich mieszanin, odpowiednio β-blokerów i leków przeciwastmatycznych [H1], a także związków o działaniu estrogennym i niesteroidowych leków przeciwzapalnych [H2]. Pod uwagę brano wpływ grup funkcyjnych obecnych w strukturach tych leków na trwałość związku wyjściowego i skuteczność derywatyzacji. Zastosowanie reagentów zawierających atomy fluorowców miało na celu umożliwienie wykorzystania bardzo czułego detektora wychwytu elektronów (ECD). Budowę chemiczną tworzących się pochodnych określano na podstawie analizy widm mas (EI, 70 ev) uzyskanych z pomiarów GC-MS. Dobór optymalnych warunków procesu derywatyzacji farmaceutyków obejmował testowanie różnych czasów i temperatur reakcji, rodzaju użytego katalizatora czy wprowadzonego rozpuszczalnika [H1-H2]. Przeprowadzono także eksperymenty z wykorzystaniem energii mikrofalowej, niemniej problemy z powtarzalnością oznaczeń sprawiły, iż zrezygnowano z jej stosowania [H2]. Skuteczność derywatyzacji oceniano na podstawie wyznaczenia dla poszczególnych pochodnych względnych współczynników odpowiedzi detektora względem wzorca wewnętrznego (RRF), który nie ulegał konwersji chemicznej (2-metyloantracenu) [H1-H2]. Jak wspomniano, wyższa wartość współczynnika RRF wskazywała na wyższą efektywność derywatyzacji i lepszą użyteczność testowanej metody do analiz próbek zawierających śladowe ilości analitów. I tak na przykład, podczas doboru optymalnych warunków konwersji chemicznej leków z grupy β-blokerów i leków przeciwastmatycznych reakcję syntezy pochodnych przeprowadzono korzystając z następujących odczynników sililujących: BSTFA, MTBSTFA, TMSI, HMDS, TMCS, TMSDEA, MSTFA oraz acylujących: MBTFA, HFBI, TFAA, 10

PFPA, PFPOH. Modyfikowano także czas (5, 15, 30, 45 i 60 min) i temperaturę reakcji (30 C, 60 C, 90 C, 120 C). Sprawdzano wpływ dodatku rozpuszczalnika (octanu etylu, pirydyny, toluenu) oraz katalizatora (1 % TMCS, 20 % TMCS, 50 % TMCS) na efektywność sililowania za pomocą BSTFA. Dodatkowo dla leków z grupy β-blokerów przetestowano cykliczną derywatyzację z użyciem odczynnika CMDMSDEA oraz derywatyzację sekwencyjną - sililowanie (MSTFA, BSTFA, HMDS lub TMSI), a następnie acylowanie (HFBI, TFAA lub MBTFA) [H1]. Dla utworzonych pochodnych ustalono odpowiednie warunki rozdzieleń chromatograficznych. Ostatecznie dla β-blokerów i β-adrenomimetyków za optymalne warunki derywatyzacji uznano użycie mieszaniny BSTFA z 1 % dodatkiem TMCS i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1 i prowadzenie reakcji przez 30 minut w 60 ºC [H1]. Podobne postępowanie dla mieszaniny niesteroidowych leków przeciwzapalnych i związków estrogennych wykazało, że najskuteczniejszą metodą przekształcenia ich w lotne pochodne było wykonanie reakcji w temperaturze 60 C przez 30 minut przy zastosowaniu mieszaniny pirydyny i odczynnika BSTFA z 1 % dodatkiem TMCS w stosunku objętościowym 1:1. W celu zwiększenia czułości oznaczeń dla mieszaniny 6 leków (dwóch z grupy NPLZ (diflunisal, ketoprofen) i czterech związków estrogennych (dietylostilbestrol, 17β-estradiol, estriol, estron)) zaproponowano procedurę derywatyzacji z użyciem odczynników PFPA i PFPOH, która prowadziła do tworzenia pochodnych pentafluoropropylowych i pentafluoropropionylowych, możliwych do wykrycia za pomocą detektora wychwytu elektronów (ECD) [H2]. I.1.2. Wprowadzenie nowych odczynników derywatyzujących Ważnym elementem procesu optymalizacji reakcji derywatyzacji jest rozszerzenie gamy testowanych odczynników o nowe, dostępne handlowo odczynniki, których wcześniej nie stosowano do tego celu. Podczas przeglądu literaturowego warunków derywatyzacji leków z grupy NLPZ (zawierających w swojej strukturze grupę karboksylową) znaleziono szereg metodyk opartych na metylowaniu [33-37]. Jednym z pierwszych odczynników stosowanych do metylowania leków o charakterze kwasowym był diazometan [38]. Derywatyzacja przy użyciu tego odczynnika zachodzi szybko, jest łatwa w wykonaniu i prowadzi do powstawania niewielu produktów ubocznych, niemniej niesie ze sobą wiele niedogodności i zagrożeń [21,39]. Wynikają one z wysokiej toksyczności diazometanu, niestabilności termicznej, jego wybuchowości oraz konieczności częstej syntezy z uwagi na niską trwałość. Synteza diazometanu jest nie tylko stosunkowo pracochłonna, ale przede wszystkim szkodliwa dla zdrowia. Pomimo tego odczynnik ten jest nadal używany do derywatyzacji leków o charakterze kwasowym [33]. Odpowiednikiem diazometanu jest handlowo dostępny trimetylosililodiazometan (ang. trimethylsilyldiazomethane, TMSD), który jest 11

sprzedawany jako 2 mol/l roztwór w heksanie. Co istotne, nie ma on właściwości mutagennych i wybuchowych [40,41]. Do tej pory stosowany był do derywatyzacji pestycydów i halogenokwasów, ale nie do chemicznej konwersji niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Postanowiono zatem sprawdzić skuteczność jego działania względem trzech przedstawicieli leków z grupy NLPZ: ibuprofenu, ketoprofenu i naproksenu [H3]. Identyfikacja pochodnych oparta była na analizie widm mas zarejestrowanych podczas pomiarów GC-MS (rys. 4 w [H3]). Sprawdzono, w jaki sposób czas i temperatura reakcji wpływają na wynik derywatyzacji (mierzony za pomocą parametru RRF) (rys. 3 w [H3]). Porównano ponadto efektywność działania TMSD z efektywnością działania innego popularnego odczynnika metylującego (14 % BF 3 w MeOH) oraz dwóch środków sililujących: BSTFA + 1 % TMCS i MTBSTFA. Sprawdzono, na ile obniży się granica wykrywalności stosowanego instrumentu pomiarowego (ang. Instrumental Detection Limit, IDL) gdy zmieni się odczynnik derywatyzujący. Uzyskane wyniki potwierdziły, że TMSD jest skutecznym odczynnikiem metylującym leki z grupy NLPZ, prowadzącym do powstawania pojedynczych pochodnych dla każdego farmaceutyku w ciągu 10 min w temperaturze pokojowej (rys. 1). Rys. 1. Fragmenty chromatogramów uzyskanych podczas analiz próbek zawierających takie same stężenia leków i wzorca wewnętrznego, ale poddanych działaniu różnych odczynników metylujących: a) TMSD, (b) 14 % BF 3 w MeOH. Oznaczenie: 1 - ibuprofen, 2 - naproksen, 3 - ketoprofen, IS - 2-metyloantracen jako wzorzec wewnętrzny (rys. 5 w publikacji [H3]) Odpowiedzi detektora FID w układzie GC były znacznie niższe gdy do derywatyzacji używano 14 % BF 3 w MeOH pomimo prowadzenia reakcji w wyższej temperaturze (100 C) i przez dłuższy 12

