Temat 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja

Transkrypt

1 Temat 4-5: Sterylizacja i dezynfekcja Literatura: Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, Rozdział 5: Sterylizacja (wyjaławianie) i jej metody (str ) Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: rozumieć różnicę między sterylizacją a dezynfekcją; znać podstawowe metody wyjaławiania oraz ich wady i zalety, ze szczególnym uwzględnieniem sterylizacji parą wodną pod ciśnieniem (autoklaw); znać podstawowe grupy chemicznych środków dezynfekcyjnych z podaniem ich krótkiej charakterystyki; wiedzieć, od jakich czynników i jak zależy działanie środków dezynfekcyjnych; wiedzieć, co to jest współczynnik fenolowy, jak się go określa i od czego zależy jego wartość; znać czynniki wpływające na działanie promieniowania UV; wiedzieć, jak można sprawdzić skuteczność sterylizacji; znać pojęcia: środek bakteriobójczy, środek bakteriostatyczny, współczynnik temperatury, forma wegetatywna, formy przetrwalne drobnoustrojów; umieć określić współczynnik fenolowy danego związku (substancji). 1. Sterylizacja Sterylizacja, czyli wyjaławianie, jest to niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów, zarówno ich form wegetatywnych (wykazujących aktywność życiową: odżywiających się, oddychających, rozmnażających się itp.) jak i przetrwalnych (endospory laseczek, zarodniki grzybów). Efekt taki można uzyskać poprzez zastosowanie czynników fizycznych, takich jak temperatura i promieniowanie oraz przez filtrację. Sterylizacja parą wodną pod ciśnieniem Metodą tą uzyskuje się najlepsze efekty jałowienia. Prowadzi ona do usunięcia form wegetatywnych i przetrwalnych wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w sterylizowanych materiałach. Proces ten można przeprowadzać w szybkowarach i autoklawach. Najszersze zastosowanie ma autoklaw. Para wodna zasilająca to urządzenie może przechodzić z zewnętrznego źródła i wówczas przed wprowadzeniem do autoklawu wmontowany jest reduktor ciśnienia. Większość autoklawów posiada własne wytwornice pary wmontowane do aparatu. Autoklaw jest to dwuścienny kocioł z grubej blachy, zamykany szczelnie ciężką pokrywą. Zaopatrzony jest w manometr, termometr i zawór bezpieczeństwa. Zwykle wodę podgrzewa się za pomocą grzejnika elektrycznego. Wytworzona para wodna wypycha powietrze przez otwarty wypust. Następnie urządzenie zamyka się i para wytwarza w kotle ciśnienie wyższe od atmosferycznego. Dzięki temu podnosi się temperatura. Zwiększenie ciśnienia o 0,5 atmosfery powoduje ogrzanie pary wodnej do 111,7 0 C, a zwiększenie o 1 atmosferę do 121,6 0 C. W takich warunkach giną nawet formy przetrwalne drobnoustrojów. Najczęściej do sterylizacji podłoży bakteriologicznych stosuje się temperaturę C przez 20 minut. Nie jest to pełny cykl pracy urządzenia, bo należy także doliczyć czas usuwania powietrza, wprowadzania pary oraz czas schładzania, co razem zajmuje około 100 minut. Materiały, do których para wodna ma utrudniony dostęp wymagają zwiększenia ciśnienia pary wodnej lub wydłużenia czasu efektywnej pracy autoklawu.

