Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127 Praca oryginalna Original Article Ocena ekspresji IL-10, TGF-β oraz CD152 przez limfocyty regulatorowe T CD4 + Foxp3 + z ekspresją receptora chemokinowego CCR7 u chorych na astmę oskrzelową Evaluation of IL-10, TGF-β and CD152 expression of the CD4 + Foxp3 + regulatory T cells with the CCR7 chemokine receptor expression in patients with bronchial asthma Mateusz Bobrowski 1, Łukasz Kraszula 1, Makandjou-Ola Eusebio 1, Maciej Kupczyk 2, Piotr Kuna 2, Mirosława Pietruczuk 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, II Katedra Chorób Wewnętrznych, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wprowadzenie: W aktywności przeciwzapalnej limfocytów regulatorowych T CD4+Foxp3+ (Treg) podstawową rolę odgrywają cząsteczki powierzchniowe CD152 i cytokiny (IL-10, TGF-β) oraz receptory chemokinowe, w tym receptor chemokinowy CCR7, który jest odpowiedzialny za migrację limfocytów T i komórek dendrytycznych z tkanek do narządów limfatycznych. Cel: Ocena zależności pomiędzy ekspresją receptora CCR7 na powierzchni limfocytów T regulatorowych, a ich zdolnością do aktywności przeciwzapalnej określaną przez ocenę ekspresji CD152 i cytokin TGF-β i IL-10 w grupie osób chorych na astmę oskrzelową. Materiały i metody: Badanie obejmowało 25 pacjentów chorych na astmę ciężką i 23 na astmę umiarkowaną-łagodną. Grupa kontrolna obejmowała 25 ochotników. Ekspresję cytokin i molekuł powierzchniowych na limfocytach Treg oceniano przy użyciu wielokolorowej cytometrii przepływowej. Wyniki: Nie wykazano statystycznie istotnej różnicy w ekspresji receptora CCR7 na limfocytach Treg pomiędzy badanymi grupami, a grupą kontrolną. Wykazano, że wewnątrzkomórkowa ekspresja IL-10 przez Treg była statystycznie istotnie zmniejszona u osób chorych na astmę co korelowało z ciężkością choroby. Ekspresja TGF-β przez Treg była statystycznie istotnie zmniejszona u osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. Wykazano statystycznie istotne zwiększenie ekspresji cząsteczki CD152 na limfocytach Treg w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łągodną w porównaniu do osób zdrowych. Wykazano również dodatnią korelację pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3+, a ekspresją cząsteczki CD152 na limfocytach Treg w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. Wnioski: Zmniejszona wewnątrzkomórkowa ekspresja cytokin (IL-10, TGF-β) może wiązać się z obniżeniem funkcji supresji bezpośredniej przez limfocyty Treg. (Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127) Summary Introduction: Surface molecules, cytokines and chemokine receptors, including CCR7 chemokine receptor, which is responsible for the migration of T cells and dendritic cells from the tissues to the lymphoid organs, play a fundamental role in the anti-inflammatory activity of regulatory T cells. Aim of the study: Evaluate the relationship in the group of patients with asthma between the expression of CCR7 receptor on the surface of T regulatory cells and their ability to anti-inflammatory activity, which was determined by evaluating the expression of CD152 and cytokine TGF-β and IL-10 Material and methods: The study included 25 patients with severe asthma and 23 with mild to moderate asthma. The control group comprised 25 healthy volunteers. The expression of cytokines and molecules on Treg lymphocytes was evaluated using multicolor flow cytometry. Results: There was no statistically significant difference in expression of CCR7 by Treg cells in patients with severe and mild-moderate asthma compared with controls. We found that expression of IL-10 by Treg cells was significant lower which correlates with the severity of asthma. Expression of TGF-β by Treg was statistically significantly reduced in patients with mild-moderate asthma. We evaluated the expression of CD152 by Treg cells which was significantly higher in mild-moderate asthma than in healthy subjects. We also showed a positive correlation between the Treg cells expressing CD152 and Foxp3 in patients with mild-moderate asthma. Conclusions: Decreased expression of intracellular cytokines (IL-10, TGF-β) may be associated with a decrease in the function of direct suppression Treg lymphocytes. (Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127) 121

