PLATELIA TM VZV IgG 48 testów 72684 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY Polski 1/9
1. ZASTOSOWANIE SPIS TREŚCI 2. ZNACZENIE KLINICZNE 3. ZASADA TESTU 4. SKŁAD ZESTAWU 5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW 6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA 7. PRÓBKI 8. PROCEDURA 9. SCHEMAT PROCEDURY TESTU 10. WALIDACJA TESTU 11. INTERPRETACJA WYNIKÓW 12. OGRANICZENIA METODY 13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA 14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA 15. PRECYZJA 16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY 17. LITERATURA Polski 2/9
1. ZASTOSOWANIE TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgG PRZECIWKO WIRUSOWI VARICELLA-ZOSTER W LUDZKIEJ SUROWICY 2. ZNACZENIE KLINICZNE Wirus ospy wietrznej-półpaśca (VZV) jest czynnikiem etiologicznym ospy wietrznej (varicella) i półpaśca (zoster). Wirus należy do rodziny herpeswirusów. Zakażenie przenosi się przez kontakt bezpośredni. Ospa wietrzna jest wysoce zakaźną chorobą wieku dziecięcego, będącą wynikiem zakażenia pierwotnego wirusem VZV. Zakażenie kobiety w ciąży może spowodować wady rozwojowe u dziecka; jeśli występuje w końcowym okresie ciąży, może prowadzić do śmierci noworodka. Półpasiec najczęściej występuje u dorosłych i jest wynikiem reaktywacji wirusa, pozostającego w stanie latencji w zwojach czuciowych osób, które przebyły ospę wietrzną. Objawem jest bardzo bolesna wysypka pęcherzykowa, występująca wzdłuż przebiegu zajętych nerwów. Metody serologiczne pozwalają określić stopień uodpornienia i podatność na zakażenie (zwłaszcza pacjentów podlegających immunosupresji) oraz umożliwiają pre- i postnatalną diagnostykę zakażeń wewnątrzmacicznych. 3. ZASADA TESTU Test PLATELIA TM VZV IgG jest oparty na immunoenzymatycznej technice ELISA. Częściowo oczyszczony i zinaktywowany antygen wirusa VZV jest związany z fazą stałą (paski po 8 studzienek). Podczas inkubacji z rozcieńczoną ludzką surowicą, z antygenem wiążą się swoiste immunoglobuliny. Po inkubacji, nie swoiste immunoglobuliny i białka surowicy zostają usunięte podczas płukania. Następnie dodawany jest koniugat, zawierający przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkim IgG, znakowane peroksydazą. Nadmiar koniugatu jest usuwany podczas płukania. Wykrycie kompleksu immunologicznego następuje przez dodanie roztworu substratu dla peroksydazy / chromogenu, wywołującego reakcję barwną. Natężenie niebieskiej barwy jest proporcjonalne do stężenia swoistych przeciwciał w badane próbce. Po zatrzymaniu reakcji enzymatycznej przez dodanie roztworu kwasu siarkowego, barwa studzienek zmienia się na żółtą. Gęstość optyczną odczytuje się spektrofotometrycznie. Uzyskana wartość OD jest proporcjonalna do ilości przeciwciał IgG anty-vzv. 4. SKŁAD ZESTAWU Odczynniki wystarczają na 48 oznaczeń. Przed użyciem przenieść odczynniki do temperatury pokojowej. MT PLATE Mikropłytka (gotowa do użycia) 3 x 2 paski po 8 studzienek opłaszczonych wirusem Varicella-Zoster. Użycie: Opakowanie otworzyć po przeciwnej stronie niż kod (ZG + nr serii), potrzebny do identyfikacji płytki, i wyjąć potrzebną ilość pasków. Pozostałe paski zamknąć szczelnie w oryginalnej torebce z pochłaniaczem wilgoci, usuwając powietrze przed zamknięciem. CONJ Koniugat (gotowy do użycia) 1 x 10 ml Przeciwciała monoklonalne anty-igg, znakowane peroksydazą chrzanową, w buforze fosforanowym + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox. CONTROL+ Kontrola dodatnia (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-vzv, rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu. Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał. CONTROL CUT-OFF Kontrola dodatnia cut-off (gotowa do użycia) 1 x 2.0 ml Zawartość: Ludzka surowica, zawierająca przeciwciała IgG anty-vzv, rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu. Barwa: proporcjonalna do względnego miana przeciwciał Polski 3/9
CONTROL IgG- WASH BUF 10x SAMP DIL 50x Kontrola ujemna (PF93910) (gotowa do użycia) 1 x 1.6 ml WYMIENNA POMIĘDZY SERIAMI Zawartość: Ludzka surowica nie zawierająca przeciwciał IgG anty-vzv, rozcieńczona w 0.01 M buforze fosforanowym + 1% BSA + 0.09% azydek sodu. Bufor do płukania (10 x stężony) (PF93603) 1 x 100 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI Skład: Sól zbuforowana fosforanem + 0.5% Brij Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:10 wodą destylowaną. W przypadku krystalizacji, przed rozcieńczeniem rozpuścić osad w temp. 37 C. Rozcieńczalnik próbek (PF93601) (stężony 50x) 1 x 4.5 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI Zawartość: Roztwór białek + 0.05% fenol i 0.02% Bronidox. Przygotowanie: Rozcieńczyć potrzebną ilość w stosunku 1:50 buforem do płukania. SUBS TMB Substrat (PF93619) (gotowy do użycia) 12 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI Zawartość: Czterometylobenzydyna (0.26mg/ml) i 0.01% nadtlenek wodoru, stabilizowana w 0.05 M buforze cytrynianowym (ph 3.8). H 2 SO 4 0.3 M Roztwór zatrzymujący (PF93602) (gotowy do użycia) 1 x 16 ml WYMIENNY POMIĘDZY SERIAMI 0.3 M kwas siarkowy Folia adhezyjna (2) Torebka polietylenowa (1) INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Cieplarka na 37 C Czytnik mikropłytek (długość fali 450 lub 450/620 nm; odczyt liniowy co najmniej do OD = 2000). Płuczka mikropłytek, pobierająca objętość 225-375 µl. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana Szkło laboratoryjne: cylindry miarowe, próbówki, itp. Pipety pobierające 10 µl, 100 µl i 1000 µl. Pojemnik na materiał zakaźny i zanieczyszczone odpady 5% Podchloryn sodu (wybielacz) Rękawiczki jednorazowe Timer Bibuła 5. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ ODCZYNNIKÓW Odczynniki należy przechowywać w temp. 2-8 C. Data ważności jest wydrukowana na każdym odczynniku i na opakowaniu zewnętrznym. Po otwarciu odczynniki mają określona trwałość: ODCZYNNIK Mikropłytka Surowice wzorcowe Koniugat Substrat Rozcieńczalnik próbek Bufor do płukania WARUNKI PRZECHOWYWANIA 5 tygodni w temp. 2-8 C w torebce polietylenowej 5 tygodni w temp. 2-8 C 5 tygodni w temp. 2-8 C Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8 C, 1 tydzień w temp. 15-30 C, w ciemności Gotowy do użycia, 2 tygodnie w temp. 2-8 C 2 tygodnie w temp. 2-8 C, 5 dni w temp. 15-30 C Polski 4/9