2 Dekoktacja Jest to wyjaławianie w gorącej parze bieżącej o temp C. Proces ten prowadzi się w aparacie Kocha. Urządzenie to ma budowę kotła z pokrywą. Wyposażone jest w grzałkę do podgrzewania wody wypełniającej dno kotła. Nad wodą znajduje się metalowa siatka, na której ustawia się przedmioty i podłoża przeznaczone do jałowienia. Następnie kocioł nakrywa się. Para wydzielająca się podczas podgrzewania wody usuwa powietrze z kotła i przy ciśnieniu równym atmosferycznemu, przepływa przez aparat. Dekoktację prowadzi się przez minut. W takich warunkach nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów i wirusy zapalenia wątroby typu B. Metoda ta służy do wyjaławiania pożywek i przedmiotów termowrażliwych. Tyndalizacja Zabieg ten polega na trzykrotnym ogrzaniu materiałów w bieżącej parze wodnej przez 30 minut w odstępach 24 godzinnych. W takich warunkach przy pierwszym ogrzaniu giną jedynie formy wegetatywne drobnoustrojów. W okresach 24 godzinnych pomiędzy poszczególnymi ogrzewaniami, próby inkubuje się w termostacie w temp. pokojowej. Kiełkują wówczas formy przetrwane drobnoustrojów. Powstałe z nich formy wegetatywne ulegają zniszczeniu w czasie następnego ogrzania. Dla pewności, że wszystkie przetrwalniki miały szansę wykiełkowania, po następnej 24 godzinnej przerwie przeprowadza się trzecie ogrzanie próby. Pasteryzacja Proces ten pozwala na częściowe wyjałowienie materiału i polega na jednorazowym podgrzaniu płynu do temp C przez 30 min. W warunkach przemysłowych stosuje się temp. wyższe ( C), krótszy czas pasteryzacji (sekundy) oraz szybkie schładzanie, w celu maksymalnego ograniczenia rozpadu składników odżywczych (witamin) zawartych w wyjaławianych produktach oraz uniknięcia zmian smaku i zapachu. Pasteryzuje się m.in. mleko, soki owocowe i warzywne, moszcz winny i piwo. Zabieg ten niszczy większość bakterii i innych drobnoustrojów (pierwotniaki, grzyby, glony, wirusy). Natomiast nie giną formy przetrwalne bakterii, zarodniki grzybów oraz wirusy zapalenia wątroby typu B. Tych ostatnich nie usuwa także gotowanie. Gorące powietrze Metoda ta służy do sterylizacji przedmiotów opornych na działanie wysokiej temperatury. Wyjaławianie przeprowadza się w zakresie temperatur od C. Służą do tego celu urządzenia zwane sterylizatorami lub suszarkami. Przedmioty poddawane sterylizacji muszą być opakowane w celu ich ochrony przed wtórnym zanieczyszczeniem mikrobiologicznym po zakończeniu sterylizacji. W praktyce najczęściej używa się do tego celu papieru lub specjalnych metalowych tubusów. Czas pracy suszarki zależy od zastosowanej temperatury, stopnia wypełnienia suszarki, czasu jej nagrzewania i oziębiania. W sterylizatorach wyposażonych w wentylatory przeciętny czas ekspozycji wsadu w temp C wynosi 60 minut, a czas cyklu pracy ok. 150 minut, natomiast w temp C czas ekspozycji wynosi 30 min. W sterylizatorach starego typu, tzw. suszarkach, nie mających wymuszonego obiegu powietrza, czas sterylizacji jest dłuższy. W C czas ekspozycji wsadu wynosi min. a pełny cykl pracy aparatu trwa kilka godzin. Wyjaławianie przez spalanie i opalanie. Spalanie służy do niszczenia materiałów i przedmiotów zakażonych drobnoustrojami chorobotwórczymi. Spala się np. plastikowe płytki Petriego z hodowlą zakaźnych mikroorganizmów zwłoki zwierząt doświadczalnych. Opalanie nad płomieniem palnika stosuje