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Słowa kluczowe: astma, limfocyty T regulatorowe, CCR7, CD152 Key words: asthma, regulatory T cells, CCR7, CD152 Astma to choroba cywilizacyjna, u podłoża której leży przewlekły proces zapalny dróg oddechowych objawiający się nadreaktywnością oskrzeli i zmienną obturacją dróg oddechowych [1, 2]. W przebiegu tych zmian ważną rolę odgrywają limfocyty T regulatorowe, które znacząco wpływają na utrzymanie obwodowej tolerancji i supresji odpowiedzi immunologicznej dzięki zdolności do hamowania aktywności innych limfocytów [3, 4]. Wśród limfocytów T regulatorowych wyróżnia się naturalne limfocyty T regulatorowe (ntreg) (CD4 + CD25 + ) oraz indukowane limfocyty T regulatorowe (itreg) (Tr1, Th3, CD4 + CD25 high Foxp3 + ), które nabywają właściwości immunosupresyjnych odpowiednio podczas różnicowania się w grasicy lub na obwodzie [5]. Do ich właściwego różnicowania konieczna jest ekspresja czynnika transkrypcyjnego Foxp3 (ang. forkhead box P3) [6]. Badania na modelach zwierzęcych potwierdziły, iż mutacje w obrębie tego czynnika jądrowego doprowadzają do utraty prawidłowej funkcji limfocytów Treg, a w konsekwencji do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych [7]. W badaniach Pietruczuk i wsp. [8] wykazano zaburzenie liczebności i/lub funkcji limfocytów regulatorowych T CD4 + (Treg) u chorych na astmę oskrzelową. Uważa się, że do pełnienia swojej funkcji limfocyty Treg muszą charakteryzować się odpowiednią ekspresją receptorów chemokinowych, dzięki którym komórki migrują i lokalizują się we właściwym miejscu. Wiadomo, że limfocyty T regulatorowe na swojej powierzchni wykazują m.in. ekspresję receptora chemokinowego CCR7, który pobudzany jest przez chemokiny CCL19 i CCL21 [9, 10]. Chemokiny te uczestniczą dendritic cells DCs). Interakcja tych molekuł hamuje wzrost ekspresji CD80/86 na komórkach DCs w efekcie czego ograniczeniu ulega stymulacja dziewiczych limfocytów T i ich różnicowanie w kierunku limfocytów T efektorowych (Teff), czego wynikiem jest zahamowanie indukcji swoistej odpowiedzi odpornościowej. Jednocześnie następuje zużycie IL-2 przez limfocyty Treg co w następstwie powoduje spadek proliferacji kolejnych limfocytów Teff Th1, Th2 i Th17. W ten sposób CD152 stanowi sygnał ujemnego sprzężenia zwrotnego w swoistej odpowiedzi immunologicznej, nie dopuszczając do jej nadmiernego rozwoju [14]. Dzięki tej właściwości limfocyty Treg hamują bezpośrednio produkcję interleukin, czyli podstawowych cytokin uczestniczących w odpowiedzi efektorowej w reakcji alergicznej. Limfocyty Treg mają również zdolność do tłumienia zapalenia alergicznego przez bezpośrednie działanie na komórki tuczne, komórki prezentujące antygen, bazofile i eozynofile. Ponadto limfocyty Treg hamują produkcję swoistych IgE przeciw alergenom oraz indukują wytwarzanie IgG4 i/lub IgA [3]. Wydaje się, więc zasadne zbadanie czy mechanizmy, przez które limfocyty Treg speniają swoją immunosupresyjną funkcję nie są zaburzone w przebiegu astmy oskrzelowej, szczególnie w jej ciężkiej postaci. Celem przeprowadzonych badań była ocena zależności w grupie osób chorych na astmę oskrzelową pomiędzy ekspresją receptora chemokinowego CCR7 na powierzchni naturalnych i indukowanych limfocytów T regulatorowych, a ich zdolnością do aktywności przeciwzapalnej, która określana była przez ocenę ekspresji antygenu CD152 i cytokin TGF-β i IL-10. w początkowym etapie ścisłej adhezji i diapedezy limfocytów (wydzielane są przez śródbłonek naczyń włosowatych) stwarzając gradient chemotaktyczny powodujący ich kolokalizację do węzłów chłonnych. Zmniejszenie ekspresji receptora może prowadzić do zaburzenia migracji limfocytów do miejsca prezentacji antygenu, co może powodować niedostateczne różnicowanie się limfocytów i zakłócenie homeostazy układu immunologicznego [11, 12]. Aktywność supresorowa limfocytów Treg związana jest z supresją bezpośrednią i pośrednią. Supresja bezpośrednia obejmuje w głównej mierze działanie cytokin TGF-β (transformujący czynnik wzrostu β) i interleukiny 10, które