Roztwór zatrzymujący Zgodnie z datą ważności w temp. 2-8 C 6. ZALECENIA I OSTRZEŻENIA ODCZYNNIKI WYŁĄCZNIE DO DIAGNOSTYKI IN VITRO Zestaw zawiera materiał pochodzenia ludzkiego, przebadany technikami zatwierdzonymi przez FDA i określony jako ujemny pod względem antygenu HBs i przeciwciał anty-hiv-1, anty-hiv-2 i anty-hcv. Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: 1. Przed użyciem przenieść próbki i odczynniki do temperatury pokojowej (18-30 C). Po użyciu od razu schować odpowiednie odczynniki do lodówki. Ważne jest zachowanie podczas pracy odpowiedniej temperatury; nie może ona spadać poniżej 35 C i przekraczać 39 C. Potrzebne do testu paski wyjąć z opakowania i co najmniej ½ godziny trzymać w temp. pokojowej. 2. Nie używać odczynników po upływie terminu przydatności, unikając zanieczyszczenia mikrobiologicznego. 3. Nie zmieniać opisanej procedury ani nie używać odczynników innych producentów i z innych serii, o ile odczynnik nie jest oznaczony jako stosowany zamiennie. Nie skracać zalecanego czasu inkubacji. 4. Używać szkła dokładnie umytego, przepłukanego 2M kwasem solnym, wodą destylowaną lub wysokiej jakości wodą dejonizowaną, i wysuszonego, lub, co jest wskazane, materiałów jednorazowych. 5. Podczas przechowywania ani na etapach inkubacji nie eksponować odczynników na światło lub pary podchlorynu. 6. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki na kolejnych etapach procedury. 7. Unikać krzyżowego zanieczyszczenia odczynników; do każdego używać innej pipety. 8. Uważnie nanosić koniugat, nie dotykając końcówką krawędzi płytki i nie doprowadzać do przelania się zawartości studzienki. 9. Test immunoenzymatyczny może czasem wykazywać efekt brzeżny, który należy zminimalizować zwiększając wilgotność podczas inkubacji. Płytka podczas inkubacji w temp. 37 C musi być nakryta pokrywką i umieszczona w statywie lub na platformie w łaźni wodnej, albo inkubowana w cieplarce. Alternatywnie, oznaczenie można wykonywać automatycznie i wówczas płytka jest inkubowana w aparacie. Nie używać inkubatorów CO 2. 10. Przed odczytem dokładnie osuszyć spód mikropłytki i sprawdzić, czy w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza. 11. Dla próbek silnie zhemolizowanych, niecałkowicie odwłóknionych lub zanieczyszczonych mikrobiologicznie można uzyskać błędne wyniki. 12. Należy zapoznać się z instrukcją obsługi używanej aparatury: - instalacja i szczegóły wyposażenia - zasada działania, instrukcja, ostrzeżenia i zagrożenia - specyfikacje producenta i charakterystyka aparatu - serwis i konserwacja. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY Nie pipetować ustami. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy używać okularów ochronnych i rękawiczek jednorazowych, a po pracy dokładnie umyć ręce. Następujące odczynniki zawierają niskie stężenie związków szkodliwych lub drażniących: - bufor do płukania zawiera detergenty - koniugat zawiera fenol - substrat ma odczyn kwaśny - surowice wzorcowe zawierają 0.09% azydek sodu, który może reagować z miedzią i ołowiem w kanalizacji, tworząc wysoce wybuchowe azydki metali. Po wylaniu do zlewu spłukać dużą ilością wody. Polski 5/9
Sprzęt wielokrotnego użytku należy wysterylizować po użyciu. Zaleca się autoklawowanie przez co najmniej godzinę w temp. 121 C; materiały jednorazowe należy autoklawować lub spalać. Kwas siarkowy w roztworze zatrzymującym i kwas solny używany do płukania szkła laboratoryjnego są związkami żrącymi i wymagają ostrożnego obchodzenia się. W przypadku kontaktu ze skórą lub z oczami, przemyć dużą ilością wody. Do neutralizacji kwasów i dekontaminacji innych płynnych odpadów używać podchlorynu sodu w końcowym stężeniu (po zmieszaniu z odpadem) 1.0%. 