Rzeszów, 02-06-2014 Krzysztof Kaczmarski Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej Wydział Chemiczny, Politechnika Rzeszowska Recenzja pracy doktorskiej mgr. inż. Wojciecha Marka zatytułowanej "Rozdział białek za pomocą łączonych technik chromatograficznych" Przedstawiona mi do recenzji praca doktorska mgr. inż. Wojciecha Marka została wykonana pod kierunkiem dr. hab. inż. Wojciecha Piątkowskiego, profesora Politechniki Rzeszowskiej. Autor przedstawił w niej wyniki badań nad: (i) mechanizmami adsorpcji testowej mieszaniny białek w chromatografii HIC (Hydrophobic Interaction Chromatography) oraz IEC (Ion Exchange Chromatography) jako pojedynczych procesów. Analizowany był również efekt szeregowego połączenia wyżej wymienionych technik chromatograficznych na wydajność procesu wydzielenia i oczyszczenia białek, (ii) warunkami wydzielania i oczyszczania przeciwciała monoklonalnego z mieszaniny stosowanej w przemyśle za pomocą sekwencji różnych technik chromatograficznych oraz/lub połączenia ekstrakcji w wodnych układach dwufazowych i chromatografii. Zakres pracy jaki wykonał doktorat był szeroki i obejmował: w ramach punktu (i): przegląd literaturowy z zakresu przewidywanych badań, badania adsorpcji białek modelowych (immunoglobuliny G, owoalbuminy oraz cytochromu C) w zależności od stężenia soli w fazie ruchomej, ph tej fazy oraz temperatury, badania nad maksymalizacją selektywności rozdzielania mieszaniny w/w białek, opracowanie modeli dynamiki poszczególnych procesów chromatograficznych oraz ich walidację, symulacje procesu oczyszczania białka kluczowego z modelowej mieszaniny białek w zintegrowanym procesie chromatografii jonowymiennej i hydrofobowej dla różnych warunków prowadzenia procesu, badania ekstrakcji białek w wodnych układach dwufazowych z wyznaczeniem równowagi fazowej, optymalnego zakresu składu faz oraz współczynników podziału, badania wpływu substancji obecnych w układach ekstrakcyjnych na adsorpcję białek w chromatografii hydrofobowej. w ramach punktu (ii): wydzielanie i oczyszczanie przeciwciała monoklonalnego z mieszaniny pochodzącej z komórek jajnika chomika chińskiego CHO) za pomocą zintegrowanych, dwóch technik chromatograficznych: chromatografii jonowymiennej i hydrofobowej, oraz/lub w połączonym procesie ekstrakcji i chromatografii, optymalizację procesu izolacji przeciwciała monoklonalnego z mieszaniny CHO w zintegrowanym procesie IEC/HIC z wykorzystaniem opracowanego modelu dynamiki procesu chromatografii.