hamują odpowiedź zapalną, a także promują powstawanie indukowanych limfocytów Treg w tkankach obwodowych. Z kolei, pośrednia forma supresji polega Materiały i metody Do badania zakwalifikowano 25 pacjentów z rozpoznaną ciężką astmą oskrzelową i 23 z umiarkowaną-łagodną postacią choroby. Grupa kontrolne obejmowała 25 zdrowych ochotników. Osoby palące tytoń i pacjenci w niestabilnym stanie klinicznym byli wyłączeni z badania. Na podstawie historii chorób zebrano dane demograficzne i kliniczne (Tabela I). Średnia wieku w grupie kontrolnej była w podobnym przedziale jak u pacjentów z rozpoznaną astmą. Rozpoznanie astmy oskrzelowej potwierdzono zgodnie z zaleceniami GINA 2008 [15], a stopień ciężkości choroby oceniono zgodnie z definicją użytą w badaniach grupy ENFUMOSA [16]. Chorzy zakwalifikowani do grupy z astmą ciężką wymagali stałego na hamowaniu aktywności komórek prezentujących antygen (APC) [6, 13]. Pośredni mechanizm supresji przez molekuły CTLA-4 (ang. cytotoxic T cell antigen 4, także Tabela I. Charakterystyka badanej grupy. Astma ciężka Astma umiarkowana-łagodna CD152), które po aktywacji limfocytów T regulatorowych przez receptor TCR ulegają przemieszczeniu z cytoplazmy na powierzchnię komórki, jest najlepiej poznaną formą oddziaływania Liczebność wiek (± SD) płeć (K:M) 25 50 ± 13,5 lat 13:12 23 42,5 ± 13,0 lat 12:11 (CD80) na komórkach dendrytycznych (ang. limfocytów T regulatorowych na komórki APC. czas trwania choroby Ligandem dla białka CD152 jest receptor B7 (± SD) 16,5 ± 8,2 lat 11 ± 6,1 lat 122

Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127 leczenia wysokimi dawkami sterydów wziewnych, (co najmniej 1600 μg/dobę budesonidu lub beklometazonu, 800 μg/dobę flutikazonu lub równoważnika). W przypadku przewlekłej doustnej sterydoterapii, wymagane dawki leków wynosiły 800 μg/ dobę budesonidu lub beklometazonu, 400 μg/dobę flutikazonu lub równoważnika. Ponadto chorzy z astmą ciężką wymagali przewlekłej terapii β-mimetykiem lub doustną teofiliną, a w roku poprzedzającym włączenie do badania mieli, co najmniej jedno zaostrzenie choroby podstawowej. Chorzy z astmą umiarkowaną- -łagodną otrzymywali wyłącznie glikokortykosteroidy wziewne (max 800 μg budesonidu lub odpowiednika na dobę) plus leczenie objawowe [17]. Projekt badawczy uzyskał zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi RNN/49/13/KE. Materiałem badanym była krew żylna pobrana na wersenian dwupotasowy (K 2 EDTA). Od każdego pacjenta 8 ml krwi żylnej nawarstwiano na 12 ml podłoża Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich). Komórki jednojądrzaste (PBMCs) wyizolowano przez wirowanie 2500 obrotów na minutę przez 30 minut w gradiencie gęstości. Bezwzględną liczbę, odsetek komórek, a także odsetek żywych, wyizolowanych komórek oznaczano na analizatorze pentra DX 120. Czystość komórkowa pozwalająca na przystąpienie do etapu sortowania musiała być wyższa niż 80% limfocytów. Limfocyty CD4 + wyizolowano w procesie separacji negatywnej procedura jednostopniowa (Miltenyi Biotec, Stany Zjednoczone). Czystość wysortowanej populacji limfocytów CD4 + sprawdzano, znakując komórki przeciwciałami anty-cd4 zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience), pomiaru dokonywano cytometrem przepływowym BD FACS CANTO II. Założono hodowle komórkowe z wysortowanych limfocytów CD4 +. Hodowle komórkową prowadzono na podłożu RPMI 1640, z dodatkiem 2mM glutaminy, 5% płodową surowicę wołową (FBS), 10mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i streptomycyny przez 72 godziny w sterylnych płytkach w warunkach 37ºC, 5% CO 2 [18]. Wyindukowanie limfocytów T CD4 + wykonano przez stymulatory: Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3; 10ug/ml klon UCHT1 (BD Pharmingen) Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28; 1ug/ml klon CD28.2 (BD Pharmingen) Po zakończeniu hodowli komórkowych oznaczano limfocyty T regulatorowe o immunofenotypie Foxp3 + wykazujących ekspresję receptora CCR7 i CD152 oraz wewnątrzkomórkową ekspresję IL-10 i TGF-β. Oznaczanie ekspresji receptora powierzchniowego CCR7 i CD152 wykonano w zawiesinie limfocytów Treg. Wewnątrzkomórkową ekspresję cytokin IL-10 i TGF-β oznaczano w cytoplazmie po