30-minutowa ekspozycja na 1% podchloryn sodu jest wystarczająca dla efektywnej dekontaminacji. Rozlany materiał zakaźny zebrać szybko bibułą, a zanieczyszczoną powierzchnię przemyć 1.0% roztworem podchlorynu i osuszyć, przed kontynuacją pracy. W przypadku rozlania kwasu należy dokładnie wytrzeć powierzchnię przed zmyciem podchlorynem sodu. Materiał używany do czyszczenia, w tym rękawiczki, wyrzucić do pojemnika na skażone odpady. Nie autoklawować roztworów zawierających podchloryn sodu. 7. PRÓBKI Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Z próbkami postępować przestrzegając zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 4 dni, próbki można przechować w temp. +2-8 C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp. -20 C lub niższej. Próbki można zamrozić i rozmrozić najwyżej 3 razy. Po rozmrożeniu próbki należy dokładnie wymieszać przed oznaczeniem. Inaktywacja termiczna i zanieczyszczenie mikrobiologiczne może powodować błędne wyniki. Należy unikać próbek silnie lipemicznych, żółtaczkowych i zanieczyszczonych. Do testu nie nadaje się osocze. 8. PROCEDURA - Przygotować potrzebną liczbę pasków. - Przygotować bufor do płukania rozcieńczając stężony bufor 10x (100 ml + 1100 ml wody). - Przygotować potrzebną ilość rozcieńczalnika próbek, dodając 1 część rozcieńczalnika stężonego 50x do 49 części rozcieńczonego buforu do płukania (np. 2 ml + 98 ml rozcieńczonego buforu do płukania). Rozcieńczyć próbki 1:101 dodając 10 µl surowicy do 1 ml rozcieńczalnika. Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek (zaleca się oznaczenie w duplikacie). Do kolejnych studzienek nanieść po 100 µl NIEROZCIEŃCZONYCH surowic wzorcowych: co najmniej 1 kontrolę ujemną, 2 kontrole cut-off i 1 kontrolę dodatnią. Jedną studzienkę pozostawić na ślepą próbę, jaką jest 100 µl mieszaniny substratu. Studzienki zakryć folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37 C. Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl) i dodać do każdej studzienki 100 µl koniugatu (z wyjątkiem ślepej próby). Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną i inkubować przez 45 minut w temp. 37 C. Ponownie przepłukać 4 razy jak poprzednio. Następnie do każdej studzienki dodać 100 µl substratu. Po 15 minutach inkubacji w temp. pokojowej zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 µl roztworu zatrzymującego. Odczytać wartość absorbancji (OD) przy długości fali 450 nm lub 450/620 nm w czasie 30 minut po zatrzymaniu reakcji. 9. Schemat procedury testu Platelia TM VZV IgG ETAP 1 ETAP 2 Do studzienek nanieść po 100 µl rozcieńczonych próbek/ nierozcieńczonych kontroli Inkubować przez 45 minut w temp. 37 C Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl) Do każdej studzienki nanieść 100 µl koniugatu (oprócz ślepej próby) Inkubować przez 45 minut w temp. 37 C Polski 6/9
Przepłukać 4 razy przez 30 sekund (300 µl) ETAP 3 ETAP 4 Do każdej studzienki nanieść 100 µl substratu Inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej Do każdej studzienki nanieść 100 µl roztworu zatrzymującego Odczytać absorbancję przy 450 nm w czasie 30 minut 10. WALIDACJA TESTU Od odczytanych wartości OD odjąć wartość OD dla ślepej próby ( 150). Żadna z wartości OD kontroli cut-off, oznaczonej w tryplikacie, nie może odbiegać od średniej o 25%. Wartość, która odbiega o ponad 25%, należy pominąć i obliczyć średnią dla dwóch pozostałych. Aby wyniki testu były ważne, muszą być spełnione odpowiednie kryteria - uzyskanie wartości gęstości optycznej: OD kontroli dodatniej 1.5 x OD kontroli cut-off. OD kontroli ujemnej / OD kontroli cut-off < 0.6 OD kontroli cut-off 0.2 przy 450 nm i 0.16 przy 450/620 nm Jeśli nie spełnione są kryteria kontroli jakości, test należy powtórzyć. 