ĆWICZENIE I Temat : Podstawowe wiadomości z techniki mikrobiologicznej. Zapoznanie z przepisami BHP. Przedmiotem badań mikrobiologii rolniczej są mikroorganizmy zasiedlające glebę, powierzchnie roślin, komposty, obornik i inne nawozy organiczne. Badania te mają na celu charakterystykę ilościową i jakościową mikroorganizmów oraz określenie ich roli i aktywności w środowisku. 1. Podłoża hodowlane (typy i przykłady); substancje zestalające (agar agar, żelatyna). Hodowle drobnoustrojów prowadzi się na pożywkach lub podłożach hodowlanych. Pożywką nazywamy zestaw składników pokarmowych odpowiednio dobranych pod względem ilościowym i jakościowym niezbędnych do hodowli drobnoustrojów. Skład pożywki musi być tak dobrany, by gwarantował optymalne warunki wzrostu i rozwoju badanych mikroorganizmów. W związku z tym, podłoże musi posiadać: odpowiedni zestaw związków chemicznych optymalny odczyn ciśnienie osmotyczne musi być jałowe Istnieje wiele kryteriów podziału pożywek. Najczęściej podstawą podziału jest: skład chemiczny pożywek wymagania pokarmowe drobnoustrojów cel stosowania konsystencja pożywek Ze względu na charakter chemiczny składników wyróżnia się pożywki: naturalne syntetyczne półsyntetyczne W zależności od wymagań pokarmowych drobnoustrojów pożywki dzieli się na: proste złożone Zależnie od celu, jakiemu mają służyć, pożywki dzieli się na: ogólne selektywne (wybiórcze)
Pod względem konsystencji pożywki dzieli się na: płynne półpłynne stałe Krótka charakterystyka poszczególnych typów pożywek Naturalne przygotowywane są z produktów pochodzenia naturalnego np. mleka, bulionu, wyciągów roślinnych lub glebowych. Syntetyczne mają ściśle zdefiniowany skład chemiczny zarówno pod względem ilościowym, jak i jakościowym. Stosowane są między innymi w badaniach diagnostycznych. Półsyntetyczne wykonywane są ze składników naturalnych i syntetycznych związków chemicznych. Proste stosowane dla prototrofów, czyli drobnoustrojów, którym wystarcza w podłożu prosty związek organiczny, wykorzystywany do budowy wszystkich niezbędnych składników komórki. Złożone służą do hodowli auksotrofów tj. drobnoustrojów, które nie są w stanie syntetyzować niektórych składników komórki np. pewnych aminokwasów czy witamin i związki te należy im dostarczać w pożywce. Ogólne - na których rosną różne grupy fizjologiczne drobnoustrojów np. bulion mięsny. Jest to podłoże płynne. Przygotowuje się je z wyciągu z mięsa do którego dodaje się 1-2% peptonu i 0,5% NaCl. Wybiórcze - w celu wyizolowania jednej grupy fizjologicznej mikroorganizmów, oznaczającej się określonymi wymaganiami pokarmowymi np. a. Podłoże wg Martina do hodowli grzybów. Wybiórczość podłoża powodowana jast przez róż bengalski, streptomycynę i niskie ph. b. Podłoże wg Bunta i Roviry z dodatkiem wyciągu glebowego stosowana jest do izolacji i liczenia mikroorganizmów glebowych. Podłoża: płynne powinny być klarowne, a wszystkie składniki muszą być całkowicie rozpuszczone (do 0,5 % agaru). półpłynne zestalone małą ilością substancji żelującej (0,5-1,5 % agaru). stałe zestalone większą ilością substancji żelującej(1,5-2 % agaru, ok 15% żelatyny). Można w próbówkach po sterylizacji zestalić w postaci tzw. słupka lub przez ułożenie przed zastygnięciem w położeniu pochyłym w postaci tzw. skosu agarowego.
Substancje zestalające są to substancje, które pozwalają na zestalenie pożywek. Do Agar jest wysuszoną, hydrofilną, koloidalną substancją wyekstrahowaną z glonów znanych jako agarofity. Składa się on z dwóch polisacharydów - agarozy i agaropektyny w zmiennych proporcjach zależnych od strefy pochodzenia glonów. Temperatura upłynnienia podłoża z agarem wynosi około 100ºC, a temperatura zestalania około 45ºC. Poniżej tej temperatury podłoże z agarem zastyga tworząc trwałą galaretę. Nie stanowi substancji odżywczej tylko czynnik zestalający podłoże. W handlu dostępny jest w postaci włókien lub proszku. najczęściej używanych substancji zestalających należy agar i żelatyna. Agar odżywczy sporządza się z bulionu z dodatkiem 1,5 2% agaru. Żelatyna jest substancją białkową. Otrzymuje się ją w wyniku hydrolizy kolagenu czyli białka występującego w tkance łącznej zwierząt. Temperatura upłynnienia podłoża z żelatyną wynosi około 25ºC, a temperatura zestalania około 20ºC. Wykorzystywana jest przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych. Żelatynę odżywczą sporządza się z bulionu dodając około 15% żelatyny. 2. Naczynia i urządzenia do hodowli drobnoustrojów: płytki Petriego, probówki bakteriologiczne, kolby, pipety, cieplarki, suszarki.