wcześniejszej inkubacji tych komórek z brefeldyną (2ng/mL) (Sigma, Niemcy). Po upływie 5 godzin komórki utrwalono, permabilizowano i inkubowano 30 minut z przeciwciałami (Tabela II). Ocenę immunofenotypu limfocytów Treg wykonano przy użyciu 8 kolorowego cytometru przepływowego BD FACS CANTO II. Barwienie powierzchniowe antygenów wykonano zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience). Do analizy zbierano od 10 000 15 000 odpowiednich limfocytów. Wyniki badań opracowano statystycznie, korzystając z programu STATISTICA 8.0 PL. Uzyskane wyniki weryfikowano pod względem normalności rozkładu przy użyciu testu Kołmogorowa-Smirnowa z poprawką Lilleforsa (K-S-L). Otrzymane wyniki przedstawiono jako mediany (Me) i zakresy kwartylowe (Q 1, Q 3 ). Ze względu na brak zgodności z rozkładem normalnym w poszczególnych seriach danych, do oceny istotności różnic wykorzystywano testy nieparametryczne. Różnice w odsetkach pomiędzy trzema niezależnymi grupami badanymi oceniane były przy użyciu testu Kruskala Wallis a, a w przypadku dwóch grup niezależnych testem U Mann a-whitney a. Do analizy korelacji obliczano współczynnik rang Spearmana. Różnice między grupami przyjęto za statystycznie istotne na poziomie istotności p 0,05. Wyniki Analizując ekspresję receptorów chemokinowych CCR7 na powierzchni limfocytów Treg nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic pomiędzy grupą pacjentów chorych na astmę ciężką i astmę umiarkowaną-łagodną, a grupą osób zdrowych (Ryc. 1A, Tab. III). Wykazano statystycznie istotne zwiększenie odsetka limfocytów regulatorowych T o immunofenotypie FoxP3 + CCR7 + z ekspresją CD152 pomiędzy grupą osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną, a grupą osób zdrowych (p<0,001). Tabela II. Przeciwciała monoklonalne zastosowane do oceny immunofenotypu subpopulacji limfocytów regulatorowych T (Treg) Przeciwciało Fluorochrom Klon Producent anty-cd4 AmCyan SK3 BD anty-cd25 FITC M-A251 BD Pharmingen anty-cd127 PerCP-Cy5.5 A019D5 BioLegend anty-foxp3 V-450 236A/E7 BD Horizon IL 10 PE JES3-19F1 BD Pharmingen Anty CD152 APC BNI3 BD Pharmingen Anty-Human CCR7 PE-Cy7 3D12 BD Pharmingen Anty-Human TGF beta 1 antibody IgG secondary antibody H&L F(ab)2 Fragment PE 2Ar2 Abcam 123

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Nie wykazano znamiennie statystycznej różnicy w odsetku limfocytów Treg z ekspresją CD152 zarówno pomiędzy pacjentami chorymi na astmę ciężką, a pacjentami chorymi na astmę umiarkowaną-łagodną jak i pomiędzy pacjentami chorymi na astmę ciężką, a grupą kontrolną (Ryc. 1B, Tab. III). Wykazano statystycznie znamienne zmniejszenie odsetka limfocytów T regulatorowych o immunofenotypie CD4 + CD25 high C- D127 low FoxP3 + CCR7 + CD152 + z wewnątrzkomórkową ekspresją IL-10 zarówno u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną (p<0,01) jak i astmę ciężką (p<0,001), w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykazano także statystycznie znamienne różnice w odsetku limfocytów Treg z ekspresją IL-10 pomiędzy pacjentami chorymi na astmę umiarkowaną-łagodną, a grupą chorych na astmę ciężką (p<0,05) (Ryc. 2A, Tab. III). Stwierdzono statystycznie istotne zmniejszenie odsetka limfocytów T regulatorowych FoxP3 + CCR7 + CD152 + z wewnątrzkomórkową ekspresją TGF-β u osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną w stosunku do grupy kontrolnej osób zdrowych (p<0,0001). Ponadto w przeprowadzonych badaniach wykazano, że odsetek limfocytów Treg z ekspresją TGF-β statystycznie istotnie różni się pomiędzy grupami osób chorych na astmę ciężką i umiarkowaną-łagodną (p<0,0001). Nie wykazano Rycina 1. Odsetek limfocytów regulatorowych T u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej: A o immunofenotypie CD4 + C- D25 high CD127 low Foxp3 + CCR7 + ; B o immunofenotypie Foxp3 + CCR7 + CD152 + ; C legenda (Q1 kwartyl dolny, Q3 kwartyl górny, min wartość minimalna, max wartość maksymalna, mediana wartość środkowa) Rycina 2. Odsetek limfocytów regulatorowych T u osób chorych na astmę ciężką, astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej: A o immunofenotypie CD4 + C- D25 high CD127 low Foxp3 + CCR7 + ; B o immunofenotypie Foxp3 + CCR7 + CD152 + ; C legenda (Q1 kwartyl dolny, Q3 kwartyl górny, min wartość minimalna, max wartość maksymalna, mediana wartość środkowa) Tabela III. Zmienne opisujące odsetek naturalnych i indukowanych limfocytów regulatorowych T CD4+z obecnością receptora chemokinowego CCR7, z ekspresją cytokin (IL-10, TGF-β) oraz cząsteczki powierzchniowej CD152. Immunofenotyp limfocytów Treg Zmienne Pacjenci z astmą ciężką Pacjenci z astmą umiarkowaną-łagodną Grupa kontrolna Mediana 78 83,65 82,75 Foxp3 + CCR7 + Dolny i górny kwartyl 72 82,5 70,45 86,35 73,55 86 Mediana 70,9 66,8 54,5 Foxp3 + CCR7 + CD152 + Dolny i górny kwartyl 40,9 85,8 61,9 69,7 51,5 60,7 Mediana 72,2 77,5 83,8 Foxp3 + CCR7 + CD152 + IL10 + Dolny i górny kwartyl 66,7 75,7 74 82,4 80,6 85,2 Mediana 35,3 18,7 38,6 Foxp3 + CCR7 + CD152 + TGFβ + Dolny i górny kwartyl 33,6 36,9 13,6 20,8 34,2 40 124

Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127 takiej zależności w grupie osób chorych na astmę ciężką w porównaniu do grupy kontrolnej (Ryc. 2B, Tab. III). Stwierdzono ujemną korelację pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 +, a ekspresją receptora CCR7 (r=-0,5; p=0,02) w limfocytach T regulatorowych w grupie chorych z astmą ciężką. Nie wykazano korelacji pomiędzy tymi parametrami w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną i w grupie kontrolnej. Korelacji nie wykazano również pomiędzy ekspresją receptora chemokinowego CCR7 na limfocytach Treg, a ekspresją cytokin IL-10 i TGF-β we wszystkich badanych grupach. W grupie chorych z astmą umiarkowaną-łagodną stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 +, a ekspresją cząsteczki CD152 (r=0,55; p=0,01) w limfocytach T regulatorowych. Dyskusja Uważa się, że limfocyty T regulatorowe mogą przejawiać swoje działanie supresyjne zarówno na obwodzie, gdzie dochodzi do reakcji odpornościowej jak i wewnątrz tkanek limfatycznych [19]. Sygnalizacja poprzez receptor chemokinowy CCR7 wywołuje migrację komórek układu immunologicznego tj. komórek dendrytycznych i limfocytów T pomiędzy tkankami obwodowymi, a narządami limfatycznymi [20, 21]. Istotną rolę w tym etapie odgrywają chemokiny CCL19 i CCL21, które wydzielane są przez śródbłonek naczyń krwionośnych i przyciągają limfocyty T posiadające na swojej powierzchni wyeksponowane receptory CCR7 [22]. Ważną rolę w tym procesie odgrywają także cząsteczki adhezyjne, te obecne na powierzchni limfocytów (L-selektyny), jak i na powierzchni śródbłonka (kompleks glikoproteinowych ligandów zaliczanych do grupy adresyn naczyniowych PNAd). Połączenie to jest jednak zbyt słabe do zapoczątkowania procesu migracji i przeciwstawieniu się napierającemu prądowi krwi. Dlatego też w celu intensywniejszej adhezji i rolowania limfocytów potrzeba silniejszego wiązania w postaci aktywacji cząsteczek LFA-1 (wiąże się do ligandów ICAM-1 i ICAM-2, ang. intercellular adhesion molecules), kolejnych receptorów integryn α4β1 (MAdCAM-1) jak i integryn α4β7 (VCAM-1, ang. vascular cell adhesion molecule), których aktywacja dodatkowo stymulowana jest poprzez chemokiny CCL19 i CCL21 [23]. Te wzajemne kaskadowo wzmacniające się procesy prowadzą do zatrzymania limfocytów T i ich migrację do wtórnych narządów limfatycznych, gdzie następuje prezentacja antygenów przez komórki dendrytyczne (DCs) i dochodzi do różnicowania limfocytów zarówno w stronę limfocytów efektorowych jak i regulatorowych [22, 24]. Na tym etapie również dochodzi do wzmocnienia sygnału poprzez wydzielanie przez komórki DCs ligandów CCL19 i CCL21 dla receptora CCR7 na limfocytach co ułatwia ich skuteczniejsze oddziaływanie [11, 22]. Tak więc, komórki układu immunologicznego charakteryzują się powierzchniową ekspresją receptorów chemokinowych, które zdolne są do odpowiedzi na miejscowy gradient chemotaktyczny powodujący ich migrację do miejsc docelowych w tkance umożliwiając tym samym kontrolę odpowiedzi immunologicznej [25]. Wyniki przeprowadzonych badań nie wykazały statystycznie istotnych różnic w ekspresji receptora chemokinowego CCR7 na powierzchni limfocytów T regulatorowych pomiędzy badanymi grupami w przebiegu astmy oskrzelowej (Ryc. 1A, Tab. III). Uzyskane wyniki mogą sugerować zachowaną zdolność migracyjną