3 się jako jałowienie drobnych przedmiotów nie ulegających spaleniu, takich jak ezy, druciki platynowe, igły preparacyjne, łopatki, skalpele. Ponadto opala się zawsze brzegi kolb i probówek, w celu zabezpieczenia hodowli przed zakażeniem z zewnątrz. Sterylizacja za pomocą radiacji Do wyjaławiania stosuje się dwa typy promieniowania jonizującego: beta i gamma. Promieniowanie gamma charakteryzuje się dużą przenikliwością, natomiast promieniowanie beta jest promieniowaniem elektronowym o dużej energii. Skuteczna dawka promieniowania gamma waha się w zakresie 0,1 1 megarada. Przy stosowaniu tego typu wyjaławiania należy zwrócić uwagę na właściwy dobór dawki. Zbyt mała dawka może spowodować, że wśród komórek bakterii, które przeżyły wyjaławianie, pojawią się mutanty o zmienionych właściwościach biologicznych. Niektóre z tych cech mogą okazać się niebezpieczne np. podwyższenie zjadliwości (zdolności wywoływania choroby). Praktycznie stosowana dawka sterylizująca jest duża i wynosi 2,5 3,0 megaradów. Należy także zwrócić uwagę na fakt, że promieniowanie jonizujące może powodować zmiany struktury związków chemicznych lub ich rozpad, co wiąże się ze zmianą cech chemicznych oraz odmiennym oddziaływaniem na drobnoustroje. Ponadto w wyniku napromieniowania związków organicznych powstają często nadtlenki, związki o podwójnych wiązaniach i wolne rodniki. Prowadzić to może do powstania produktów wykazujących działanie mutagenne i rakotwórcze. Wyjaławianie przez filtrację Proces ten polega na mechanicznym zatrzymaniu drobnoustrojów na filtrze. Działa on na zasadzie sita i w związku z tym średnica porów filtra musi być mniejsza od średnicy komórek oraz form przetrwalnych. Dodatkowo, część mikroorganizmów zatrzymywana jest przez siły adsorpcyjne na powierzchni filtra. Wyjaławianie tego typu stosowane jest do płynów, których składniki charakteryzują się dużą wrażliwością na działanie czynników fizycznych. Metoda ta pozwala na usunięcie nie tylko żywych komórek, form przetrwalnych, ale także komórek martwych oraz ich części. Do najczęściej stosowanych filtrów należą: filtry z ziemi okrzemkowej, spiekanego szkła oraz filtry membranowe. Posiadają one zbyt małe pory, aby filtrację można było przeprowadzić z wykorzystaniem siły ciężkości. Konieczne jest więc zastosowanie nadciśnienia lub podciśnienia. Uzyskuje się je za pomocą pompy próżniowej. Filtr z ziemi okrzemkowej Znane są m. in. filtry Berkefelda. Zwykle są to świece otrzymane poprzez spiekanie w temp o C ziemi okrzemkowej. Charakteryzują się one dużą sprawnością działania. Skutecznie usuwają z filtrowanych roztworów formy wegetatywne i przetrwalne, jednakże nie zatrzymują wirusów. Wadą tych urządzeń jest też zbyt duża kruchość, wypłukiwanie ich cząstek do filtratu. Ponadto, część sączonego płynu pochłaniana jest przez filtr. W mikrobiologii stosowane są filtry o najdrobniejszych porach, o symbolu W. Świece sterylizuje się w autoklawie. Podczas filtracji sączony płyn nalewa się tak, aby świeca była w nim całkowicie zanurzona. Filtry ze szkła spiekanego Najpopularniejsze w tej grupie są filtry Schotta. Powstają one poprzez stopienie w odpowiedniej temperaturze sproszkowanego szkła. Są to lejki z warstwą filtracyjną na dnie. Do wyjaławiania roztworów stosowane są tylko filtry nr 5, o najmniejszej średnicy porów. Filtry ze szkła spiekanego charakteryzują się dużą sprawnością działania oraz brakiem efektów ubocznych w postaci adsorpcji sączonych płynów, wymywania składników filtrów oraz zmiany