Płytki Petriego są to dwie szklane szalki; górna ma nieco większą średnicę i niższy brzeg niż dolna, wskutek czego szalki zachodzą na siebie i można je swobodnie zamykać i otwierać. Służą do zakładania hodowli, liczenia, badań diagnostycznych i morfologicznych drobnoustrojów. Mają zastosowanie wyłącznie przy użyciu podłoży stałych. Po zestaleniu pożywek agarowych wydziela się z nich woda kondensacyjna, która może rozmyć kolonie wyrosłe na płytkach Petriego, dlatego należy płytki z pożywkami zestalonymi agarem inkubować zawsze odwrócone dnem do góry. Probówki bakteriologiczne bez kołnierzyka o różnych wymiarach. Stosowane do hodowli i przechowywania drobnoustrojów oraz do wykonywania rozcieńczeń np. gleby, mleka. Mają zastosowanie przy użyciu podłoży płynnych i stałych (słupki i skosy). Zamyka się je korkami z waty, tworzywa sztucznego lub gumowego. a). probówka chemiczna, b). probówka mikrobiologiczna a). skos, b). słupek Probówki
Probówki chemiczne - stosowane do analiz chemicznych i biochemicznych w mikrobiologii. Posiadają kołnierzyk ułatwiający przelewanie. W mikrobiologii wykorzystywane są kolby różnego typu i wielkości. Najczęściej są stosowane kolby stożkowe, kuliste lub płaskodenne. Służą do sporządzania pożywek, roztworów oraz do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych. Zamyka się je korkami z waty, lub tworzywa gumowego. Kolby -stożkowa i kulista płaskodenna Pipety (kalibrowane i automatyczne) służą do posiewów hodowli płynnej oraz do przygotowywania rozcieńczeń. Pipety pasterowskie do nanoszenia materiału na szkiełka lub do posiewów wgłębnych w probówkach. Przed wyjałowieniem część ustnikową pipety zatyka się zacikiem, co zabezpiecza materiał pobierany pipetą przed zakażeniem z zewnątrz a szczególnie przed przedostaniem się drobnoustrojów do ust. Pipety automatyczne Szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe służą do przygotowywania preparatów mikroskopowych. Szkiełka Lindnera z wgłębieniem przeznaczone są do obserwacji preparatów przyżyciowych w wiszącej kropli. Szkiełka mikroskopowe a). przedmiotowe b). nakrywkowe
Cieplarki są to mniejsze lub większe szafy z półkami, zaopatrzone w urządzenia ogrzewające i termostatowe odpowiednio izolowane termicznie. Stałość temperatury zapewnia termostat. Służą do hodowli drobnoustrojów na pożywkach płynnych i stałych. Różne gatunki drobnoustrojów wymagają różnych temperatur do prawidłowego wzrostu i rozwoju. Suszarka szafka wyposażona w izolację cieplną oraz grzałki elektryczne i termoregulator, służąca do sterylizacji szkła laboratoryjnego (kolb, probówek, pipet, płytek Petriego) w temp. około 180 O C przez około 3 godziny. Czyste, suche szkło laboratoryjne przygotowuje się do jałowienia owijając je w papier, folię aluminiową lub umieszcza się w specjalnych pojemnikach metalowych (tubusach). W metalowych tubusach muszą być pootwierane otwory aby był zapewniony swobodny obieg powietrza. Cieplarka Uwagi na temat jałowienia w suszarkach Szkło wstawiamy do zimnej suszarki. Po skończeniu sterylizacji nie wyjmujemy szkła od razu. Szkło musi być odpowiednio zapakowane. Nie sterylizujemy podłoży biologicznych. 3. Podstawowe zabiegi stosowane w mikrobiologii: a). sterylizacja pożywek (metoda termiczna, filtracja). Sterylizacja (wyjaławianie) zabieg prowadzący do zabicia lub usunięcia drobnoustrojów. Sterylizacja termiczna polega na zastosowaniu odpowiedniej temperatury. Wyróżniamy sterylizację termiczną:
na sucho (nie stosuje się do jałowienia podłoży) wyżarzanie, opalanie i wyjaławianie w suszarkach. na mokro autoklawowanie, pasteryzacja i tyndalizacja Pożywki najczęściej jałowi się na mokro, w gorącej parze wodnej, w aparatach zwanych autoklawami. Autoklaw jest to kocioł o podwójnych ścianach i podwójnym dnie, zaopatrzony w manometry, termometr oraz zawór bezpieczeństwa i zawór odpowietrzający. W górnej części znajduje się pokrywa mocowana specjalnymi śrubami. Czynnikiem jałowiącym jest przegrzana para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. Sterylizacja odbywa się przy ciśnieniu (1 atmosfery) w temp. 121 O C w ciągu 20 30 minut. Autoklaw jest najczęściej stosowanym aparatem do jałowienia, oprócz pożywek można w nim jałowić sprzęt, który w suszarce przy znacznie wyższej temperaturze może ulec zniszczeniu. Autoklaw Nie wszystkie jednak pożywki można jałowić pod zwiększonym ciśnieniem w autoklawach. Pożywki zwierające cukry, żelatynę, a także roztwory witamin i inne substancje ulegające rozkładowi pod wpływem wysokiej temperatury wyjaławia się w bieżącej parze wodnej w temp. do 100 O C. Proces ten nazywa się pasteryzacją. Aparat Koch jest to kocioł metalowy, znacznie lżejszy od autoklawu, o uproszczonej budowie, przykryty luźną pokrywą. Czynnikiem jałowiącym jest bieżąca para wodna o temp. do 100 O C. Czas sterylizacji nie przekracza zwykle 30 minut. W bieżącej parze wodnej o temp. do 100 O C giną wegetatywne formy drobnoustrojów, natomiast nie zostają zniszczone formy przetrwalne drobnoustrojów odporne na wysoką temperaturę. Dla uzyskania pełnej jałowości materiału stosujemy metodę trzykrotnego ogrzewania w temp.100 O C w ciągu 30 minut co 24 godziny. W między czasie materiał przenosi się do inkubacji w cieplarce w celu umożliwienia wykiełkowania przetrwalników. Zabieg ten nosi nazwę tyndalizacji.
Wyjaławianie przez filtrację metodę tę stosuje się do podłoży płynnych, które pod wpływem temperatury zmieniają właściwości fizyczne bądź chemiczne (surowica, roztwory mocznika i niektórych cukrów). Metoda filtracji polega głównie na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze, którego pory są mniejsze od średnicy drobnoustrojów. Istnieje wiele rodzajów takich filtrów, różniących się materiałem z którego są wykonane oraz konstrukcją np.: Berkefelda wykonany z ziemi okrzemkowej. Chamberlanda z nieglazurowanej porcelany. Seitsa azbestowe. Schotta ze spiekanego szkła membranowe (molekularne) przygotowywane z żelatyny, pergaminu, poliwęglanów, błon zwierzęcych itp. Filtry są przed użyciem sterylizowane wraz z zestawem naczyń, używanych w procesie sączenia. Proces sączenia odbywa się w ten sposób, że filtr łączy się z naczyniem, z którego usuwa się powietrze za pomocą pompy wodnej. Ciśnienie atmosfery przeciska płyn przez ścianki filtrów, a drobnousrtoje większe od porów zostają zatrzymane. b). Sterylizacja szkła bakteriologicznego (metoda termiczna) na sucho wyjaławianie w suszarkach. na mokro autoklawowanie c). Dezynfekcja Metoda chemiczna polega na stosowaniu związków chemicznych do zabijania drobnoustrojów (dezynfekcja). Do dezynfekcji stosuje się zasady (węglan sodu), kwasy (kwas siarkowy), środki utleniające (chloramina, chlor), sole metali ciężkich (sublimat chlorek rtęci), alkohole (etylowy), formalinę, krezol, i amonowe zasady czwartorzędowe itd. d). Posiew materiału mikrobiologicznego ezą i pipetą (jałowienie ez i igieł) Posiew wprowadzenie badanego materiału (np. zawiesiny drobnoustrojów, zawiesiny wodnej gleby, cząsteczek gleby) na podłoże hodowlane lub do pożywki. Przesiew przeniesienie drobnoustrojów z podłoża na podłoże. Pobieranie materiału wykonuje się za pomocą ezy, pipety itp.