limfocytów regulatorowych T wykazujących ekspresję receptora CCR7. W badaniach przeprowadzanych przez Schneider i wsp. [9] wykazano, że receptor CCR7 jest wymagany aby limfocyty T regulatorowe były zdolne do migracji i zasiedlania węzłów chłonnych [12, 23]. Również w badaniach Debes i wsp. [26] u osób z grypą wywołaną przez wirus grypy typu A wykazano, że zmniejszenie ekspresji receptora CCR7 na limfocytach CD4 + zapobiega recyrkulacji i obecności tych komórek w miejscu procesu zapalnego. Podobne wnioski wykazano w badaniach Roman i wsp., którzy zaobserwowali brak ekspresji receptora CCR7 na komórkach CD4 + w trakcie wirusowego zapalenia płuc [27]. Jednak należy pamiętać, że sam proces przemieszczania się komórek jest wieloetapowy i może nie zależeć jedynie od interakcji receptor ligand [23]. Po migracji do miejsca docelowego limfocyty T regulatorowe zdolne są do wyciszania odpowiedzi immunologicznej dzięki hamowaniu aktywności innych komórek. Limfocyty Treg hamują zapoczątkowanie swoistej odpowiedzi immunologicznej przez komórki dendrytyczne na kilka sposobów. Jednak najlepiej poznanym mechanizmem jest supresja pośrednia komórek DCs poprzez molekułę CD152. Tolerancja lub odpowiedź immunologiczna komórek dendrytycznych uzależniona jest od stanu ich dojrzałości. Niedojrzałe komórki dendrytyczne charakteryzują się ekspresją cząsteczki CD80 z rodziny cząsteczek B7. W miarę dojrzewania wzrasta na nich ekspresja cząsteczki CD86 [28]. Kontakt limfocytów Treg z cząsteczką CD80 na komórkach DCs nasila, a z CD86 hamuje ich funkcje supresorowe. Oddziaływanie to jest możliwe dzięki obecności na powierzchni limfocytów Treg cząsteczki CD152. Efektem interakcji CD152 na powierzchni Treg z jej ligandami B7 na komórkach DCs jest pobudzenie wytwarzania enzymu rozkładającego tryptofan (IDO indoleamine 2,3-dioxygenase). Enzym ten z jednej strony odpowiada za usuwanie tryptofanu ze środowiska, czyli kluczowego aminokwasu dla proliferacji i aktywacji limfocytów efektorowych, z drugiej zaś, metabolity tryp tofanu (zwłaszcza kinerunina) promują aktywację limfocytów Treg [29]. Ponadto limfocyty T regulatorowe po interakcji z komórkami DCs wiążącymi antygen, ograniczają tworzenie się stabilnych związków między limfocytami Teff i komórkami DCs w czasie prezentacji antygenu co prowadzi do zablokowania aktywacji limfocytów Teff [30]. Blokowanie komórek prezentujących antygen znalazło odzwierciedlenie w ostatnio prowadzonych badaniach. Wykazano, że selektywne zablokowanie ekspresji CD152 i IL-10 przez komórki T regulatorowe skutkuje rozwojem zapalenia jelita grubego i rozwojem systemowych chorób limfoproliferacyjnych i autoimmunizacyjnych u myszy. W badaniach u myszy przeprowadzonych przez K. Wing i wsp. [14] wykazano, że brak ekspresji CD152 na limfocytach Treg skutkuje powiększeniem węzłów chłonnych i śledziony. Uważa się, że białko CD152 jest podstawową cząsteczką efektorową odpowiedzialną za kontrolowanie tolerancji immunologicznej przez limfocyty T regulatorowe [29, 31]. Wyniki prezentowanych badań wykazały statystycznie istotne zwiększenie ekspresji cząsteczki CD152 na powierzchni limfocy- 125

www.diagnostykalaboratoryjna.eu tów Treg w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną w stosunku do grupy kontrolnej (Ryc. 1B, Tab. III). W pozostałych grupach nie wykazano różnic statystycznie istotnych. Nadekspresja tej cząsteczki może umożliwić większą zdolność limfocytom Treg do przeciwdziałania niekontrolowanej aktywności limfocytów T efektorowych. Potwierdzeniem ważnej roli tej cząsteczki były eksperymenty przeprowadzone przez Waterhouse i wsp. [32] z udziałem myszy ze znokautowanym genem CD152, które ginęły przed osiągnięciem dojrzałości na skutek wieloorganowego zapalenia. Znokautowanie genu nie upośledzało rozwoju ani żywotności komórek Treg, a wpływało jedynie na ich funkcje. Ponadto ekspresja cząsteczki CD152 w limfocytach T regulatorowych jest kontrolowana poprzez czynnik transkrypcyjny Foxp3 [33]. W przeprowadzonych badaniach potwierdzono dodatnią korelację pomiędzy ekspresją cząsteczki CD152, a czynnikiem Foxp3 w grupie osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. Nie stwierdzono takiej zależności u pacjentów