Tekst pracy jest zawarty na 179 stronach, w ośmiu rozdziałach i ma klasyczny układ: wstęp, część teoretyczna, część doświadczalna, wyniki i dyskusja. Autor dokonał rzetelnego przeglądu literatury cytując 156 pozycji. Omówienie poszczególnych rozdziałów pracy Każdy rozdział części pracy "wyniki i dyskusja" kończy się krótkim podsumowaniem, ułatwiającym zrozumienie jakie badania wykonano, jakie napotkano problemy i jak je rozwiązano. Na końcu rozprawy doktorskiej zamieszczono podsumowanie wyników całej pracy. Ponadto, dodano załącznik ze słowniczkiem ważniejszych parametrów opisujących proces chromatograficzny. Rozprawa doktorska rozpoczęta jest wstępem, w którym można znaleźć uzasadnienie dla podjętych celów badawczych. Omówiono również treści poszczególnych rozdziałów. W rozdziale drugim przedstawiono aktualny stan wiedzy na temat technik separacji białek, a w szczególności użytej w pracy chromatografii jonowymiennej, chromatografii oddziaływań hydrofobowych, a także ekstrakcji w układzie dwóch faz wodnych. Mniej zaawansowany czytelnik może znaleźć w tym rozdziale informacje podstawowe na temat rozdziału metodami chromatograficznymi. Dalsze, podstawowe informacje o parametrach opisujących proces chromatograficzny można znaleźć w Załączniku A. W rozdziale tym omówiono również model dynamiki kolumny chromatograficznej, uwzględniający zmiany konformacji białka w trakcie adsorpcji na złożu chromatograficznym. Model ten był dalej użyty do analiz pracy kolumny chromatograficznej. W rozdziale trzecim omówiono aparaturę badawczą, scharakteryzowano dobór białek (Cytochrom C (CYC) z krwi końskiej, Owoalbumina (OVA) z jaja kurzego, Immunoglobulina G (IgG) z krwi bydlęcej, Lizozym (LYZ) z białka jaja kurzego, supernatant z komórek jajnika chomika chińskiego CHO) dla stworzenia mieszanin, używanych dalej w badaniach efektywności separacji różnymi metodami chromatograficznymi, ekstrakcyjnymi i kombinacjami tych metod. Podano także metody wyznaczenia parametrów niezbędnych do modelowania matematycznego procesów rozdziału. Opisano także metodę numeryczną rozwiązania modelu różniczkowego kolumny chromatograficznej. W następnych rozdziałach przedstawiono i przedyskutowano osiągnięte wyniki. I tak w rozdziale czwartym analizowano adsorpcję białek z mieszaniny testowej, zawierającej cytochrom C (CYC), owoalbuminę (OVA) oraz immunoglobulinę G (IgG). Analizy dotyczyły rozdziału w chromatografii HIC oraz IEC. Na bazie wyników uzyskanych w obydwóch rodzajach chromatografii zaproponowano metodę separacji IgG w zintegrowanym systemie obu metod chromatograficznych. Prowadzenie szeregowe procesu rozdziału wymagało też modyfikacji metody dozowania próbki. Ponadto, na bazie zaproponowanego modelu dynamiki procesu dokonano optymalizacji procesu oczyszczania wybranego produktu kluczowego z mieszaniny trzech białek modelowych. Okazało się, że najlepszym wariantem procesu izolacji jest zastosowanie w I etapie IEC z jednokrotną iniekcją próbki zaś w II etapie HIC z wielokrotną iniekcją próbki do kolumny.