4 ph przesączu. Ponadto mogą być one jałowione termicznie. Filtry tego typu zatrzymują wszystkie formy drobnoustrojów oprócz wirusów. Filtry membranowe Filtry (sączki) membranowe zbudowane są z pochodnych celulozy (np. z nitrocelulozy). Są to cienkie błony o grubości μm. Wielkość porów w filtrach jest zróżnicowana. Odpowiedni dobór sączka pozwala na całkowite usunięcie z roztworów drobnoustrojów. Filtry produkowane są w postaci krążków o różnych średnicach. Jałowi się je przez gotowanie w wodzie destylowanej. Następnie umieszcza w odpowiednich jałowych aparatach filtracyjnych. Sączenie odbywa się w podciśnieniu lub nadciśnieniu w zależności od konstrukcji aparatu. Sączony płyn nie ulega żadnym zmianom odczynu, nie jest adsorbowany przez filtr oraz do przesączu nie są uwalniane składniki filtra. Filtry membranowe są stosowane nie tylko do sterylizacji płynów, ale także w badaniu stanu sanitarnego wody, gdzie celem nie jest oczyszczenie z mikroorganizmów, lecz wydzielenie ich z wody i dalsza hodowla na specjalnych pożywkach. 2. Dezynfekcja Dezynfekcją nazywamy proces niszczenia wegetatywnych form drobnoustrojów za pomocą czynników chemicznych i fizycznych. Dezynfekcja nie niszczy wszystkich form przetrwanych. Celem dezynfekcji jest możliwie szybkie zabicie drobnoustrojów, ale głównym jej zadaniem jest wyeliminowanie mikroorganizmów chorobotwórczych z powierzchni sprzętów, podłóg, naczyń, pojemników z płynami, z części ciała ludzkiego (ręce, pole operacyjne), z ciała zwierząt.. A zatem dotyczy ona tych obiektów, które należy odkazić, nie mogąc poddać ich sterylizacji. Mechanizm działania środków dezynfekcyjnych jest tak różny jak różna jest budowa chemiczna dezynfektantów. Środki dezynfekcyjne powodują bardzo istotne, nieodwracalne zmiany zarówno struktury jak i metabolizmu komórki bakteryjnej. Zmiany te mogą mieć charakter okresowego hamowania rozwoju drobnoustrojów, bądź ich całkowitego wyeliminowania. W związku z tym, środki dezynfekcyjne można podzielić na dwie grupy: a) środki bakteriostatyczne mające właściwości hamowania rozmnażania bakterii (po ich usunięciu bakterie jednak ponownie zaczynają się rozmnażać); b) środki bakteriobójcze, posiadające właściwości zabijania bakterii, a więc ich działanie jest nieodwracalne. Działanie dezynfektantów zależy od wielu czynników, do których należą : a) stężenie środka dezynfekcyjnego, b) czas działania, c) temperatura, d) obecność substancji organicznych w środowisku, e) wilgotność środowiska, f) odczyn środowiska, Ad a) Na szybkość procesu dezynfekcji ma wpływ stężenie środka dezynfekcyjnego. Im stężenie jest wyższe, tym proces przebiega szybciej. Nie jest to jednak zależność proporcjonalna, np. podwojenie stężenia fenolu skraca czas wymagany do zabicia wszystkich osobników w hodowli Salmonella paratyphi w przybliżeniu siedmiokrotnie.

