Analiza ekstraktów roślinnych metodą chromatografii cienkowarstwowej. mgr inż. Paweł Szczeblewski Światło i jego barwa. Wrażenie barwy jest wynikiem zespołu zmian fizjologicznych wynikających z przekazywania impulsów nerwowych wywołanych działaniem określonego promieniowania elektromagnetycznego na siatkówkę oka z zakresu 400-800nm. Zrównoważona mieszanina fal (fotonów) światła o długości fali od 400 do 800 nm i częstości drgao od 0,75x10 15-3,75x10 14 Hz wywołuje wrażenie barwy białej (światło białe np. słoneczne, lampy kwarcowej czy żarówki elektrycznej). Poprzez rozszczepienie takiej wiązki światła (np. w pryzmacie) możemy uzyskad wiązki promieniowania o wąskim zakresie długości fal, czyli światło monochromatyczne. Właściwością oka ludzkiego jest zdolnośd do rozróżniania poszczególnych rodzajów światła monochromatycznego i przypisywania im konkretnych barw: fioletowej, niebieskiej, zielonej, żółtej, czerwonej i purpurowej (tabela 1). Światło o pośrednich długościach fal ma barwę pośrednią, np. wiązka o długości fali 500 nm powoduje wrażenie barwy niebieskozielonej, o długości 560 nm - barwy żółtozielonej itp. Długośd fali światła monochromatycznego absorbowanego [nm] Barwa dopełniająca (obserwowana) Barwa światła absorbowanego 400 zielonożółta fioletowa 460 żółta niebieska 520 purpurowa zielona 580 niebieska żółta 640 niebieskozielona czerwona 720 zielona purpurowa Tabela 1. Długośd fali a barwa światła. Barwa poszczególnych substancji wynika z ich odziaływania ze światłem białym. Substancje chemiczne przepuszczają to światło, pochłaniają je lub odbijają. Jeżeli cała wiązka światła widzialnego zostaje przepuszczona substancja daje wrażenie przezroczystej, gdy wiązka zostaje odbita przez związek chemiczny odnosimy wrażenie barwy białej, jeśli zaś całkowicie zaabsorbowana wzrok nasz odbierze ją jako czarną. Najczęściej jednak spotykamy się ze zjawiskiem częściowej wybiórczej absorpcji pewnych zakresów promieniowania, co powoduje, że do oka dociera mieszanina fal przepuszczonych lub odbitych o wywołując wrażenie barwy. Nasze zmysły odbierają wrażenie barwy dopełniającej, czyli wiązki niepochłoniętej z zakresu widma widzialnego. Barwy dopełniające dla odp. długości fal światła zaabsorbowanego przedstawiono w tabeli 1. Przykładowo, przepuszczając promieo światła białego przez substancję, która pochłania prawie całe światło niebieskie (o dł. fal 480 +/- 30 nm) będziemy obserwowad barwę żółtą, gdyż barwa żółta jest barwą dopełniającą w stosunku do niebieskiej. Taką barwę możemy nazwad również "resztkową", ponieważ powstaje w wyniku odjęcia światła niebieskiego od wiązki światła białego. O złożonej fizjologii procesu widzenia barw świadczy fakt, że wrażenie barwy żółtej można wywoład zarówno przez zaadsorbowanie światła niebieskiego,
którego centrum odpowiada fali o dł. 480 nm, z światła białego o widmie ciągłym, jak i za pomocą światła o jednej długości fali, tzn. 580 nm. Ponadto, wrażenie barwy żółtej można wywoład poprzez zmieszanie światła czerwonego i zielonego. Znajomośd sposobu powstawania barwy jest istotna, ponieważ pozwala przewidywad barwę związku chemicznego o określonym widmie UV-Vis w zakresie światła widzialnego. Struktura związku a jego barwa. Z chemicznego punktu widzenia ważne jest ustalenie zależności pomiędzy budową cząsteczki organicznej a jej zdolnością do absorbowania określonego promieniowania widzialnego, co jest warunkiem wystąpienia barwy substancji absorbującej. Warunkiem barwności związku jest obecnośd ugrupowania atomowego, zwanego grupą chromoforową (gr. chróma- kolor + gr. phorós- niosący). Podstawowe chromofory to ugrupowania wiązao nienasyconych, w tym aromatycznych zawierających elektrony typu π (rys poniżej). Pod wpływem promieniowania świetlnego (fotonów) następuje wzbudzenie cząsteczki, posiadającej takie ugrupowanie, które polega na przeniesieniu elektronu wiązania π z orbitalu wiążącego na antywiążący (ze stanu podstawowego do jednego ze stanów wzbudzonych). Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej struktury elektronowej cząsteczki. Obecnośd w cząsteczce zw. organicznego jednej silnej grupy chromoforowej związanej z pierścieniem aromatycznym jest wystarczająca, aby wywoład barwę związku. Pojedyncze słabe chromofory wprawdzie powodują przesunięcie maksimum absorpcji związku z dalekiego nadfioletu (100-200nm) w kierunku widzialnej granicy światła (400nm), ale nie są w stanie wywoład jego barwy. Warunkiem pojawienia się barwy jest występowanie kilku takich ugrupowao sprzężonych lub skumulowanych ze sobą. Przedstawicielami połączeo organicznych tego typu są m.in występujące w komórkach roślinnych naftochinony, z charakterystycznym układem chinoidowym.