W rozdziale piątym badano możliwości zastosowania ekstrakcji w systemie dwóch faz wodnych (ATPE) połączonych z procesem chromatografii hydrofobowej w rozdziale białek. Sprawność rozdziału badano dla testowej mieszaniny białek, w której w skład wchodziły następujące białka: immunoglobulina G (IgG), owoalbumina (OVA) oraz lizozym (LYZ). Składnikiem kluczowym był pierwszy z wymienionych związków. Przedstawiono również szczegółową analizę badanych układów oraz omówiono warunki integracji ATPE oraz HIC. Zdobyte doświadczenie w badaniach nad separacją modelowych mieszanin białek posłużyło do opracowania techniki wydzielania i oczyszczania ludzkiej immunoglobuliny G (IgG1) z supernatantu z komórek jajnika chomika chińskiego. Badania wykonano z wykorzystaniem zintegrowanego procesu chromatografii jonowymiennej i hydrofobowej, a także procesu połączonej szeregowo ekstrakcji ATPE i chromatografii HIC. Najskuteczniejszą metodą separacji okazało się szeregowe połączenie chromatografii IEC z HIC. Wyniki tych badań przedstawiono w rozdziale szóstym. W rozdziale siódmym opisano próbę optymalizacji procesu izolacji przeciwciała monoklonalnego z mieszaniny CHO za pomocą połączonych procesów chromatografii IEC i HIC. Optymalizację wykonano przy użyciu zaproponowanego modelu matematycznego procesu chromatografii. Ponadto, model matematyczny ułatwił analizę wpływu różnych czynników na skuteczność separacji, np.: stężenia soli, wartości ph, model gradientu soli i wielu innych. Odnośnie przedstawionych prac badawczych nie mam żadnych poważnych zastrzeżeń co do sposobu prowadzenia badań czy też opracowania wyników. Zakres materiału przedstawionego w rozprawie wystarczyłby na dwie prace doktorskie, a o jakości badań świadczy fakt, że zostały one opublikowane w najlepszym czasopiśmie chromatograficznym - Journal of Chromatography A, w pięciu artykułach. W trzech z nich doktorant jest pierwszym autorem. Wysoka jakość badań nie przedkłada się niestety na staranne przygotowanie tekstu rozprawy. Poniżej przytaczam niefortunne, według mnie, sformułowania i niejasności. Zdania wzięte w cudzysłów są cytatami z pracy doktorskiej, słowa podkreślone dotyczą wzmiankowanych niejasności. str. 19 "Rozdzielenie substancji o podobnym powinowactwie do fazy stacjonarnej wymaga modyfikacji trybu prowadzenia procesu polegającej np. na zmianie składu fazy ruchomej w czasie (chromatografia z gradientem eluentu) czy też zastosowania gradientu temperatury." Nie słyszałem o chromatografii z gradientem eluentu ale słyszałem o chromatografii z gradientem składu eluentu. str. 20 "...przemieszczanie się frontów stężenia wzdłuż kolumny w warunkach idealnej adsorpcji..." Brak wyjaśnienia co to jest idealna adsorpcja. str. 25 "...ze wzrostem siły wiązania białka pojawiają się często problemy z jego wymyciem, co wymusza stosowanie silnych eluentów..." Sformułowanie "silnych eluentów" nie jest najszczęśliwsze, str. 31 "Proces chromatograficzny rozpoczyna się wprowadzeniem mieszaniny do kolumny wypełnioną buforem adsorbującym np. o wysokim ph." Co to jest bufor adsorbujący?
str. 31 "Modele dynamiki są syntezą informacji zaczerpniętych głównie z fizykochemii, termodynamiki, dynamiki płynów oraz nauki o transporcie pędu, ciepła i masy." Czym różni się dynamika płynów od nauki o transporcie pędu? str. 37 Autor wyszczególnia założenia dla izotermy Langmuira pisząc: "rozdzielane substancje nie konkurują ze sobą o miejsca aktywne" W następnym zdaniu czytamy. "Przy zachowaniu powyższych warunków ogólne równanie izotermy dla mieszaniny wieloskładnikowej (tzw. konkurencyjna izoterma Langmuira) przyjmuje postać..." Czy zatem izoterma langmuirowska uwzględnia, czy nie uwzględnia konkurencyjności o miejsca aktywne? str. 39 "Następnie wyznacza się czas retencji krzywej wyjścia odpowiadający równowagowemu stężeniu substancji w fazie zaadsorbowanej i jednocześnie jej stężeniu wlotowemu." Obawiam