z astmą ciężką i w grupie kontrolnej. Może to być wynikiem przyjmowania przez tych pacjentów leków w postaci glikokortykosteroidów, które obniżają liczbę krążących limfocytów T regulatorowych co udokumentowano w badaniach Pietruczuk i wsp. [8]. Ilość receptorów, która jest postulowana jako istotna dla funkcjonowania limfocytów Treg sugeruje, że działanie tych komórek w przeważającej mierze zależy od kontaktów międzykomórkowych. Mimo to, istotną aktywnością, która charakteryzuje limfocyty Treg jest zdolność do wydzielania cytokin [5]. TGF-β może bezpośrednio oddziaływać na potencjalnie patogenne limfocyty efektorowe, blokując ich różnicowanie lub indukować w nich ekspresję Foxp3 i funkcje regulatorowe. Z kolei IL-10 bierze udział w kontroli odpowiedzi wrodzonej poprzez hamowanie lokalnej i systemowej akumulacji komórek biorących w niej udział oraz odgrywa rolę w powstawaniu subpopulacji limfocytów regulatorowych Tr1 [34]. W prezentowanych badaniach wykazano, że odsetek limfocytów o immunofenotypie Foxp3 + CCR7 + CD152 + z wewnątrzkomórkową ekspresją IL-10 był statystycznie istotnie zmniejszony co korelowało z ciężkością choroby (Ryc. 2A, Tab. III). Wykazano również statystycznie istotne zmniejszenie odsetka limfocytów Treg z wewnątrzkomórkową ekspresją TGF-β u osób chorych na astmę umiarkowaną-łagodną zarówno w porównaniu do grupy kontrolnej jak i do grupy osób chorych na astmę ciężką (Ryc. 2B, Tab III). Powoduje to zmniejszenie właściwości supresorowych limfocytów Treg i mniejszą zdolność do kontrolowania odpowiedzi immunologicznej. Znaczenie IL-10 i TGF-β oceniano na modelach zwierzęcych. Badane myszy ze znokautowanym genem dla IL10 -/ i TGF-β -/ wykazywały niekontrolowaną odpowiedzą immunologiczną i rozwijały szereg chorób zapalnych. Również limfocyty regulatorowe T pozyskane podczas powyższych badań były mniej skuteczne od naturalnych limfocytów Tregs uzyskanych od zdrowych zwierząt w zapobieganiu rozwoju choroby zapalnej jelit (IBD). Wydaje się, iż dążenie do ich wyższego stężenia we krwi obwodowej poprzez modulację ich wydzielania mogłoby wpłynąć stymulująco na pełnienie przez limfocyty Treg swojej funkcji [18]. Markery charakterystyczne dla limfocytów T regulatorowych takie jak Foxp3, CD152 czy wydzielane przez nie cytokiny (TGF-β i IL-10) w powiązaniu z pełnionymi przez limfocyty regulatorowe funkcjami supresorowymi są ważnymi mechanizmami kontroli aktywności limfocytów T efektorowych. Badania prowadzone na modelach mysich i materiale zwierzęcym dostarczyły wielu dowodów na poparcie tej tezy. W powyższym aspekcie możliwość modulacji supresji pośredniej i bezpośredniej limfocytów Treg mogłaby przyczynić się do pozytywnej ingerencji terapeutycznej i lepszej kontroli układu immunologicznego. Praca finansowana w ramach finansowania badań młodych pracowników nauki i studentów studiów doktoranckich z konta 502-03/1-095-05/502-14-027. Piśmiennictwo 1. Martinez FD, Vercelli D. Asthma. Lancet 2013; 382: 1360-1372. 2. Lloyd CM, Hessel EM. Functions of T cells in asthma: more than just T(H)2 cells. Nat Rev Immunol 2010; 10: 838-848. 3. Langier S, Sade K, Kivity S. Regulatory T cells in allergic asthma. Isr Med Assoc J 2012; 14: 180-183. 4. Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol 2008; 8: 523-532. 5. Dasgupta A, Saxena R: Regulatory T cells. a review. Natl Med J India 2012; 25: 341-351. 6. Orihara K, Nakae S, Pawankar R, et al. Role of regulatory and proinflammatory T-cell populations in allergic diseases. World Allergy Organ J 2008; 1: 9-14. 7. Cretney E, Kallies A, Nutt SL. Differentiation and function of Foxp3(+) effector regulatory T cells. Trends Immunol 2013; 34: 74-80. 8. Pietruczuk M, Eusebio M, Kraszula L, et al. Phenotypic characterization of ex vivo CD4+CD25highCD127low immune regulatory T cells in allergic asthma: pathogenesis relevance of their FoxP3, GITR, CTLA-4 and FAS expressions. J Biol Regul Homeost Agents 2012; 26: 627-639. 9. Schneider MA, Meingassner JG, Lipp M, et al. CCR7 is required for the in vivo function of CD4+ CD25+ regulatory T cells. J Exp Med 2007; 204: 735-745. 10. Vander LB, Tubo NJ, Nizza ST, et al. CCR7 plays no appreciable role in trafficking of central memory CD4 T cells to lymph nodes. J Immunol 2013; 191: 3119-3127. 