okres (30 min) (rys. 1) [H3]. Na wynik ten wpływać mogła także konieczność wymiany rozpuszczalnika przed analizą chromatograficzną, gdy środkiem metylującym był 14 % BF 3 w MeOH. Wyznaczone wartości IDL wykazały, że czułość metod analitycznych opartych na wykorzystaniu TMSD jako odczynnika derywatyzującego będzie wyższa niż przy zastosowaniu 14 % BF 3 w MeOH i BSTFA +1 % TMCS, ale niższa w porównaniu z użyciem MTBSTFA [H3]. Jak wspomniano, podczas prac nad doborem optymalnych warunków derywatyzacji leków z grupy β-blokerów i β-agonistów [H1] testowano użyteczność reakcji cykliczego sililowania zaproponowaną przez Block a i in. [42]. Odczynnik derywatyzujący o nazwie (chlorometylo)dimetylosilildioetyloamina (CMDMSDEA) był produktem reakcji chloro(chlorometylo)dimetylosilanu (CMDMCS) i dietyloaminy, którą prowadzi się w heksanie. Wykonano podobną syntezę z tym, że do reakcji zamiast CMDMCS wprowadzono najprostszy związek z grupy chlorosilanów TMCS (trimetylochlorosilan), który jest często stosowany jako katalizator reakcji sililowania. W wyniku tej syntezy uzyskano odczynnik o nazwie trimetylosilyldietyloamina (TMSDEA), który okazał się skutecznym środkiem sililującym grupy hydroksylowe [H1]. Postanowiono wykonać kolejną reakcję, w której substratem reakcji będzie związek o znacznie większej masie cząsteczkowej - chlorodimetylo(trifluoropropylo)silan (CDMTFPS) zawierający w swojej strukturze atomy fluoru. Produkt o właściwościach sililujących nazwano DIMETRIS [H4]. Schemat procedury syntezy DIMETRIS przedstawiono na rys. 2. Rys. 2. Schemat procedury syntezy DIMETRIS (dimetylo(3,3,3-trifluoropropylo)sililodietyloaminy) (fragment rys. 1. w publikacji [H4]) Każda z tych syntez polegała więc na reakcji odpowiedniego chlorosilanu z dietyloaminą, co pokazuje rys. 3. Produkt uboczny (HCl) reagował z nadmiarem DEA i strącał się w postaci chlorowodorku dietyloaminy. 13

Rys. 3. Schemat reakcji chemicznych zachodzących podczas syntezy A) CMDMSDEA, B) TMSDEA oraz C) DIMETRIS Zastosowanie do reakcji chlorosilanu zawierającego w swojej strukturze atomy fluoru prowadziło do uzyskania odczynnika derywatyzujacego, który podczas reakcji sililowania miał zdolność wprowadzania do struktur analitów atomów fluoru. Cecha ta jest niezwykle ważna z punktu widzenia analityki farmaceutyków występujących w ilościach śladowych, gdyż umożliwia zastosowanie bardzo czułego detektora wychwytu elektronów (ang. Electron Capture Detector, ECD). Jak dotąd było to możliwe przede wszystkim poprzez użycie odczynników acylujących, np. bezwodnika kwasu pentafluoropropylowego (PFPA) i bezwodnika kwasu trifluoroacetylowego (TFAA) [H1]. W wyniku tych reakcji tworzą się jednak produkty uboczne o charakterze kwasowym, które mogą działać niekorzystnie na układ chromatograficzny, szczególnie trwałość kolumny GC. Należy je usuwać (np. poprzez odparowanie w strumieniu azotu), co prowadzić może do strat analitów. Sililowanie za pomocą DIMETRIS jest mniej kłopotliwe i może być wykonane jednoetapowo. Udowodniono to przeprowadzając reakcję sililowania leków z grupy β-blokerów i β-agonistów za pomocą DIMETRIS [H4]. Okazał się on doskonałym odczynnikiem sililującym, o silnych właściwościach nukleofilowych, który reagował selektywnie z grupami hydroksylowymi obecnymi w strukturach tych związków [H4]. Reakcja ta zachodziła już w temperaturze 30 ᵒC w ciągu 30 min i nie wymagała stosowania katalizatorów. Uzyskane pochodne były stabilne oraz charakteryzowały się dobrymi właściwościami chromatograficznymi i spektroskopowymi (właściwy kształt sygnałów chromatograficznych, dobra rozdzielczość, charakterystyczne widma mas). Wprowadzenie do struktur β-blokerów i β-agonistów atomów fluoru pozwoliło wykorzystać do analiz chromatograficznych detektor ECD. Badania potwierdziły, że pięć z ośmiu β-blokerów 14