się, że osoba spoza branży chromatografistów nie zrozumie o co chodzi. str. 39 "Metoda dopasowania do piku polega na przeprowadzeniu serii izokratycznych eksperymentów chromatograficznych." Nie muszą to być warunki izokratyczne. str. 39 "Następnie parametry wybranej izotermy adsorpcji wbudowuje się do modelu dynamiki procesu..." Parametry się wyznacza a model izotermy łączy z modelem dynamiki. str. 51 "Gdy jest to możliwe stosuje się modele matematyczne oraz komputerowe obliczenia w celu wyznaczenia wartości parametrów procesu w szybkim czasie i ustalenia warunków dla efektywnego rozdzielania molekuł docelowych." Co to jest "szybki czas"? str. 51 "wysokie ceny złóż chromatograficznych" Co to jest złoże chromatograficzne? str. 64 równanie 3.4 - jest k, powinno być kal - patrz rów. 3.3 str. 71 "...wszystkie sole węglanów lub wodorowęglanów zostają przekształcone do CO 2..." To zdanie nie jest zręcznie sformułowane. str. 80 - równania 4.2, 4.3 i 4.4 - zapis równań nie jest jasny. Parametr "z" może być funkcją lub może oznaczać trzy parametry w równaniu (4.2). Takie podejście nie ułatwia zrozumienia modelu. str. 89 "Właściwy dobór niewielkich objętości dozowanej próbki pozwolił na zachowanie warunków adsorpcyjnych białka kluczowego (IgG) i uniknięcie strat jego
masy na początku procesu w etapie dozowania próbki (rys. 4.6a), w którym OVA, dzięki słabszej adsorpcji, była wymywana razem z rozpuszczalnikiem próbki (rys. 4.6b)." Czy nie lepiej byłoby utworzyć z tego testu dwa zdania? str. 92 - nie zdefiniowano parametru c z kreską rys. 6.8 Brak opisu poszczególnych linii i pików. rys. 6.12 nie ma go - czy chodzi o rys. 6.13? Str. 137 "Obecność niezidentyfikowanych zanieczyszczeń w oczyszczanym supernatancie CHO utrudniała wyznaczenie parametrów modelu składnika kluczowego. Zaproponowano skróconą metodę ich wyznaczenia. Polegała ona na bezpośredniej elucji badanej mieszaniny w celu oszacowania własności adsorpcyjnych zawartych w niej wszystkich białek." Ostatnie zdanie jest niezrozumiałe. str. 137 "Pełne zaprojektowanie procesu prowadzonego w optymalnych warunkach wymaga zastosowania modelowania matematycznego oraz optymalizacji. W tym celu do opisu dynamiki obu procesów IEC i HIC zastosowano model opracowany na podstawie wcześniejszych badań dla mieszaniny białek (IgG, OVA, CYC) opisanych w rozdz. 4. " Powinny być podane numery równań. Czytelnik nie powinien się domyślać, o które równania chodzi i co konkretnie optymalizowano. Str. 146 "Wstępne symulacje z użyciem modelu wskazywały na silny wpływ czasu trwania etapu adsorpcji na skuteczność desorpcji białka, co mogło być powiązane z wolną kinetyką procesu." O który proces chodzi: adsorpcji czy konformacji? str. 146 "Dla krótszego czasu trwania etapu adsorpcji obserwowano desorpcję większej masy białka, co również zostało odzwierciedlone w symulacjach modelu z możliwą do zaakceptowania dokładnością." Czy nie jest to związane z wolną zmianą konformacji? Doktorant podał metodę rozwiązania modelu różniczkowego kolumny chromatograficznej, ale nie podał, choćby z nazwy metody optymalizacji - dlaczego? str. 156: "W warunkach silnej adsorpcji stężenie białka w fazie ruchomej spada bardzo szybko zaraz po wprowadzeniu mieszaniny do kolumny. W procesie HIC (zob. rys. 7.10b) stężenie białka po wprowadzeniu do kolumny ulega 200-krotnemu zmniejszeniu w porównaniu z wprowadzaną frakcją (o stężeniu 2 g/l)." - nie widać tego zjawiska - stężenie piku przekracza 2 g/l.