Barwniki roślinne i ich identyfikacja na podstawie barwy. Barwniki roślinne są niezwykle istotne dla prawidłowego funkcjonowania roślin. Chlorofile i karotenoidy uczestniczą w procesach fotosyntezy, flawonoidy biorą udział w procesach oksydoredukcyjnych i wykazują właściwości owado- i grzybobójcze, jeszcze inne pełnią funkcję ekologiczną (atraktanty). Związki te występują w komórkach roślinnych najczęściej w postaci związanej z cukrami (glikozydy), rzadziej z białkami. Barwniki rozpuszczalne w wodzie (antocyjany, betalainy) znajdują się w cytozolu, natomiast te o charakterze hydrofobowym występują w plastydach: chlorofil w chloroplastach, a karotenoidy w chromoplastach. Barwniki roślinne stanowią niejednolitą grupę związków pod względem budowy chemicznej. W zależności od ich struktury wyróżnia się: Chlorofile- oparte na bazie heterocyklicznych pierścieni pięcioczłonowych. Karotenoidy (karoteny, ksantofile) 40-węglowe terpenoidy. β-karoten Flawonoidy oparte na szkielecie 2-fenylochromonu. Pelargonidyna
Chinony zawierające układ chinoidowy. Nośnikiem barwy w cząsteczkach barwników roślinnych jest zawsze sprzężony układ wielu wiązao podwójnych najczęściej współdziałających z elektronami układów aromatycznych. Jednym z bardziej znanych barwników roślinnych jest przedstawiony powyżej β-karoten (czerwony barwnik marchwi i pomidora). Jest to związek z rodziny węglowodorów izoprenoidowych, w którego cząsteczce występuje 11 sprzężonych ze sobą wiązao podwójnych. W oparciu o strukturę, widmo absorpcyjne i znajomośd barw dopełniających możemy przewidzied jego barwę: Juglon Widmo absorpcyjne karotenoidów i chlorofili Na powyższym widmie zauważamy, że β-karoten absorbuje światło widzialne w zakresie 430-550 nm, co oznacza, że przepuszcza bądź odbija on wiązkę światła białego pozbawioną fal z tego zakresu, czyli pozbawionej światła fioletowo-niebiesko-zielonego. Do oka obserwatora dochodzi więc mieszanina fal, które nie zostały zaabsorbowane przez β-karoten. Obserwator odnosi wrażenie barwy czerwonej, która jest barwą dopełniającą dla światła o barwie fioletowo-niebiesko-zielonej. Instrukcja do dwiczeo: Otrzymywanie (ekstrakcja) barwników roślinnych: 1. Przygotowad ekstrakty z następujących materiałów roślinnych: świeża nad pietruszki, liście mleczu, świerk oraz przechowywane przez tydzieo igły świerku (temp. pokojowa, dostęp światła). W tym celu: Rozetrzed w moździerzu 1 g tkanki roślinnej w 3 ml acetonu schłodzonego do temp ~0 C. Zawiesinę acetonową
pozostawid na 2 minuty i ostrożnie zdekantowad do probówki osłoniętej folią aluminiową i przechowywad w chłodnym miejscu. Otrzymane w ten sposób ekstrakty analizowad za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Chromatograficzny rozdział barwników: 1. Przygotowad eluenty o następującym składzie objętościowym: a) heksan b) heksan: octan etylu 1,5:0,5 (v/v) c) heksan: octan etylu 2: 1,5 (v/v) i wypełnid nimi komory chromatograficzne na wysokośd ok 1 cm od dna. Pozostawid do ustalenia się warunków w komorach. 2. Przygotowad 3 płytki o szerokości około 5 cm i długości 7 cm. W odległości około 1,5 cm od dołu delikatnie zaznaczyd ołówkiem linię startu, na którą nanosid przy pomocy koocówki kapilarnej przygotowane ekstrakty roślinne, w kolejności: nad pietruszki, mlecz, świerk, świerk tygodniowy. Po nałożeniu całej objętości odczekad chwilę aż miejsce nakładania podeschnie, po czym nałożyd w to samo miejsce kolejną porcję barwnika. Czynnośd powtórzyd 3-razy. Pozostawid płytkę do wyschnięcia na około 5 minut. Wysuszoną płytkę wstawid pionowo do komory chromatograficznej wypełnionej eluentem (przygotowanym w punkcie 2). Ilośd eluentu powinna sięgad poniżej poziomu naniesionych ekstraktów barwników (<1,5 cm 3 ). Przykryd naczynie. Rozdział chromatograficzny prowadzid aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika znajdzie się 1-2 cm przed górną krawędzią płytki. Uwaga: Nie należy pobrudzid, ani uszkodzid płytki; płytkę należy trzymad pincetą tylko za jej krawędź. Nakładad kolejne objętości kapilary tak, by tworzący się na płytce ślad miał średnicę nie większą niż 5 mm. 3. Płytkę wyjąd z komory, pozostawid do wyschnięcia i zarejestrowad obraz chromatograficzny (za pomocą aparatu). Obliczyd współczynniki podziału Rf dla każdej z substancji obecnej na chromatogramie. Sprawozdanie powinno zawierad: 1. Cel dwiczenia, 2. Wyniki analiz (chromatogramy) z wyliczonymi dla każdej substancji wartościami Rf. 3. W oparciu o barwę plam na chromatogramie zaproponowad widmo UV-Vis porównując z tymi, które przedstawiono na rysunku. Uwzględniając powyższą charakterystykę UV-Vis określid ruchliwośd poszczególnych barwników na chromatogramie i podjąd próbę ich identyfikacji. 4. Dokonad analizy jakościowej i półilościowej poszczególnych ekstraktów. 5. Porównad zastosowane eluenty i ocenid ich przydatnośd w prowadzonej analizie. Zagadnienia na kartkówkę: - materiał z części teoretycznej dwiczeo, - chromatografia cienkowarstwowa TLC.