i β-agonistów (terbutalina, salbutamol, metoprolol, propranolol i acebutolol) można oznaczać z wykorzystaniem tej techniki [H4]. Silne właściwości nukleofilowe oraz zdolność do szybkiego reagowania z grupami hydroksylowymi sprawiły, że postanowiono podjąć próbę wykorzystania DIMETRIS do derywatyzacji pięciu związków o działaniu estrogennym [H5]. Trzy z nich: estron (E1), 17β-estradiol (E2) i estriol (E3) zaliczane są do estrogenów naturalnych, 17α-etynyloestradiol (EE2) jest ich syntetycznym analogiem, natomiast dietylostilbestrol (DES) reprezentuje estrogeny o budowie niesteroidowej. Estrogeny wykazują duży potencjał aktywności biologicznej, wpływając w istotny sposób na prawidłowy rozwój płciowy organizmów żywych [14,43-45]. Po przeniknięciu do środowiska mogą zaburzać prawidłowe funkcjonowanie układów endokrynnych, stąd zaliczane są do związków zakłócających właściwe działanie takich układów, w skrócie EDC (ang. Endocrine- Disrupting Compounds). Zdolność DIMETRIS do konwersji chemicznej związków estrogennych porównano z użytecznością dwóch powszechnie stosowanych odczynników sililujących: mieszaniny N,Obis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu z 1 % dodatkiem trimetylochlorosilanu (BSTFA + 1 % TMCS) oraz N-tert- butylodimetylosililo-n-metylotrifluoroacetamidu (MTBSTFA) [H5]. Przeprowadzone badania wykazały, że właściwości derywatyzujące DIMETRIS względem tych związków były znacznie lepsze niż MTBSTFA i tylko nieco gorsze od BSTFA + 1 % TMCS [H5]. Zastosowanie temperatury 30 ᵒC i czasu 30 minut było wystarczające by przekształcić cztery związki: E1, E2, E3 i EE2 w lotne pochodne. Uzyskane pochodne, podobnie jak w przypadku leków z grupy β-blokerów i β-agonistów charakteryzowały się dobrymi właściwościami chromatograficznymi i spektroskopowymi [H5]. Co istotne, wysokie wartości współczynników RRF wskazywały wyraźnie, że metody analityczne, w których do derywatyzacji zastosowany zostanie DIMETRIS będą cechowały się najwyższą czułością wśród testowanych procedur (rys. 4). 15

Rys. 4. Względne współczynniki odpowiedzi detektora (parametr RRF) wyznaczone dla: natywnych związków estrogennych (native), pochodnych trimetylosililowych (TMS), tert-butylodimetylosililowych (t-bdms) i dimetylotrifluoropropylosililowych (DMTFPS), gdy derywatyzacji podlegały takie same ilości związków (rys. 4 w publikacji [H5]) Uzyskane dane świadczyły ponadto, że DIMETRIS może być niezwykle użytecznym odczynnikiem do konwersji chemicznej niestabilnych termicznie związków estrogennych. W pracy tej wykazano również, że ani DIMETRIS ani MTBSTFA nie powinno się stosować do oznaczania EE2 jak i mieszaniny E1 i EE2, gdyż prowadzą do uzyskania nie w pełni upochodnionej postaci EE2 (pochodnej mono-o-sililowej). W układzie dozownika ulega ona rozkładowi do pochodnej E1, co skutkuje nieprawidłowym odczytem pola powierzchni sygnału zarówno pochodnej EE2 jak i E1 [H5]. Jedynie derywatyzacja za pomocą mieszaniny BSTFA + 1 % TMCS