Rys. 7.10. "Chromatogramy odnoszące się do optymalnych warunków procesu HIC zintegrowanego z IEC: a) symulacje profili dla metody rozcieńczania w kolumnie (linia ciągła) i przed kolumną (linia przerywana), b) profil rozcieńczania rozdzielanej mieszaniny w kolumnie symulowany w odległości 0,2 długości kolumny od jej wlotu." Która to linia i który to wykres - główny czy wklejony? W tekście rozprawy nie brakuje też tak zwanych literówek, np.: str.19 "siała adsorpcji składników" str. 31 "Proces chromatograficzny rozpoczyna się wprowadzeniem mieszaniny do kolumny wypełnioną buforem adsorbującym np. o wysokim ph." str. 31 "Jest to technika bardzo wygodna, gdyż zapewnia otrzymanie wymaganej czystości, wydajności i aktywności produktu stawianych w przemyśle biofarmaceutycznym." str. 37 "Aby zoptymalizować warunków prowadzenia procesu" str. 98 wielokrotną iniekcji próbki str. 143 Stan D odnosił się do etapu desorpcji białka, w którym zmiana fazy ruchomej na bufor elucyjnym pozwalała na elucję białka z kolumny. str. 146 "W celu zweryfikowania skuteczności modelu zbadano również wpływ czasu trwania procesu na wynik elucji chromatograficzne" str. 152 "Konsekwencją była uzyskanie silniejszej adsorpcji białka" str. 155 "Optymalizowano te same parametry jak w procesie IEC dla obu metody rozcieńczania." Spis symboli, skrótów i jednostek - CYC - brak skrótu Załącznik A Świetnym pomysłem było zamieszczenie w pracy załącznika z wyjaśnieniami terminologii stosowanej w chromatografii, co jest cenne dla tych, których interesują wyniki tej pracy ale nie są oni specjalistami z chromatografii. Odnośnie tej części pracy mam dwa pytania. str. 160 - "W przypadku założenia braku ruchu cieczy zawartej w porach ziaren adsorbentu zależność (A.2a) przyjmuje postać: w'=u/epse". Czy autor sugeruje, że równanie A.2a (w=u/epst) słuszne jest o ile eluent płynie wewnątrz porów adsorbentu?! str. 161 "Dla mniejszej średnicy ziaren upakowanie wypełnienia w kolumnie jest znacznie lepsze a jego powierzchnia właściwa większa." W jakim sensie lepsze jest upakowanie wypełnienia? Kolejne uwagi. str. 161 "Czas t0 można przedstawić również jako objętość martwą kolumny V0 " Czas nie ma wymiaru objętości więc nie można go przedstawić jako objętość martwą kolumny. Można go natomiast wyznaczyć znając objętość martwą kolumny.
str. 161 "stała równowagi procesu adsorpcji dla izotermy liniowej nazywana również stałą Henry ego H, gdy stężenie substancji zaadsorbowanej na złożu, qi*, jest znacznie mniejsze od pojemności chłonnej złoża: qi* «q." Styl zdania. str. 162 "porowatość wewnętrzna epsp, określająca stosunek objętości zawartej w porach ziaren adsorbentu Vpore do objętości fazy stacjonarnej Vads, która składa się z objętości porów i objętości ciała stałego w ziarnach adsorbentu Vsolid," Styl zdania. str. 162 "dyfuzja zewnętrzna charakteryzowanych przez współczynnik zewnętrznego transportu masy kext," Czy nie prościej byłoby napisać - współczynnik wnikania masy? str. 165 - "kinetyka procesu adsorpcji-desorpcji reprezentowana przez stałą szybkości adsorpcji (k +1 ) oraz stałą równowagi tego procesu (H)." Zachodzi związek:. "Prawdziwą" stałą równowagi jest K. str. 165 "Biorąc pod uwagę powyższe zjawiska ogólną zależność opisującą wysokość równoważną półce teoretycznej można przedstawić jako [154]". Czy na pewno chodzi o odnośnik [154]? str. 165 "Przy braku adsorpcji współczynnik retencji k (A.3) ma wartość bardzo niską." Nieprawda, jest równy zeru. Podsumowanie Ocena strony formalnej pracy nie może przeważyć nad jej merytoryczną oceną. Uważam, że praca doktorska mgr. inż. Wojciecha Marka spełnia ustawowe i zwyczajowe wymogi. Wnosi ona ważny wkład w rozwój metod rozdziału białek. Wnoszę więc do Rady Wydziału Chemicznego Politechniki Rzeszowskiej o przyjęcie pracy i dopuszczenie mgr. inż. Wojciecha Marka do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Biorąc pod uwagę wysoką jakość wykonanych badań, potwierdzoną pięcioma publikacjami w czasopiśmie Journal of Chromatography (impact factor czasopisma równy 4.58) wnoszę o wyróżnienie tego doktoratu. Krzysztof Kaczmarski