5 Ad b) W celu wyznaczenia zakresu działania środka dezynfekcyjnego oznacza się przeżywalność drobnoustrojów jako funkcję czasu działania badanego dezynfektanta w określonym stężeniu i przy określonej gęstości badanej hodowli. Ad c) Wpływ temperatury na skuteczność procesu dezynfekcji wyraża się za pomocą tzw. współczynnika temperatury, według wzoru: Czas wymierania w temp. x Wsp. temp = Czas wymierania w temp. x + 10 Wartości współczynnika są tym wyższe im wyższa jest temperatura, w której przebiega proces. Ad. d ) Charakter wpływu obecności związków organicznych może być chemiczny bądź fizyczny, przy czym mogą zachodzić różnego rodzaju reakcje: 1. Środek dezynfekcyjny reaguje ze związkami organicznymi, co powoduje jego unieczynnienie. W sytuacji, gdy związki organiczne są konkurencyjne w stosunku do drobnoustrojów, w reakcjach może dojść do całkowitego związania dezynfektanta i pozbawienia go skuteczności np. chlor stosowany do dezynfekcji wody jest wiązany przez zanieczyszczające ją związki organiczne tak, że efektywne stężenie dezynfektanta jest znacznie niższe od zastosowanego. 2. Środek dezynfekcyjny może dawać, w wyniku reakcji ze związkami organicznymi związek nierozpuszczalny, czego skutkiem jest jego wypadanie z roztworu i wyeliminowanie ze środowiska. 3. Eliminacja środka dezynfekcyjnego ze środowiska może być wynikiem jego adsorpcji przez mające postać zawiesiny lub koloidu substancje organiczne. 4. Tłuszcze, fosfolipidy, niektóre kationy i aniony mogą unieczynniać środek dezynfekcyjny poprzez jego eliminację ze środowiska 5. Związki organiczne mogą tworzyć wokół komórki bakteryjnej warstwę o mniejszej zawartości wody utrudniając dostęp środowiska dezynfekcyjnego do komórki. Ad e) Duże znaczenie dla skuteczności dezynfekcji ma wilgotność środowiska, gdyż większość środków dezynfekcyjnych nie działa w środowisku suchym. Odpowiednia wilgotność umożliwia prawidłową kondensację czynnika dezynfekcyjnego na powierzchni komórek i wnikanie w głąb. Ad f) Stężenie jonów wodorowych wpływa nie tylko bezpośrednio na organizm bakteryjny, lecz również na same środki odkażające, bowiem dla wielu substancji dezynfekcyjnych charakterystyczna jest mniejsza aktywność form zjonizowanych niż niezdysocjowanych, np. fenol w środowisku alkalicznym jest zdysocjowany, co poważnie obniża jego właściwości bakteriobójcze. Istotnym problemem jest powstawanie drobnoustrojów opornych na środki dezynfekcyjne. Główną tego przyczyną jest stosowanie środków w stężeniach subtelnych. Przyczyną oporności może być adaptacja enzymatyczna. Enzymy indukcyjne biorące udział w rozkładzie środka dezynfekcyjnego powstają w komórce dopiero po zetknięciu się z odpowiednim związkiem lub jego analogiem. W okresie adaptacji wzrost bakterii ustaje, część bakterii zamiera, natomiast te, które przeżyły mają zdolność do enzymatycznego rozkładu (biodegradacji) dezynfektanta. Poddając dostatecznie dużą populację bakterii działaniu czynnika szkodliwego, jakim są środki dezynfekcyjne, wśród przeżywających komórek znajdujemy mutanty charakteryzujące się zwiększoną opornością na stosowany czynnik, w stosunku do komórki macierzystej.