i pirydyny (1:1, v/v) prowadzi do w pełni upochodnionej formy EE2 (pochodnej di-osililowej), która jest trwała w trakcie odparowywania w dozowniku i podczas analizy chromatograficznej [H5]. Umożliwia to wykonanie poprawnych oznaczeń, zarówno E1 jak i EE2, podczas jednej analizy. Niestabilność sililowych pochodnych EE2 była szeroko dyskutowana w literaturze [H5]; powyższe badania pozwoliły wyjaśnić przyczynę tego zjawiska. I.1.3. Kontrola jakości opracowywanych procedur derywatyzacji Jak wspomniano, procedura derywatyzacji jest czaso- i pracochłonna, szczególnie na etapie jej opracowywania. Skala problemu wzrasta gdy zwiększa się liczbę analitów, którą chcemy oznaczać podczas jednego przebiegu chromatograficznego i/lub gdy związki różnią się znacznie budową chemiczną. Z tego powodu metodyk analitycznych przeznaczonych do jednoczesnego wykrywania/oznaczania wielu analitów występujących w ilościach śladowych w próbkach środowiskowych/biologicznych (ang. multi-residue analysis) opierających się na wykorzystaniu techniki GC-MS jest znacznie mniej, niż tych przy użyciu układu LC-MS [2,5,17]. Jednym 16

z najważniejszych powodów są kłopoty z doborem odpowiednich warunków procesu derywatyzacji analitów. W prezentowanych tu badaniach efektywność derywatyzacji i jej użyteczność do określania niskich zawartości analitów oceniano na podstawie wartości parametru RRF [H1-H5]. Im wartość parametru RRF była wyższa tym testowana procedura derywatyzacji lepiej nadawała się do tego typu oznaczeń. W rezultacie otrzymywano zbiory wartości parametru RRF odpowiadające poszczególnym lekom w sprawdzanych warunkach derywatyzacji. Jeśli liczba analitów i/lub zakres testowanych wariantów derywatyzacji rosły zwiększał się zbiór zgromadzonych informacji, a tym samym kłopoty z właściwą ich interpretacją. Jak wiadomo, pomocne w takiej sytuacji są analizy chemometryczne, stąd postanowiono je przeprowadzić. Pierwszy zbiór danych analizie chemometrycznej odpowiadał eksperymentom wykonanym podczas ustalania optymalnych warunków derywatyzacji związków estrogennych [H6]. Obiektem badań było pięć związków: E1, E2, E3, EE2 i DES, do derywatyzacji których postanowiono zastosować sześć różnych odczynników derywatyzujących [H6]. Miarą efektywności przekształcania analitów w ten sam rodzaj pochodnych był parametr RRF, natomiast stosunek pól powierzchni sygnału odpowiadającego w pełni upochodnionej formy leku do sumarycznego pola powierzchni sygnałów wszystkich pochodnych tego leku (częściowo lub pełni zderywatyzowanych) wskazywał na efektywność tworzenia się form całkowicie upochodnionych. Analiza chemometryczna wykonana za pomocą Analizy Głównych Składowych PCA (ang. Principal Component Analysis) miała pomóc w ustaleniu: a) w których warunkach derywatyzacji zachodzi pełna konwersja analitów do postaci pochodnych b) kiedy wydajność derywatyzacji jest najwyższa. W analizie PCA związki estrogenne przyporządkowano do grupy obiektów, podczas gdy dane wskazujące na efektywność tworzenia się form w pełni upochodnionych bądź parametry RRF zaliczono do zmiennych. Wprowadzenie analizy PCA skutkowało tym, że zbiorowi danych odpowiadających jednemu eksperymentowi odpowiadał jeden punkt na wykresie analizy PCA, a nie pięć wartości (osobno dla każdego związku) w danych warunkach eksperymentu (Tabele 1 i 2, rys. 3-5 w publikacji [H6]). Położenie punktu na wykresie PCA było miarą podobieństwa lub różnic w wydajności syntezy odpowiednich pochodnych, co znacznie ułatwiało interpretację danych (przykładowy wykres analizy PCA przestawiono na rys. 5). 17