11. Worbs T, Forster R: A key role for CCR7 in establishing central and peripheral tolerance. Trends Immunol 2007; 28: 274-280. 12. Ziegler E, Oberbarnscheidt M, Bulfone-Paus S, et al. CCR7 signaling inhibits T cell proliferation. J Immunol 2007; 179: 6485-6493. 13. Josefowicz SZ, Lu LF, Rudensky AY. Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol 2012; 30: 531-564. 14. Wing K, Onishi Y, Prieto-Martin P, et al. CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 2008; 322: 271-275. 15. Bateman ED, Hurd SS, Barnes PJ, et al.: Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J 2008; 31: 143-178. 16. The ENFUMOSA cross-sectional European multicentre study of the clinical phenotype of chronic severe asthma. European Network for Understanding Mechanisms of Severe Asthma: Eur Respir J 2003; 22: 470-477. 17. Kraszula L, Eusebio M, Kupczyk M, et al. The use of multi-color flow cytometry for identification of functional markers of ntregs in patients with severe asthma. Pneumonol Alergol Pol; 2012; 5: 389-401. 18. Bobrowski M, Kraszula Ł, Eusebio M, et al. Evaluation of the Foxp3 + regulatory T lymphocytes expressing surface CCR5 receptor and the production of selected cytokines by effector T lymphocytes in patients with bronchial asthma using multi-color flow cytometry. Diagn Lab; 2014; 50: 5-13. 19. Schmitt EG, Williams CB: Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol 2013; 4: 152. 20. Luchtefeld M, Grothusen C, Gagalick A, et al. Chemokine receptor 7 knockout attenuates atherosclerotic plaque development. Circulation 2010; 122: 1621-1628. 21. Schieffer B, Luchtefeld M: Emerging role of chemokine receptor 7 in atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med 2011; 21: 211-216. 22. Noor S, Wilson EH: Role of C-C chemokine receptor type 7 and its ligands during neuroinflammation. J Neuroinflammation 2012; 9: 77. 126

Diagn Lab 2014; 51(2): 121-127 23. Bono MR, Elgueta R, Sauma D, et al. The essential role of chemokines in the selective regulation of lymphocyte homing. Cytokine Growth Factor Rev 2007; 18: 33-43. 24. Menning A, Hopken UE, Siegmund K, et al. Distinctive role of CCR7 in migration and functional activity of naive and effector/memory-like Treg subsets. Eur J Immunol 2007; 37: 1575-1583. 25. Nandagopal S, Wu D, Lin F. Combinatorial guidance by CCR7 ligands for T lymphocytes migration in co-existing chemokine fields. PLoS One 2011; 6: e18183. 26. Debes GF, Bonhagen K, Wolff T, et al. CC chemokine receptor 7 expression by effector/memory CD4+ T cells depends on antigen specificity and tissue localization during influenza A virus infection. J Virol 2004; 78: 7528-7535. 27. Roman E, Miller E, Harmsen A, et al. CD4 effector T cell subsets in the response to influenza: heterogeneity, migration, and function. J Exp Med 2002; 196: 957-968. 28. Pletinckx K, Dohler A, Pavlovic V, et al.: Role of dendritic cell maturity/costimulation for generation, homeostasis, and suppressive activity of regulatory T cells. Front Immunol 2011; 2: 39. 29. Mellor AL, Munn DH: IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol 2004; 4: 762-774. 30. Tadokoro CE, Shakhar G, Shen S, et al. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med 2006; 203: 505-511. 31. Suarez N, Alfaro C, Dubrot J, et al. Synergistic effects of CTLA-4 blockade with tremelimumab and elimination of regulatory T lymphocytes in vitro and in vivo. Int J Cancer 2011; 129: 374-386. 32. Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science 1995; 270: 985-988. 33. Oderup C, Cederbom L, Makowska A, et al. Cytotoxic T lymphocyte antigen- -4-dependent down-modulation of costimulatory molecules on dendritic cells in CD4+ CD25+ regulatory T-cell-mediated suppression. Immunology 2006; 118: 240-249. 34. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol 2009; 70: 326-336. Adres do korespondencji mgr Mateusz Bobrowski Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej II Katedra Chorób Wewnętrznych Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-153 Łódź, ul. Kopcińskiego 22 Tel. +48 42 6776981 e-mail: mati.bobrowski@wp.pl Zaakceptowano do druku: 2.05.2014 127