6 Do najczęściej stosowanych chemicznych środków dezynfekcyjnych zaliczamy: 1) Kwasy i zasady silne środki dezynfekcyjne zabijają formy wegetatywne oraz formy przetrwalne. Stosowanie ich jest jednak ograniczone ze względu na niszczące działanie na przedmioty i materiały. Zastosowanie znalazły : a) mleko wapienne w postaci 20% zawiesiny wodorotlenku wapnia, b) 10% roztwory zasad do dezynfekcji powierzchniowej, c) 1-10% gorące roztwory węglanu sodu do dezynfekcji szkła laboratoryjnego, d) mydła, zwłaszcza bardziej alkaliczne mydło szare, których skuteczność zwiększają nienasycone kwasy tłuszczowe, 2) Środki utleniające Do grupy tej należą chlorowce i ich pochodne. Mechanizm ich działania polega na wydzielaniu zjonizowanego chlorowca lub tlenu po zetknięciu się z komórką. Są to: a) podchloryny zawierające około 20% czynnego chloru, b) chloraminy nieorganiczne oraz organiczne jak np. chloramina T zawierająca 12, 5% czynnego chloru, chloramina T zawierająca 29,5% czynnego chloru. Są to związki dobrze rozpuszczalne w wodzie, mało wrażliwe na światło, trwałe w temp. pokojowej, których działanie bakteriobójcze jest najsilniejsze przy ph 6-6,2. Do dezynfekcji rąk np. stosuje się 0,6 1% roztwory chloramin. Do odkażania powierzchni podłóg i stołów 5% roztwór. Do odkażania wody wystarczy 1mg/ dm 3. c) odpowiednie roztwory nadmanganianu potasu, d) 3% woda utleniona, e) 10% roztwór jodu (jodyna) lub połączenia organiczne jodu. Związki tego typu niszczą wirusy, bakterie i pierwotniaki, f) ozon działający bakterio- i wirusobójczo, stosowany do dezynfekcji wody. 3) Sole metali ciężkich Działają one zabójczo na drobnoustroje, zwłaszcza przy dłuższym czasie działania i przy zastosowaniu wyższych stężeń. W niższych stężeniach działanie niektórych metali ma charakter bakteriostatyczny. Ponieważ metale ciężkie są toksyczne dla organizmów wyższych, ich stosowanie jako dezynfektantów jest ograniczone. Pewne zastosowania znajdują związki organiczne rtęci jak merkurochrom, a także sole srebra. 4) Alkohole Mechanizm ich działania polega na denaturacji białek komórkowych, przy czym wpływ ma tu obecność wody, dlatego lepiej działają % roztwory alkoholu niż 90%. Jako środek dezynfekcyjny używany jest: a) alkohol etylowy w stęż. 70% do odkażania skóry i w mieszaninie z innymi związkami do dezynfekcji narzędzi chirurgicznych, b) 70% mieszanina złożona w 50 % z etanolu i 20% propanolu, c) alkohol izopropylowy, benzylowy oraz glikol stosowane do dezynfekcji powietrza. 5) Związki fenolowe i pochodne fenolu Fenole i ich pochodne mają działanie bakteriobójcze. Fenole niszczą bakterie, ale i grzyby. Największą aktywność dezynfekcyjną mają w środowisku kwaśnym. Fenol jest związkiem toksycznym i drażniącym, z tego względu nie jest obecnie stosowany do dezynfekcji. Zastosowanie znajduje natomiast szereg związków fenolu.

7 a) mieszanina związków fenolowych i szarego mydła zwana lizolem stosowana w 3-10% roztworze b) alkilowe pochodne fenoli o działaniu dezynfekcyjnym, tym silniejszym im dłuższy jest łańcuch alkilowy c) izomery drugo- i trzeciorzędowe, chlorofenole oraz arylofenole d) cały szereg preparatów handlowych zawierających chloroheksydyny. Chloroheksydyna działa na bakterie gramdodatnie i gramujemne, drożdżaki i wirusy. 6) Czwartorzędowe związki amoniowe Są to związki działające na wirusy, bakterie, drożdże i grzyby. Związki te charakteryzują się wysoką aktywnością powierzchniową. W wodzie ulegają dysocjacji na kompleksowe kationy i ujemnie naładowany jon chlorowca, który wzmaga aktywność bakteriobójcza. W użyciu znajduje się cały szereg preparatów zawierających różne stężenia związków amoniowych (np.sterinol) 7) Aldehydy W praktyce stosuje się aldehyd glutarowy i formaldehyd. Formaldehyd stosowany jest w 5% roztworze. Ma silne działanie bakteriobójcze pod warunkiem, że temperatura środowiska będzie niższa niż 40 0 C. Roztworem 40 % posługują się laboratoria i prosektoria. Materiały biologiczne utrwala się roztworem formaldehydu. Ponadto może on służyć do gazowej dezynfekcji pomieszczeń w stężeniu 1-2 mg/ dm 3 powietrza. Dla skuteczności dezynfekcji powietrza formaldehydem konieczna jest duża wilgotność sięgająca 80% Do fizycznych czynników dezynfekcji należy promieniowanie UV, które stosuje się głównie do dezynfekcji powietrza i dostępnych powierzchni. Silne działanie przeciwbakteryjne wykazuje promieniowanie o długości fali nm (szczególnie nm). Jednakże poszczególne gatunki i formy drobnoustrojów wykazują różną wrażliwość na działanie tego promieniowania. Metoda dezynfekcji powietrza promieniami nadfioletowymi jest skuteczna przy zachowaniu odpowiednich warunków i zależy od szeregu czynników: a) stopnia zanieczyszczenia powietrza cząstkami mechanicznymi, b) objętości napromieniowanego powietrza, c) intensywności ruchu powietrza, d) długości fal emitowanych przez promiennik, e) czasu napromieniowania, f) bezpośredniego padania promieniowania, g) wilgotności powietrza, h) odległości, na jaką działają promienie. Stosując odpowiednią dawkę promieniowania UV można uzyskać nawet efekt całkowitego wyjałowienia (sterylizacji).