Eza oczko wykonane ze specjalnego rodzaju drutu i osadzone w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów, przesiewów i sporządzania preparatów mikroskopowych. Igła prosty drucik w oprawce metalowej, służy do wykonywania posiewów wgłębnych i sporządzania preparatów mykologicznych (grzybowych). a) igła, b) eza W zależności od konsystencji materiału posiewnego i podłoża, które należy zaszczepić, dobiera się odpowiedni sposób przeszczepiania wg. poniższego schematu Z pożywki płynnej - na pożywkę płynną (pipetą, ezą) Z pożywki płynnej - na skos (pipetą, ezą) Z pożywki płynnej - na płytkę (*metoda powierzchniowa - pipetą, ezą, **metoda wgłębna - pipetą) Z pożywki stałej - na pożywkę płynną (ezą) Z pożywki stałej - na skos (ezą) Z pożywki stałej - na płytkę (ezą) *Metoda powierzchniowa niewielką ilość rozcieńczonego materiału nanosi się pipetą na zestaloną pożywkę i rozprowadza szklaną głaszczką po całej powierzchni. **Metoda wgłębna rozcieńczony materiał badany wprowadza się do płytki Petriego, a następnie zalewa płynnym, wystudzonym (ok. 50 o C) podłożem. Całość miesza się ruchami kolistymi i pozostawia do zastygnięcia. Wyżarzanie to sterylizacja przez rozgrzanie do czerwoności w płomieniu palnika, a następnie 3 krotne przesunięcie w płomieniu palnika oprawki wyżarzanego narzędzia ezy lub igły. Opalanie polega na krótkotrwałym kontakcie płomienia np. z brzegami naczyń zawierających pożywki, wlotami probówek. Głaszczkę opala się zanurzając w alkoholu i zapalając w płomieniu palnika.
Przeszczepianie etapy w przypadku hodowli płynnej dokładnie mieszamy materiał wyżarzamy ezę lub opalamy pipetę trzymając ją w jednej ręce probówkę z badanym materiałem bierzemy w drugą rękę otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę) opalamy wlot probówki (probówki podczas przeszczepiania trzymamy możliwie jak najbardziej przechyloną, co zapobiega zakażeniu hodowli z powietrza) studzimy ezę o wewnętrzną ściankę probówki a następnie pobieramy materiał opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu bierzemy probówkę z pożywką które będziemy szczepili otwieramy probówkę biorąc korek pomiędzy 5 palec ręki trzymającej ezę (pipetę) opalamy wlot probówki wprowadzamy ezę (pipetę) do probówki szczepimy opłukując ezę pożywce (w przypadku skosu rysujemy wężyk na powierzchni podłoża zaczynając od dołu ku górze), natomiast z pipety pozwalamy swobodnie wypłynąć materiałowi (nie wydmuchujemy!) opalamy ponownie wlot probówki, zamykamy korkiem i odstawiamy do statywu wyżarzamy ezę i odstawiamy do statywu; pipetę odkładamy do pojemnika ze środkiem dezynfekyjącym Celem posiewu może być: Odświeżenie hodowli drobnoustrojów w celu utrzymania ich żywotności i aktywności. Izolacja czystych kultur z badanego materiału. Diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do gatunku, rodzaju lub określonej grupy drobnoustrojów. Posiewy diagnostyczne służą do badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych. Po wykonaniu posiewu, płytki umieszcza się w cieplarkach i inkubuje w optymalnej temperaturze (np. 28 o C) przez określony czas dostosowany do wymagań drobnoustrojów. Część praktyczna Ćwiczenie wysiewu ezą i pipetą płynów doświadczalnych (woda z barwnikiem i bez barwnika). Posiew redukcyjny demonstracja. Posiew redukcyjny zmniejsza liczbę drobnoustrojów wysiewanych na jednostkę powierzchni podłoża zestalonego i ma na celu uzyskanie kolonii z jednej komórki macierzystej (czysta kultura). Kolonią nazywamy zespół komórek widoczny gołym okiem powstały z jednej komórki macierzystej. Spośród kolonii rosnących na płytce wybieramy jedną do posiewu redukcyjnego. Pobierany jałowo materiał rozprowadzamy ezą na powierzchni płytki z podłożem agarowym gęstymi
zygzakowatymi ruchami, rozcieramy materiał na 1/2 powierzchni płytki, obracamy płytką o 90 o i znów ruchami zygzakowatymi, zahaczając o posianą poprzednio powierzchnię rozcieramy na 1/2 powierzchni płytki, czynność jeszcze raz powtarzamy. Część praktyczna Należy obejrzeć płytkę z wykonanym posiewem redukcyjnym bakterii - wykonać i opisać rysunek.