Rys. 5. Dwuwymiarowy wykres PCA (rys. 3. w publikacji [H6]) uzyskany z analizy danych opisujących wydajność tworzenia dla związków estrogennych form w pełni upochodnionych przy zastosowaniu różnych odczynników derywatyzujących (opis wykonanych eksperymentów zamieszczony jest w Tabeli 1 w publikacji [H6]) W przypadku konwersji chemicznej związków estrogennych przeprowadzone analizy PCA wykazały, że najlepsze efekty uzyskuje się gdy do derywatyzacji zastosowana zostanie mieszanina BSTFA + 1 % TMCS i pirydyny (1:1, v/v) i reakcję wykona się w temperaturze 60 ᵒC przez 30 min, choć użycie mieszaniny MSTFA i pirydyny (1:1, v/v) może być także interesującym rozwiązaniem. Badania udowodniły, że analiza PCA, którą zastosowano po raz pierwszy do optymalizacji warunków derywatyzacji analitów jest doskonałym narzędziem ułatwiającym dokonanie właściwego wyboru [H6]. Z metody PCA skorzystano ponownie, gdy opracowywano optymalne warunki derywatyzacji znacznie szerszej grupy farmaceutyków pochodzących z pięciu różnych klas leków: NLPZ (8 związków), β-blokerów (3 związki), β-agonistów (2 związki) oraz o działaniu estrogennym (5 związków) i przeciwepileptycznym (3 związki) [H7]. Do grupy analitów poddawanych konwersji chemicznej dołączono trzech przedstawicieli leków antydepresyjnych, które nie wymagały derywatyzacji, ale należało sprawdzić ich stabilność podczas tego procesu. Podobnie jak poprzednio efektywność derywatyzacji oceniano na podstawie parametru RRF. Podczas analiz chemometrycznych wartości RRF stanowiły grupę zmiennych; leki grupę obiektów. Do analiz chemometrycznych obok metody PCA po raz pierwszy użyto metody zwanej Analizą Skupień (ang. Cluster Analysis, CA) [H7]. Wyniki analiz chemometrycznych, zarówno metodą PCA jak i CA, wykazały, że derywatyzacja mieszaniny 21 leków pochodzących z pięciu klas farmaceutyków powinna być przeprowadzana za pomocą mieszaniny: BSTFA + 1 % TMCS/pirydyna/octan etylu (2:1:1, v/v/v) w temperaturze 60 ᵒC przez 30 min. Uzyskane wyniki udowodniły, że obydwie metody 18

chemometryczne (PCA i CA) mogą być z powodzeniem stosowane do wizualizacji zbioru danych w celu usprawnienia procesu wyboru optymalnych warunków derywatyzacji analitów [H7]. Podczas prac nad doborem optymalnych warunków derywatyzacji leków z grupy β-blokerów zaobserwowano ciekawe zjawisko - tworzenia się dipodstawionej sililowej pochodnej jednego z leków (pindololu) obecnego w ekstrakcie próbki środowiskowej zamiast formy mono-podstawionej generowanej przy upochodnianiu równoważnej ilości związku pochodzącego z roztworu wzorcowego [H8]. Wskazywało to na katalityczne działanie składników matrycy środowiskowej na tę reakcję, a tym samym na niemożność korzystania z równania krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla tego związku na podstawie analizy serii roztworów wzorcowych w rozpuszczalniku organicznym (metanolu). Jak dotąd, wpływ składników matrycy na wyniki oznaczeń końcowych był opisany głównie dla pomiarów LC-MS/LC-MS/MS (tzw. efekty matrycowe, ang. matrix effects, ME) i to właśnie on sprawił, że zwrócono się ponownie w stronę chromatografii gazowej jako alternatywnej techniki w analityce związków polarnych [5,17]. Aby lepiej zrozumieć mechanizm powstawania efektów matrycowych dokonano przeglądu literaturowego na ten temat i przedstawiono go w formie opracowania w publikacji [H8]. Należy przy tym dodać, że wielkość efektów matrycowych (ME) jest ściśle związana z takimi parametrami jak efektywność ekstrakcji (ang. extraction efficiency, EE) i odzysk bezwzględny (ang. absolute recovery, AR) i wszystkie te parametry służą do oceny jakości proponowanych metodyk analitycznych. Chociaż w ostatnich latach wielu badaczy wyznaczyło wielkości ME, EE i AR dla proponowanych metod to ich porównanie jest kłopotliwe, gdyż stosowali oni różne procedury do ich ustalenia. Ponadto, w literaturze znaleziono tylko kilka prac poświęconych wpływowi składników matrycy (wody wodociągowej czy ścieków) na wyniki oznaczeń za pomocą techniki GC-MS [H8]. Z tych powodów postanowiono: a) opracować jednolitą metodykę wyznaczania efektów matrycowych, efektywności ekstrakcji i odzysku bezwzględnego dla metodyk wykorzystujących chromatografię gazową do oznaczeń końcowych, b) zastosować ją do oceny jakości wyników uzyskiwanych z analiz wodnych próbek środowiskowych o różnym stopniu złożoności za pomocą techniki GC-MS, c) ocenić czy wielkości parametrów ME, EE i AR odpowiadające tym analizom będą niższe/wyższe od dostępnych literaturowo danych dla układu LC-MS. W badaniach tych farmaceutyki reprezentowane były przez sześć leków z grupy β-blokerów i dwa związki z grupy β-agonistów [H8]. Schemat zaproponowanej metodyki wyznaczania efektów matrycowych, efektywności ekstrakcji i odzysku bezwzględnego przedstawiono na rys. 6 [H8]. 19

Rys. 6. Schemat wyznaczania parametrów ME, EE i AR dla metodyk wykorzystujących technikę SPE-GC (rys. 1 w publikacji [H8]) Jak można zauważyć (Rys. 6) procedura ta nie jest skomplikowana i polega na wykonaniu: a) trzech równoległych ekstrakcji: 1) próbki wodnej bez dodatku analitów (D), 2) próbki, do której anality zostały dodane przed etapem ekstrakcji SPE (C), 3) próbki, do której anality zostały dodane po etapie ekstrakcji SPE (B), b) wprowadzeniu do każdego ekstraktu takiej samej ilości wzorca wewnętrznego nieulegającego derywatyzacji (np. 2-metyloantracenu), c) derywatyzacji ekstraktów według opracowanych procedur, d) derywatyzacji równoważnej ilości leków pochodzących z roztworu wzorcowego (A), e) analizie powyższych próbek za pomocą techniki GC-MS, f) wykonaniu prostych obliczeń matematycznych (Rys. 6), przy czym odpowiedź detektora dla analitu można podawać jako pole powierzchni sygnału chromatograficznego jego pochodnej lub jako stosunek pola powierzchni sygnału pochodnej analitu do pola powierzchni sygnału wzorca wewnętrznego. W toku badań wyjaśniono i scharakteryzowano mechanizm powstawania efektów matrycowych obecnych podczas oznaczeń polarnych analitów z wykorzystaniem techniki SPE-GC-MS [H8]. Wpływ składników matrycy na etap ekstrakcji obserwowano poprzez zmniejszenie wielkości parametru EE leków izolowanych z próbek środowiskowych. Efekty matrycowe rzutowały też na jakość rozdzieleń chromatograficznych. Obserwowano zmiany kształtu 20