8 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Zadanie 1. Badanie skuteczności działania promieniowania ultrafioletowego na drobnoustroje obecne w powietrzu Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu przed włączeniem lampy UV: 1. Położyć dwie szalki Petriego z agarem odżywczym i dwie z podłożem Sabourauda w pobliżu wyłączonej lampy UV i zdjąć wieczka na 10 minut. 2. Po 10 min. nałożyć wieczka i usunąć szalki, a na ich miejsce położyć nowe. Badanie obecności bakterii i grzybów w powietrzu po włączeniu lampy UV: 3. Włączyć lampę UV na przynajmniej 30 minut. Uwaga: nie przebywać w strefie działania promieni UV! 4. Po 30 minutach wyłączyć lampę i otworzyć szalki Petriego na 10 minut. 5. Po 10 minutach zamknąć szalki. 6. Opisać użyte szalki Petriego odpowiednio: przed UV i po UV i wszystkie inkubować w temp. pokojowej przez tydzień. Po okresie inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na płytkach z agarem odżywczym i podłożem Sabourauda przed i po działaniu promieniowania UV. Postaraj się odróżnić kolonie bakteryjne (zwykle wypukłe i kolorowe, lub płaskie i matowe) od grzybowych (zwykle nitkowate, watowate ). Oceń skuteczność działania promieniowania UV i wyjaśnij, od jakich czynników ona zależy. Które drobnoustroje są bardziej wrażliwe: bakterie czy grzyby? Zadanie 2. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji parą wodną w autoklawie. Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali A). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji parą wodną pod zwiększonym ciśnieniem. 1. Z opakowań wyjąć torebki papierowe z krążkami Sporal A i umieścić w różnych miejscach komory autoklawu lub wewnątrz sterylizowanych materiałów. 2. Włączyć autoklaw (osoby posiadające uprawnienia do obsługi) i dokonać sterylizacji w ciągu 20 minut w temperaturze nie mniejszej niż C. 3. Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do probówki z bulionem (użyć sterylnej pęsety). 4. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni 5. W przypadku nieskutecznej sterylizacji w bulionie wystąpi zmętnienie, a na powierzchni podłoża pojawi się kożuch z komórek bakterii. Jeżeli sterylizacja była skuteczna bulion pozostanie klarowny.