11. INTERPRETACJA WYNIKÓW WYNIKI JAKOŚCIOWE Jeśli absorbancja próbki jest wyższa niż absorbancja kontroli cut-off, próbka jest dodatnia pod względem swoistych przeciwciał IgG. Obliczyć iloraz wartości OD próbki i OD kontroli cut-off (INDEX). Wynik dodatni: iloraz > 1.2 Wynik wątpliwy: ± 20% wartości cut-off Wynik ujemny: iloraz < 0.8 W przypadku wyników wątpliwych zaleca się powtórzenie testu. Jeśli wynik kolejnego testu jest wątpliwy, należy pobrać i oznaczyć nową próbkę. 12. OGRANICZENIA METODY Dla próbek pobranych w ostrej fazie zakażenia, gdy występują jedynie przeciwciała klasy IgM, można uzyskać wyniki ujemne. Przeciwciała klasy IgM anty-vzv można wykryć w teście Platelia TM VZV IgM. Alternatywnie, w drugiej próbce pobranej 8-14 dni później można równolegle oznaczyć wzrost miana przeciwciał IgG. Wyniki testu należy interpretować w kontekście danych klinicznych, historii choroby pacjenta i wyników innych testów laboratoryjnych. 13. SWOISTOŚĆ ANALITYCZNA Na wynik testu nie wpływają przeciwciała IgG przeciwko innym wirusom: różyczki, Epsteina Barr, herpes simplex, świnki i odry. 14. CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ DIAGNOSTYCZNA W badaniu klinicznym, prowadzonym w laboratorium szpitalnym, oznaczono 47 próbek, stosując równolegle inną komercyjną metodę immunoenzymatyczną. Próbki, dla których uzyskano wyniki niezgodne, testowano referencyjną metodą IFA. Wyniki przedstawia tabela: Polski 7/9
METODA REFERENCYJNA + + - Platelia TM VZV IgG 29 0-3 15 Czułość testu Platelia TM VZV IgG określono na 90.63%, a swoistość na 100%. 15. PRECYZJA Powtarzalność wewnątrz-testowa dla odczynników 3 serii Cut-off n=21 Seria 029 Seria 030 Seria 031 OD 0.451 0.457 0.362 CV% 10 7 5 Powtarzalność pomiędzy-testowa dla odczynników różnych serii INDEX Próbka Seria nr 029 Seria nr 030 Seria nr 031 Średnia CV% 1 0.3 0.4 0.3 0.3 23 2 1.5 1.0 1.7 1.7 10 3 3.0 3.0 3.3 3.1 5 16. NAJCZĘSTSZE PROBLEMY PROBLEM MOŻLIWA PRZYCZYNA DZIAŁANIE Jeden lub więcej odczynników nie dodany lub dodany w niewłaściwej kolejności Powtórzyć test. Nieważny test (wszystkie próbki ujemne) Nieważny test (wszystkie próbki dodatnie) Nieaktywna mikropłytka Zanieczyszczenie substratu Sprawdzić procedurę. Sprawdzić nie używane roztwory. Sprawdzić kod na opakowaniu płytki (patrz p.4 instrukcji) Sprawdzić wilgotność nie używanej płytki (pochłaniacz wilgoci żel silikonowy musi być jasno-żółty). Powtórzyć test. Wziąć nową porcję substratu. Niedostateczne płukanie Sprawdzić pracę płuczki. studzienek Niska precyzja Niedokładne płukanie studzienek Sprawdzić pracę płuczki. Niedokładna aspiracja ze Sprawdzić pracę płuczki. studzienek Błąd pipetowania Zmienić ustawienie pipety Zbyt wolne dodawanie odczynników Powstanie niewłaściwej barwy Obecność pęcherzyków powietrza Zanieczyszczenie na drodze optycznej Nieprawidłowy czas lub temperatura inkubacji Dodana nieodpowiednia ilość substratu Unikać wysuszenia płytki po etapie płukania. Od razu dodawać odczynniki. Unikać powstawania pęcherzyków podczas pipetowania. Sprawdzić czystość źródła światła i detektora. Wytrzeć spód płytki miękkim materiałem. Sprawdzić ustawienie termostatu i monitorowanie czasu. Zastosować się do instrukcji. Zmienić ustawienie pipety Polski 8/9
17. LITERATURA patrz wersja angielska 05/2012 Polski 9/9