9 Zadanie 3. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji w suchym gorącym powietrzu. Oceny dokonuje się za pomocą specjalnych krążków nasyconych zawiesiną zarodników określonego szczepu laseczek z rodzaju Bacillus (tzw. sporali S). Zarodniki te zdolne są do przejścia w formę wegetatywną. Ponadto posiadają ściśle oznaczoną i powtarzalną charakterystykę przeżywania w warunkach sterylizacji w suchym i gorącym powietrzu. 1. Wyjąć z opakowania foliowego torebki papierowe z krążkami sporalu S 2. Sterylizować co najmniej 2 godziny w temp. 160 o C Po zakończeniu sterylizacji przenieść krążki, z zachowaniem warunków jałowości, do probówki z bulionem 3. Inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 7 dni 4. W przypadku nieskutecznej sterylizacji, w bulionie wystąpi zmętnienie i pojawi się kożuch na powierzchni pożywki. Jeżeli sterylizacja była skuteczna, bulion pozostanie klarowny. Zadanie 4. Badanie skuteczności działania wybranych środków dezynfekcyjnych 1. Podzielić pisakiem do szkła denko szalki Petriego z agarem odżywczym na 5 sektorów i opisać je następująco: K, -OH, H2O2, NaCl, M, co oznacza odpowiednio: kontrolę palec nie dezynfekowany, dezynfekcję alkoholem, wodą utlenioną, przetarcie roztworem soli fizjologicznej i mycie mydłem. Na wieczku szalki napisać swoje inicjały, datę i godzinę. 2. Uchylić wieczko szalki i delikatnie przyłożyć opuszkę jednego z palców do powierzchni agaru w sektorze kontrolnym K. Szybko zamknąć szalkę. 3. Sterylną pęsetą pobrać sterylną watę, namoczyć ją w alkoholu uważając, aby nie była zbyt nasiąknięta, a następnie przetrzeć nią opuszkę innego palca. 4. Przetarty palec przyłożyć do sektora OH jak w pkt. 2. Zużytą watę wyrzucić. 5. W podobny sposób przetrzeć palce: wodą utlenioną i roztworem soli, oraz wykonać odciski w odpowiednich sektorach (za każdym razem użyć inny palec). 6. Wymyć ręce mydłem i wytrzeć ręcznikiem, a następnie nieużywany dotąd palec przyłożyć do sektora M. 7. Szalkę inkubować w temp. pokojowej przez tydzień. Po okresie inkubacji porównać wzrost w poszczególnych sektorach, uwzględniając liczbę kolonii i ich zróżnicowanie morfologiczne, a nie powierzchnię wzrostu (dlaczego?). O czym świadczą stwierdzone różnice? Czy mycie mydłem radykalnie usunęło drobnoustroje z powierzchni palca? Jeśli nie, to jakie znaczenie higieniczne ma mycie rąk?

10 Zadanie 5. Oznaczenie współczynnika fenolowego Współczynnik fenolowy pozwala na określenie siły działania środka dezynfekcyjnego w porównaniu do bakteriobójczego działania fenolu w tych samych warunkach. 1. Wykonać rozcieńczenia fenolu i rozlać po 5 ml do sterylnych probówek. Równolegle ustawić taką samą ilość opisanych probówek z podłożem bulionowym. 2. Przygotować rozcieńczenia wybranych środków dezynfekcyjnych i rozlać po 5ml do sterylnych probówek Równolegle ustawić taką samą ilość opisanych probówek z podłożem bulionowym 3. W odstępach co 30 sek. zaszczepiać kolejne rozcieńczenia fenolu inoculum (E. coli) o objętości 0,5 ml i wymieszać na wstrząsarce. 4. Po 15 minutach inkubacji (czas kontaktu ze związkiem) przenosić ezą co 30 sek. materiał z zaszczepionych rozcieńczeń do probówek z bulionem odżywczym. 5. Postąpić analogicznie jak w pkt. 3 i 4 z wybranymi związkami dezynfekcyjnymi 6. Wszystkie zaszczepione podłoża bulionowe inkubować 48 godzin w 37 o C. 7. Wyniki zestawić w tabeli określając wzrost obserwowany jako zmętnienie bulionu znakiem + i brak wzrostu znakiem 8. Wyznaczyć współczynnik fenolowy ( WF ) Największe rozcieńczenie badanego związku zabijające bakterie WF = Największe rozcieńczenie fenolu zabijające bakterie Zadanie 6. Zapoznanie się z podstawowym sprzętem służącym do sterylizacji a. autoklaw b. suszarka